细菌药敏试验及其耐药表型检测ppt课件

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1、第 4章 细 菌 药 物 敏 感试 验 及 其 耐 药 表 型 检 测王 辉 北 京 大 学 医 学 部 抗 菌 药 物 敏 感 试 验 测 定 抗 菌 药 物 在 体 外 对 病 原 微 生 物 有 无抑 菌 或 杀 菌 作 用 的 方 法 称 为 抗 菌 药 物 敏感 性 试 验 （ Antimicrobial Susceptibility Test） ， 简 称 药 敏 试 验 （ AST） 。 药 敏 试 验 的 意 义 预 测 抗 菌 治 疗 的 效 果 ； 指 导 抗 菌 药 物 的 临 床 应 用 ； 发 现 或 提 示 细 菌 耐 药 机 制 的 存 在 ， 能 帮 助 临床

2、医 生 选 择 合 适 的 药 物 ， 避 免 产 生 或 加 重 细菌 的 耐 药 ； 监 测 细 菌 耐 药 性 ， 分 析 耐 药 菌 的 变 迁 ， 掌 握耐 药 菌 感 染 的 流 行 病 学 ， 以 控 制 和 预 防 耐 药菌 感 染 的 发 生 和 流 行 。 药 敏 试 验 MIC： 在 与 微 生 物 生 长 速 率 有 关 的 特 定时 间 间 隔 内 ， 通 常 是 18 24小 时 ， 能 够抑 制 被 测 菌 生 长 的 最 低 药 物 浓 度 。 对 倍 稀 释 的 优 点 ：操 作 容 易敏 感 株 的 MIC呈 正 态 分 布区 分 异 常 (R)与 敏 感

3、(S)的 菌 群 药 敏 试 验 折 点 的 建 立 1. MIC的 分 布2. 药 代 动 力 学 和 药 效 学 定 MIC的 折 点3. 临 床 疗 效 和 细 菌 清 除 率4. 抑 菌 圈 直 径 的 分 布 定 抑 菌 圈 折 点统 计 学 的 线 性 回 归计 算 错 误 率 ： 尽 可 能 减 少 极 重 要 误 差 (假 敏 感 率 ) MIC的 分 布 0 5 10 15 20 0. 00 8 0. 03 2 0. 12 5 0. 5 2 8 32 12 8 51 2 药 代 动 力 学 和 药 效 学 药 代 动 力 学 ： 药 物 吸 收 ， 分 布 ， 代 谢 ， 排

4、 泄 药 效 学 ： 药 物 对 机 体 的 作 用 时 间 依 赖 型 （ TMIC ： -内 酰 胺 类 ， 大 环 内 酯 类 浓 度 依 赖 型 （ AUC/MIC比 率 ： AGS, FQ这 些 参 数 可 用 于 计 算 具 有 最 佳 药 效 的 给 药 方 案 MIC与 抑 菌 圈 直 径 的 线 性 关 系耐药 中介 敏感RIS Log2. MIC D 1 d2 抑菌圈直径（m m )v 抑 菌 圈 直 径 与 MIC的 关 系 MIC (ug/ml) 1 2 3 5 2 2 2 2 2 1 1 1 1 2 2 5 8 1 1 1 2 5 1 2 5 6 8 小 误 差 中

5、介 32 34 耐 药 重 要 误 差 小 误 差 9 敏 感 小 误 差 极 重 要 误 差小 误 差 24 26 28 3014 18 20 22 0.25 0.5 10 12 1 2 4 8 256 256 16 32 64 128 不 同 国 家 的 判 定 折 点 可 能 不 同 原 因 ：用 药 剂 量 不 同 ， 服 药 的 间 隔 不 同评 价 敏 感 时 较 保 守更 强 调 检 测 出 耐 药 株 （ 即 特 定 的 耐 药 群 ）技 术 因 素 ： 接 种 、 培 养 基在 我 国 主 要 遵 循 临 床 实 验 室 标 准 化 委 员 会 （ Clinical and

