双链DNA检测-PPT-教案
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免疫检验实验抗dsDNA抗体检测实验目的掌握:ELISA间接法原理、方法 及结果判定熟悉:抗dsDNA抗体的临床意义实验原理 ELISA间接法,若被检样品中有ds-DNA抗体,先与板条中包被的ds-DNA抗原结合,形成Ag-Ab复合物,再与酶标抗体形成Ag-Ab-二抗复合物,加入底物出现蓝色(TMB)。间接法测抗体间接法测抗体-E EE EE EE EE EE EE EE EE E+实验材料n外周血、吸管、离心管、微量加样器、抗ds-DNA抗体检测试剂盒、吸水纸、温箱、湿盒上一页返回下一页酶联试剂阳性对照酶标记物显色液A终止液反应板显色液B浓缩洗涤液加样枪与吸头阴性对照ELISAELISA试剂盒试剂盒方 法1.静脉采血,离心3000r/min,10min取上清。试验前20min从冰箱中拿出试剂盒,平衡至室温。2.浓缩洗涤液1:40比例稀释,摇匀备用。3.滴加100l标本稀释液于各标本孔中,取5l标本血清加入反应孔中临界孔(2孔)、阳性对照孔(1孔)各加50l于孔中。a、b、c、d为待测血清(每人做2孔)4.反应板震荡混匀(30s)37温浴20min abcd临界孔临界孔阳阳 阴阴5.洗板5次(洗涤液注孔2/3体积),每次注入洗涤液后停留1min,最后一次拍干6.每孔加入酶标二抗50l,37温浴20min,洗板5次7.加入底物液A(50l)B(30l),37温浴10min8.取出,加50l终止液,混匀,酶标仪测OD值结 果n在450nm波长处读取OD值n标本孔OD值临界孔OD值 阳性 临界孔OD值 阴性操作的标准化操作的标准化试剂及标本的准备试剂及标本的准备 加样加样 保温保温 洗涤洗涤 显色显色 比色比色(一)试剂准备n1.试剂盒在使用前从4冰箱中取出,放置在室温下20-30分钟后再用,使其与室温平衡。n2.洗涤液稀释时保证蒸馏水或去离子水的质量。1.微量加样器:按规定的量加入板孔中。应将所加物加在LEISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可溅出,不可产生气泡。2.滴加试剂:注意滴加角度,不可滴加太快 (二)加标本及反应试剂(三)温育 抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间,这一保温过程称为温育时间,这一保温过程称为温育(incubation)。反应板孔温度从室温升至反应板孔温度从室温升至3737需要一定的需要一定的时间。工作中经常是将微孔板放入温箱时间。工作中经常是将微孔板放入温箱后即开始计时,造成实际测定中温育时后即开始计时,造成实际测定中温育时间不够,弱阳性标本检测不出来。间不够,弱阳性标本检测不出来。1、一般均采用水浴箱,使温度迅速平衡。2、为避免蒸发,板上应加盖,也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔。3、若用保温箱,ELISA板应放在湿盒内,湿盒要选用传热性良好的材料如金属等,在盒底垫湿的纱布,最后将ELISA板放在湿纱布上。湿盒应先放在保温箱中预温至规定的温度。4、反应板均不宜叠放,以保证各板的温度都能迅速平衡。洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤,但却也决定着实验的成败。目的:洗去反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。ELSIA就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。(四)洗涤 洗涤洗涤方式方式 洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外,手工操作有浸泡式和流水冲洗式两种。洗涤液 PBST (五)显色nELISA测定中3730分钟才可以使酶的底物催化反应完全(弱阳性标本)n加入底物前需检查底物溶液的有效性n为保证结果的稳定性,不可随意改变温度和时间。比色比色 比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体,然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。用特定的波长测读吸光值。比色结果的表达以往通用光密度(optical density,OD),现按规定用吸光度(absorbence,A),两者含义相同。以空白孔校零测定反应孔的吸光度值(A值)临床意义 抗ds-DNA抗体(特异性)n诊断SLE 抗Sm抗体(标志性)抗核小体抗体授课题目抗dsDNA抗体的检测教材病原生物与免疫学实验授课方式实验课学时4学时授课时间2016.5.教学手段多媒体教学教学目的掌握:抗dsDNA抗体的检测的原理、操作方法及结果判定熟悉:抗dsDNA抗体检测的临床意义 教学重点抗dsDNA抗体的检测的原理及操作方法教学难点抗dsDNA抗体的检测的原理及结果判定教学过程及时间分配教 学 内 容教学方法10分钟100分钟讲 授+学生操作20分钟50分钟 ELISA的原理及应用;抗dsDNA抗体检测的临床意义实验原理:ELISA间接法,若被检样品中有ds-DNA抗体,先与板条中包被的ds-DNA抗原结合,形成Ag-Ab复合物,再与酶标抗体形成Ag-Ab-二抗复合物,加入底物出现蓝色(TMB)。实验材料:外周血、吸管、离心管、微量加样器、抗ds-DNA抗体检测试剂盒、吸水纸、温箱、湿盒实验方法:1.静脉采血,离心3000r/min,10min取上清。试验前20min从冰箱中拿出试剂盒,平衡至室温。2.浓缩洗涤液1:40比例稀释,摇匀备用。3.滴加100l标本稀释液于各标本孔中,取5l标本血清加入反应孔中,临界孔(2孔)、阳性对照孔(1孔)各加50l于孔中。4.反应板震荡混匀(30s)37温浴20min 5.洗板5次(洗涤液注孔2/3体积),每次注入洗涤液后停留1min,最后一次拍干6.每孔加入酶标二抗50l,37温浴20min,洗板5次7.加入底物液A(50l)B(30l), 37温浴10min8.取出,加50l终止液,混匀,酶标仪测OD值实验结果:在450nm波长处读取OD值标本孔OD值临界孔OD值 阳性 临界孔OD值 阴性用酶标仪测量微孔板中每孔的OD值,判定结果注意事项:1.操作的标准化试剂及标本的准备 加样 保温 洗涤 显色 比色2.正确使用酶标仪完成实验报告导入新课讲授法启发式演示总结本课题方面的新进展化学发光酶免疫试验、荧光酶免疫试验例 题ELISA方法建立的基本步骤有哪些?作 业 题1. ELISA操作中应注意哪些问题?2. 抗dsDNA抗体检测的临床意义?专业外语词 汇Enzyme-linked immunosorbent assayAbsorbance,A optical density,OD主要参考资 料临床免疫学检验技术实验指导 人民卫生出版社课 堂 总 结ELISA操作的标准化课 后 记(课后总结)培养学生严谨的实验操作意识,培养科研思维,注意教学方法,引起学生学习兴趣。实施情况及分析教研室审阅意见
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