6、Laboratory Standards Institute, CLSI） 制 定 的 抗 菌 药物 选 择 原 则 。 敏 感 性 分 类 (CLSI的 定 义 ) 敏 感 （ Susceptible）用 常 规 用 量 治 疗 有 效常 规 用 药 时 达 到 的 平 均 血 药 浓 度 超 过 细 菌 的MIC 5倍 以 上 。 耐 药 （ Resistance）用 常 规 用 量 治 疗 不 能 抑 制 细 菌 的 生 长MIC高 于 药 物 在 血 、 体 液 中 可 能 达 到 的 浓 度 敏 感 性 分 类 （ 2） 中 介 (Intermediate)MIC接 近 血 、 体

7、液 中 药 物 的 浓 度 ， 治疗 反 应 率 低 于 敏 感 株药 物 生 理 浓 集 部 位 有 效 (尿 -FQ)加 大 用 药 剂 量 可 能 有 效缓 冲 区 ： 防 止 操 作 的 系 统 误 差 造 成 重大 结 果 的 判 定 错 误 药 敏 试 验 的 方 法 学 半 定 量 纸 片 扩 散 法 (抑 菌 圈 直 径 ) MIC法 ：稀 释 法 (肉 汤 、 琼 脂 )自 动 化 仪 法抗 生 素 连 续 梯 度 法 (Etest )流 式 细 胞 仪 将 含 有 定 量 抗 菌 药 物 的 纸 片 贴 在 已 接 种 测 试 菌 的 琼脂 平 板 上 ， 纸 片 中 所

8、含 的 药 物 吸 收 琼 脂 中 水 分 溶 解 后不 断 向 纸 片 周 围 扩 散 形 成 递 减 的 梯 度 浓 度 ， 在 纸 片 周围 抑 菌 浓 度 范 围 内 测 试 菌 的 生 长 被 抑 制 ， 从 而 形 成 无菌 生 长 的 透 明 圈 即 为 抑 菌 圈 。 抑 菌 圈 的 大 小 反 映 测 试 菌 对 测 定 药 物 的 敏 感 程 度 ，并 与 该 药 对 测 试 菌 的 MIC呈 负 相 关 关 系 。 纸 片 扩 散 法 （ Kirby-Bauer法 ） 纸 片 扩 散 法1. 水 解 酪 蛋 白 （ MH） 培 养 基 ， pH7.2 7.4， 做 成 琼

9、 脂 厚 度4mm， 直 径 90mm的 平 板 ；2. 挑 取 孵 育 16 24小 时 已 分 纯 菌 落 ， 置 于 生 理 盐 水 管 中 ，振 荡 混 匀 后 校 正 浓 度 至 0.5麦 氏 标 准 。 纸 片 扩 散 法3. 用 无 菌 棉 拭 子 蘸 取 菌 液 ， 在 试 管 内 壁 旋 转 挤 去 多 余 菌 液 ；4. 然 后 在 MH琼 脂 表 面 均 匀 涂 布 接 种 3次 ， 每 次 旋 转 平 板 60度 ；5. 最 后 沿 平 板 内 缘 涂 抹 1周 ；6. 平 板 在 室 温 下 干 燥 3 5min， 用 无 菌 镊 子 或 商 品 化 的 纸 片 分

10、配器 将 含 药 纸 片 紧 贴 于 琼 脂 表 面 ， 各 纸 片 中 心 距 离 应 大 于 24mm，纸 片 距 平 板 内 缘 大 于 15mm。 纸 片 扩 散 法7. 35 孵 育 16 24小 时 量 取抑 菌 圈 直 径 ；8. 根 据 抑 菌 环 的 直 径 ， 按 照CLSI标 准 判 读 ， 报 告 敏 感 、中 介 、 耐 药 。 2021-5-26 18 纸 片 扩 散 法 影 响 因 素 MIC 接 种 菌 量 细 菌 生 长 率 抗 生 素 含 量 、 扩 散 性 平 皿 厚 度 温 度 ， 预 孵 育 时 间 2021-5-26 19 纸 片 扩 散 法 标 准

11、 化 CLSI： 美 国 实 验 室 标 准 化 委 员 会 (Clinical and Laboratory Standards Institute) 每 年 修 订 更 改包 括 质 控新 药 的 判 定 标 准特 殊 耐 药 性 的 检 测 2021-5-26 20 CLSI的 法 规 规 定 纸 片 含 量 、 接 种 浓 度 、 培 养 基 、 平皿 厚 度 、 判 定 标 准 、 质 控 ； 规 定 常 规 测 试 报 告 的 抗 生 素 ； 不 同 的 药 判 定 标 准 不 同 ； 不 同 的 菌 判 定 标 准 也 不 同 。 2021-5-26 21 常 规 测 试 并 报

12、 告 的 药 物 分 组 (1) 肠 杆 菌 科 绿 脓 和 非 肠 杆 菌 科一 级 氨 苄 西 林 头 孢 他 啶 ， 庆 大 霉 素 头 孢 唑 林 ， 庆 大 霉 素 替 卡 西 林 ， 哌 拉 西 林二 级 阿 米 卡 星 阿 米 卡 星 氨 苄 西 林 /舒 巴 坦 头 孢 吡 肟 ， 头 孢 哌 酮 阿 莫 西 林 /克 拉 维 酸 氨 曲 南 头 孢 呋 肟 ， 头 霉 素 环 丙 沙 星 ， 亚 胺 培 南 头 孢 噻 肟 ， 头 孢 曲 松 替 卡 西 林 /克 拉 维 酸 环 丙 沙 星 ， 亚 胺 培 南 妥 布 霉 素 ， 复 方 磺 胺 替 卡 西 林 ， 哌 拉

13、西 林 三 级 氨 曲 南 ， 头 孢 他 啶 头 孢 曲 松 卡 那 霉 素 ， 奈 替 米 星 氯 霉 素 ， 奈 替 米 星 妥 布 霉 素 四 环 素 ， 氯 霉 素 2021-5-26 22 常 规 测 试 并 报 告 的 药 物 分 组 (2) 葡 萄 球 菌 肠 球 菌一 级 苯 唑 西 林 ， 青 霉 素 青 霉 素 ， 氨 苄 西 林二 级 红 霉 素 类 万 古 霉 素 克 林 霉 素 ， 万 古 霉 素三 级 氯 霉 素 庆 大 霉 素 2021-5-26 23 常 规 测 试 并 报 告 的 药 物 分 组 (3) 流 感 嗜 血 杆 菌 肺 炎 链 球 菌一 级 氨

14、苄 西 林 ， 青 霉 素 青 霉 素 ， 红 霉 素 复 方 磺 胺 复 方 磺 胺二 级 头 孢 呋 肟 ， 头 孢 噻 肟 氧 氟 沙 星 ， 四 环 素 头 孢 他 啶 ， 氯 霉 素 万 古 霉 素三 级 阿 奇 霉 素 ， 头 孢 克 罗 氯 霉 素 ， 利 福 平 环 丙 沙 星 ， 亚 胺 培 南 利 福 平 ， 四 环 素 2021-5-26 24 预 报 用 药 (一 ) 测 试 药 菌 名 推 测 其 他 药 物 的 敏 感 性 苯 唑 西 林 葡 萄 球 菌 所 有 -内 酰 胺 类 四 环 素 所 有 （ 除 葡 多 西 环 素 ， 米 诺 环 素 萄 球 菌 和 不

15、 动 杆 菌 红 霉 素 G 球 菌 罗 红 霉 素 ， 克 拉 霉 素 ， 阿 奇 霉 素 克 林 霉 素 所 有 林 可 霉 素 2021-5-26 25 预 报 用 药 (二 )测 试 药 菌 名 推 测 其 他 药 物 的 敏 感 性 氨 苄 西 林 肠 球 菌 青 霉 素 青 霉 素 G 葡 萄 球 菌 氨 苄 西 林 ， 美 洛 西 林 替 卡 西 林 头 孢 噻 吩 肠 杆 菌 科 头 孢 拉 定 ， 头 孢 氨 苄 头 孢 克 罗 奈 啶 酸 肠 杆 菌 科 所 有 氟 喹 诺 酮 类 万 古 霉 素 所 有 替 考 拉 宁 以 一 定 浓 度 的 抗 菌 药 物 与 含 有

16、被 试 菌 株 的 培 养 基 进行 一 系 列 不 同 倍 数 稀 释 （ 通 常 为 双 倍 稀 释 ） ， 经 培养 后 观 察 其 最 低 抑 菌 浓 度 。 稀 释 法 中 用 琼 脂 培 养 基 者 为 琼 脂 稀 释 法 ， 用 肉 汤 培养 基 者 为 肉 汤 稀 释 法 。 药 敏 试 验 -稀 释 法 常 用 抗 菌 药 物 容 积 稀 释 法步骤浓度（mg/mL）来源体积(mL) CAMHB(mL)最终浓度（mg/mL）1 5 1 2 0储存液1 9 5 1 22 5 1 2步骤1 1 1 2 5 63 5 1 2步骤1 1 3 1 2 84 5 1 2步骤1 1 7 6

17、 45 6 4步骤4 1 1 3 26 6 4步骤4 1 3 1 67 6 4步骤4 1 7 88 8步骤7 1 1 4 9 8步骤7 1 3 21 0 8步骤7 1 7 11 1 1步骤1 0 1 1 0 .51 2 1步骤1 0 1 3 0 .2 51 3 1步骤1 0 1 7 0 .1 2 5 抗 菌 药 物 的 稀 释 和 融 解 2021-5-26 29 肉 汤 稀 释 法 4 8 16 32 64 128 256 ug/ml 混 混 清抗 生 素 倍 比 稀 释 ， 种 菌 10 5CFU/ml ， 孵 育 35 ，16 20h， 判 读 。 2021-5-26 30 肉 汤 稀

18、释 法 调 节 离 子 浓 度 的 MH肉 汤 宏 量 肉 汤 法 （ 2ml, 13x100mm ）微 量 肉 汤 法 （ 0.1ml, 微 量 板 ） 自 动 化 仪 优 点 ： 准 确 ， 可 靠 ， 可 用 于 研 究 。 缺 点 ：劳 动 强 度 大细 菌 生 长 情 况 不 可 查 2021-5-26 31 琼 脂 稀 释 法 浓 度 16 32 64 128 256 ug/ml 制 备 含 对 倍 抗 生 素 浓 度 梯 度 的 平 板 ， 制 备 菌 悬 液 ，点 种 菌 ， 10 4/每 个 点 ， 孵 育 ， 判 读 结 果 2021-5-26 32 琼 脂 稀 释 法优

19、点 ： 金 标 准 精 确 可 靠可 同 时 测 定 多 株 菌 （ 40株 ）细 菌 生 长 情 况 可 查缺 点 ： 测 多 个 药 时 劳 动 强 度 大制 备 平 皿 费 时 费 力 E test 法nE试 条 是 一 条 5mm 50mm的 无 孔 试 剂 载 体 ， 一 面 固定 有 一 系 列 预 先 制 备 的 ， 浓 度 呈 连 续 指 数 增 长 稀 释 抗菌 药 物 ， 另 一 面 有 读 数 和 判 别 的 刻 度 ；n抗 菌 药 物 的 梯 度 可 覆 盖 有 20个 MIC对 倍 稀 释 浓 度 的宽 度 范 围 ；n将 E试 条 放 在 细 菌 接 种 过 的 琼

20、 脂 平 板 上 ， 经 孵 育 过 夜 ，围 绕 试 条 明 显 可 见 椭 圆 形 抑 菌 圈 ， 圈 的 边 缘 与 试 条 交点 的 刻 度 浓 度 即 为 抗 菌 药 物 抑 制 细 菌 的 最 小 抑 菌 浓 度 。 2021-5-26 wanghui-ART 34 E test 法 细 菌 生 长区E test 塑 料条 椭 圆 形细 菌 生 长抑 制 区256128 8016 判 读 抑 菌 浓 度（ MIC ug/ml) E test 法 菌 液 制 备 及 接 种 均 同 纸片 扩 散 法 。 90mm平 板 上 可 放 E试 验试 条 1 2条 ， 140mm平 板 最

21、多 可 放 6条 。 孵 育 温 度 及 时 间 同 纸 片扩 散 法 。 2021-5-26 36 E test 法 优 点连 续 浓 度 梯 度 ， 与 琼 脂 稀 释 法 相 关 性 好影 响 因 素 少 ， 稳 定 性 高操 作 简 单 ， 省 时 缺 点 ： 昂 贵 用 途 ： 快 生 长 菌 ， 苛 养 菌 ， 厌 氧 菌 ， 酵 母 菌 ， 分 枝 杆 菌 2021-5-26 37 评 价 药 物 体 外 抗 菌 活 性 的 指 标 MIC50, MIC90, MIC 均 值 ， MIC 范 围 ， R， I， S MIC50/ MIC90： MIC从 小 到 大 排 列 ， 位

22、 于 第 50 / 90百 分 位 菌 株 的 MIC值 单 纯 比 较 MIC50， MIC90是 片 面 的 ， 还 要 同 时 看 平 均MIC及 MIC范 围 同 时 结 合 R， I， S， (不 同 药 物 血 浓 度 不 同 ， 安 全 范围 不 同 ) 细 菌 耐 药 机 制 细 菌 耐 药 机 制 主 要 有 四 种 ：产 生 一 种 或 多 种 水 解 酶 、 钝 化 酶 和修 饰 酶 ；抗 生 素 作 用 的 靶 位 改 变 ， 包 括 青 霉素 结 合 蛋 白 位 点 、 DNA解 旋 酶 、DNA拓 扑 异 构 酶 的 改 变 等 ；细 菌 膜 的 通 透 性 下 降

23、 ， 包 括 细 菌 生物 被 膜 的 形 成 和 通 道 蛋 白 丢 失 ；细 菌 主 动 外 排 系 统 的 过 度 表 达 。 在 上 述 耐 药 机 制 中 ， 第 一 、 二 种 耐 药机 制 具 有 专 一 性 ， 第 三 、 四 种 耐 药 机制 不 具 有 专 一 性 。 -内 酰 胺 酶 内 酰 胺 酶 是 一 类 水 解 青 霉 素 、 头 孢 菌 素 类 抗生 素 的 灭 活 酶 ； 该 酶 位 于 革 兰 阳 性 球 菌 菌 体 外 ，革 兰 阴 性 杆 菌 间 质 中 ； 检 测 方 法 有 微 生 物 培 养 法 、 碘 淀 粉 法 、 头孢 硝 噻 吩 纸 片 法

24、 。 其 中 头 孢 硝 噻 吩 纸 片 法 因 为简 单 、 方 便 、 快 速 ， 应 用 于 临 床 检 测 。 葡 萄 球 菌 属 青 霉 素 方 法 敏 感 中 介 耐 药MIC 0.12 mg/ml - 0.25 mg/ml纸 片 扩 散 法 29 mm - 28 mm 诱 导 -内 酰 胺 酶 的 检 测 如 果 青 霉 素 的 药 敏 结 果 出 现 以 下 情 况 ， 需要 做 诱 导 -内 酰 胺 酶 的 检 测 ：MIC 0.12 g/ml Zone diameter 29 mm 诱 导 -内 酰 胺 酶 试 验 超 广 谱 -内 酰 胺 酶 （ ESBLs） ESBLs

25、是 指 由 质 粒 介 导 的 能 水 解 青 霉 素 类 、 头 孢 菌素 类 和 单 环 内 酰 胺 类 氨 曲 南 的 一 类 酶 ； ESBLs不 能 水 解 头 霉 素 类 和 碳 青 霉 烯 类 药 物 ， 能 被克 拉 维 酸 、 舒 巴 坦 和 他 唑 巴 坦 等 内 酰 胺 酶 抑 制 剂所 抑 制 ； ESBLs主 要 见 于 大 肠 埃 希 菌 和 肺 炎 克 雷 伯 菌 ， 此 外也 见 于 肠 杆 菌 属 、 枸 橼 酸 杆 菌 属 、 变 形 杆 菌 属 、 沙雷 菌 属 等 其 他 肠 杆 菌 科 细 菌 、 不 动 杆 菌 、 铜 绿 假 单胞 菌 。 超 广

26、谱 -内 酰 胺 酶 （ ESBLs） 纸 片 法 ， 出 现 以 下 一 种 情 况 即 可 怀疑 该 菌 株 产 生 ESBL （ 筛 选 阳 性 ） ： 头 孢 泊 肟 17mm 头 孢 他 啶 22mm 头 孢 噻 肟 27mm 头 孢 曲 松 25mm 氨 曲 南 27mm 超 广 谱 -内 酰 胺 酶 （ ESBLs） 纸 片 法 （ 表 型 确 认 试 验 ） 头 孢 他 啶 和 头 孢 他 啶 /克拉 维 酸 、 头 孢 噻 肟 和 头 孢噻 肟 /克 拉 维 酸 。 任 一 复 方 制 剂 的 抑 菌 圈 直径 与 相 应 单 药 抑 菌 圈 直 径相 差 5mm时 ， 即

27、可 判 断该 菌 产 ESBL。 超 广 谱 -内 酰 胺 酶 （ ESBLs） 稀 释 法 ， 出 现 以 下 一 种 情 况 即 可 怀 疑 该 菌株 产 生 ESBL： 头 孢 他 啶 或 头 孢 噻 肟 或 头 孢 曲 松 或 氨 曲南 MIC2mg /mL 或 头 孢 泊 肟 MIC8mg /mL 超 广 谱 -内 酰 胺 酶 （ ESBLs） 稀 释 法 （ 表 型 确 认 试 验 ） 头 孢 他 啶 和 头 孢 他 啶 /克 拉 维 酸 、 头 孢 噻 肟和 头 孢 噻 肟 /克 拉 维 酸 。 任 何 一 组 酶 抑 制 剂 复 方 制 剂 的 MIC值 比 相应 单 药 的

28、MIC降 低 3个 稀 释 度 者 即 可 判 定 该菌 为 产 ESBL菌 株 。 AmpC酶 的 特 征 AmpC酶 是 在 革 兰 阴 性 菌 中 发 现 的 由 染 色 体或 质 粒 介 导 的 水 解 头 孢 菌 素 的 型 内 酰 胺 酶 ，可 分 为 诱 导 酶 和 非 诱 导 酶 。 与 ESBLs不 同 的 是 ， AmpC酶 对 三 代 头 孢 菌素 耐 药 但 对 四 代 头 孢 菌 素 敏 感 且 不 被 酶 抑 制剂 克 拉 维 酸 所 抑 制 ， 但 其 酶 活 性 可 被 氯 唑 西林 和 硼 酸 抑 制 。 AmpC酶 的 检 测 方 法 头 孢 西 丁 三 维

29、 试 验 是 检 测 AmpC酶 的 经 典 方 法 ； 除 此 之 外 ， 还 有 以 硼 酸 化 合 物 为 抑 制 剂 检 测 肺炎 克 雷 伯 菌 和 大 肠 埃 希 菌 的 AmpC酶 、 AmpC Disk、 头 孢 西 丁 琼 脂 基 础 法 等 。 碳 青 霉 烯 酶 碳 青 霉 烯 酶 可 以 定 义 为 具 有 水 解 碳 青 霉 烯 类 抗 生 素活 性 的 -内 酰 胺 酶 ， 主 要 分 布 于 -内 酰 胺 酶 A、 B、D类 中 。 根 据 水 解 机 制 中 作 用 位 点 的 不 同 可 以 将 碳 青 霉 烯 酶分 为 两 大 类 ：一 类 称 为 金 属

30、碳 青 霉 烯 酶 ， 这 类 酶 以 金 属 锌 离 子 为 活 性作 用 位 点 ， 可 以 被 EDTA抑 制 ， 属 于 B类 -内 酰 胺 酶 ； 另 一 类 以 丝 氨 酸 （ Ser） 为 酶 的 活 性 作 用 位 点 ， 可 以 被 酶抑 制 剂 克 拉 维 酸 和 他 唑 巴 坦 所 抑 制 ， 属 于 A、 D类 -内 酰胺 酶 。 碳 青 霉 烯 酶A类 酶 B类 酶D类 酶染 色 体 编码 ： SME NMC IMI 质 粒 编 码： KPC GES 质 粒 编 码 OXA-23 OXA-24 OXA-51 OXA-58 OXA-55 OXA-48 OXA-50 OX

31、A-60 OXA-62 金 属 酶 ， 位 于GMEs上 ， 包 括VIM， IMP，GIM， SPM，SIM等 可 以 被 酶 抑 制 剂 抑 制 可 以 被 EDTA抑 制 碳 青 霉 烯 酶 表 型 检 测 方 法 -改 良 hodge试 验 ATCC25922， 0.5麦 氏 ， 1:10稀 释 涂 MH平 板 平 皿 中 心 贴 10g 厄 他 培 南 或 亚 胺 培 南 纸 片 10l环 挑 取 3 5个 菌 落 从 平 板 中 心 纸 片 边 缘 向 平 板 边 缘 划 线 被 测 菌 株 与 大 肠 埃 希 菌 ATCC25922 抑 菌 环 交 汇 处 大 肠 埃 希 菌 生

32、长 增 强 ， 即 产 碳 青 霉 烯 酶 。 改 良 hodge试 验 的 结 果 判 读 金 属 酶 表 型 检 测 方 法 ： EDTA协 同 试 验 用 0.5麦 氏 单 位 的 待 测 菌 悬 液 涂 布 M H 平 板 。 贴 IMP (10g)纸 片 距 其 1cm 处 贴 EDTA纸 片 （ 0.5mol/L 4l） 。 35 过 夜 培 养 。 亚 胺 培 南 抑 菌 圈 在 靠 近 加 EDTA纸 片 侧 明 显 扩 大 者 为 产 金 属 酶 菌株 。 亚 胺 培 南 EDTA10mm 耐 甲 氧 西 林 金 黄 色 葡 萄 球 菌 （ MRSA） 携 带 SCCmec基

33、 因 盒 。SCCmec基 因 盒 中 的 MecA基 因 编 码 修 饰 的 青 霉 素 结 合 蛋 白PBP2a， 这 种 蛋 白 对 甲 氧 西 林 和 其 他 的 -内 酰 胺 类 抗 生 素 亲 和力 下 降 ， 从 而 导 致 对 这 些 抗 生 素 的 耐 药 。 SCCmec主 要 由 mec复 合 物 和 ccr复 合 物 两 部 分 组 成 。 根 据 不同 mec复 合 物 和 ccr复 合 物 的 组 合 ， 可 以 将 SCCmec分 成 不 同 的型 别 ， 目 前 已 发 现 8种 SCCmec型 。耐 甲 氧 西 林 葡 萄 球 菌 SCCmec基 因 盒 耐

34、甲 氧 西 林 葡 萄 球 菌 的 检 测MRSA的 检 测 方 法 有 头 孢 西 丁 纸 片 扩 散 法 、 苯 唑 西 林琼 脂 稀 释 法 、 乳 胶 凝 胶 试 验 检 测 PBP2a、 mecA基 因测 定 及 MRSA显 色 培 养 基 。头 孢 西 丁 纸 片 法 、 苯 唑 西 林 琼 脂 稀 释 法 是 目 前 检 测 耐甲 氧 西 林 葡 萄 球 菌 最 常 用 筛 选 方 法 。对 于 金 黄 色 葡 萄 球 菌 ， MRSA的 检 测 可 以 使 用 苯 唑 西林 纸 片 ， 但 对 于 凝 固 酶 阴 性 葡 萄 球 菌 则 不 能 使 用 苯 唑西 林 纸 片 。

35、 甲 氧 西 林 耐 药 的 葡 萄 球 菌 （ MRS） MRS检测药物纸片法稀释法金黄色葡萄球菌1 mg 苯唑西林 路邓葡萄球菌1 mg 苯唑西林金黄色葡萄球菌和路邓葡萄球菌3 0 mg 头孢西丁 除路邓以外的凝固酶阴性葡萄球菌1 mg 苯唑西林3 0 mg 头孢西丁 凝 固 酶 阴 性 葡 萄 球 菌 中 苯 唑 西 林 MIC结 果 的 报 告 策 略 * 克 林 霉 素 诱 导 耐 药 试 验 克 林 霉 素 诱 导 耐 药 葡 萄 球 菌 红 霉 素 *耐 药 的 金 葡 菌 或 凝 固 酶 阴 性 葡 萄球 菌 可 对 克 林 霉 素 结 构 性 或 诱 导 性 耐 药 或仅 对

36、 红 霉 素 耐 药 。 *或 其 他 大 环 内 酯 类 红 霉 素 /克 林 霉 素 耐 药 葡 萄 球 菌 耐 药 机 制 诱 导 性 克 林 霉 素 耐 药 （ erm介 导 ）葡 萄 球 菌 -“D试 验 ”患 者 不 会 对 克 林 霉 素 有 反 应 -报告 克 林 霉 素 耐 药 无 克 林 霉 素 诱 导 （ msrA介 导 ）真 的 克 林 霉 素 敏 感 -报 告 克 林 霉 素 敏 感“ D” 葡 萄 球 菌 诱 导 性 克 林 霉 素 耐 药 的 MIC检 测 方 法 对 于 红 霉 素 耐 药 ， 克 林 霉 素 敏 感 的 葡 萄 球 菌 ，需 检 测 诱 导 性

37、 克 林 霉 素 耐 药 注 意试 验 适 用 于 金 葡 菌 和 凝 固 酶 阴 性 葡 萄 球 菌 (苯 唑 西 林 敏 感 和耐 药 株 )；对 于 CoNS， 该 试 验 不 必 常 规 开 展 因 为 克 林 霉 素 很 少 用 于治 疗 凝 固 酶 阴 性 葡 萄 球 菌 ；大 多 数 医 院 相 关 MRSA是 克 林 霉 素 耐 药 的 ；大 多 数 社 区 相 关 MRSA是 克 林 霉 素 敏 感 的 (msrA 基 因 型 )；克 林 霉 素 可 以 口 服 给 药 。 万 古 霉 素 中 介 耐 药 的 金 黄 色 葡 萄 球 菌 （ VISA） 血 琼 脂 上 48小

38、 时 生 长 当 有 以 下 一 个 或 多 个 情 况 时 菌 株 可 疑 为 VISA -內 酰 胺 类 药 物 的 MIC降 低 达 托 霉 素 MIC升 高 菌 落 形 态 不 典 型 （ 一 些 为 微 小 菌 落 ） 肉 汤 中 生 长 迟 缓 （ 如 血 培 养 ） 凝 固 酶 反 应 微 弱 /延 迟 经 过 几 次 次 代 培 养 后 ：菌 落 回 复 为 典 型 形 态万 古 霉 素 MIC降 低 并 且 菌 株 变 为 万 古 霉 素 敏 感 万 古 霉 素 耐 药 的 金 黄 色 葡 萄 球 菌 （ VRSA） vanA从 VRE转 至 金 葡 菌 纸 片 扩 散 法

39、折 点葡 萄 球 菌 -万 古 霉 素 肠 球 菌 高 水 平 氨 基 糖 苷 类 耐 药 筛 查 纸 片 扩 散 法120 g 庆 大 霉 素 ; 300 g 链 霉 素 10 mm = 无 高 水 平 氨 基 糖 苷 类 耐 药 MIC筛 查庆 大 霉 素 : 500 g/ml 链 霉 素 : 1000 g/ml (肉 汤 ) 2000 g/ml (琼 脂 ) 肠 球 菌 氨 基 糖 苷 类 修 饰 酶 链 霉 素 庆 大 霉 素 妥 布 霉 素 阿 米 卡 星 /丁 胺 卡 那6-AAD + - - -3APH - - - +2”APH/6AAC - + + +6AAC* - - + +

40、 * 在 所 有 屎 肠 球 菌 中 均 发 现 万 古 霉 素 耐 药 肠 球 菌 （ VRE） 表 型 VRE 屎 肠 球 菌 中 居 多vanA - 高 水 平 耐 药 (MIC 256 g/ml)vanB - 中 等 水 平 耐 药 (MIC 16 - 256 g/ml) 低 水 平 万 古 霉 素 耐 药vanC - (MIC 2 - 16 g/ml)vanC天 然 存 在 于 鹑 鸡 肠 球 菌 和 铅 黄 肠 球 菌菌 株 不 引 起 院 内 爆 发 ， vanC基 因 不 易 于 传 播纸 片 扩 散 法 实 验 可 能 检 测 不 出 VRE 菌 种 基 因 型 动 力 MG

41、P* 有 意 义 否 ? 粪 肠 球 菌 vanA or vanB - - 是 屎 肠 球 vanA or vanB - - 是 * 铅 黄 肠 球 菌 vanC + + 否 鹑 鸡 肠 球 菌 vanC + + 否 VRE 肺 炎 链 球 菌 新 的 青 霉 素 折 点 (g/ml) 肺 炎 链 球 菌纸 片 扩 散 法 -使 用 苯 唑 西 林 纸 片 作 为 青 霉 素 敏 感 性 的 替 代 纸 片 肺 炎 链 球 菌苯 唑 西 林 纸 片 法 用 于 测 定 青 霉 素 的 敏 感 性 20 mm - 报 告 “ 敏 感 ” ：青 霉 素 头 孢 噻 肟 /头 孢 曲 松 其 他 -内 酰 胺 类 19 mm - 进 行 MIC实 验 ： 青 霉 素 苯 唑 西 林 纸 片 敏 感 或 20 mm 对 应 脑 膜 炎 或 口服 青 霉 素 的 敏 感 折 点 (MIC 0.06 g/ml) 肺 炎 链 球 菌 青 霉 素 Etest MIC结 果 判 读