走进生物技术

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1、基因芯片技术及其应用林明生080351504（广东药学院 药科学院 化学工程与工艺 药用高分子材料08）摘要：本文综述了基因芯片技术的工作原理，分类，技术环节，还有在眼科领域中，在胰腺癌研究中，在胃癌淋巴结转移预测诊断中，在老年性聋研究中，在乙型肝炎病毒耐药和分型检测中，在白血病研究中，在分子营养学上的应用。关键词：基因芯片 应用 DAN RNA The technology of gene chip and its applicationsAbstract：This article gives an overview of that the tracert of the technology

2、 of gene chip ,itstype ,its technical links ,and its application ,such as ,in the field of ophthalmology ,in the study of pancreatic cancer ,in the Stomach cancer lymph node metastasis forecast diagnosis, in the study of presbycusis,in the detect of the Viral hepatitis b, drug and type, in the study

3、 of leukemia,and in the molecular nutrition.Key words: gene chip applications DAN RNA 基因芯片技术是近年来分子生物学及医学诊断技术的重要进展，该技术是通过把巨大数量的寡核普酸，肤核普酸或cDNA固定在一块面积很小的硅片、玻片或尼龙膜上而构成基因芯片。它主要是基于近年来的一种全新的DNA测序方法一杂交测序法应运而生的。由于该技术同时将大量的探针固定于支持物上，所以可以一次性对大量序列进行检测和基因分析，解决了传统的核酸印迹杂交操作复杂，操作序列数量少等缺点。基因芯片技术的突出特点在于其高度的并行性、多样化、微型

4、化和自动化1。1.1基因芯片技术原理 基因芯片技术是建立在基因探针和杂交测序技术上的一种高效快速的核酸序列分析手段 它将大量的基因探针有序地 高密度地排列在一块12 cm2 大小的玻片或胶片上, 形成可与目的分子相互作用的固相表面, 然后与标记的样品进行杂交 ,通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析 。它与其他分析基因表达谱的技术如：RNA 印迹， cDNA文库序列测定, 基因表达序列分析等的不同之处在于基因芯片可以在一次试验中同时平行分析成千上万个基因。21.2基因芯片技术的分类 基因芯片技术的分类方法很多, 最常用的是按载体上所点探针的长度分为cDNA芯片和寡核苷酸芯片两种。（1）cDNA

5、芯片由 建立 将特定的 经 扩增后借助机械手直接点到基片上。（2） 寡核苷酸芯片 由Fodor首先报道， 用照相平板印刷术和固相合成技术在基片上生成寡核苷酸， 分为长寡核苷酸芯片和短寡核苷酸芯片。 与cDNA芯片制作的一个主要不同点是多一步转录获得cRNA 的过程。 几种基因芯片技术的比较见表1 关于不同基因芯片技术的灵敏度和特异性仍存在争议 起初人们认为长寡核苷酸芯片和芯片有更高的特异性和灵敏度。现在看来， 短寡核苷酸芯片同样有效和特异， 因为每一个基因代表1120个寡核苷酸。表1 几种基因芯片技术的比较2项目 cDNA 芯片 短寡核苷酸芯片 长寡核苷酸芯片探针长度 0.53kb 1520b

6、p 4570bp表达谱分析 + + + + + +区分基因型 - + + +检测剪接变异体 - + + + + +点阵一致性 - + + + + +目前应用 + + + + + +批量生产一致性 - + + + + + +芯片成本 适中 较高 较低1.3基因芯片的技术环节 基因芯片技术主要包括四个基本环节（1）芯片的制备：是芯片技术的关键目前有两种方法 原位合成：有光去保护并行合成法，微流体模板固相合成法 ，分子印章法， 压电打印法一般用于较短的探针。合成点样：有机械点样法和化学喷射法。 大多中小型公司采用。（2）样品的制备和标记：主要是对样品DNA或RNA的分离提纯及PCR扩增, 并对靶基因

7、标记.(3) 杂交反应: 属于固-液相反相杂交,探针分子固定于芯片表面,与液相的靶分子进行反应.(4)信号的检测:常用的荧光标记法使用激光共聚集荧光扫描仪进行信号检测.新发展的纳米金标记,通过银放大后可直接用肉眼观察,具有非常好的灵敏度,超过荧光标记法100倍和特异性.2 2.基因芯片技术的应用2.1基因芯片技术在眼科领域中的应用3 迄今为止，在眼科领域利用基因芯片技术研究正常发育过程中或疾病状态时基因表达水平变化的报告逐渐增多，但最成功的当数Choi及Simon他们利用芯片寻找参与视网膜光损伤的基因。为了增加视网膜对光的敏感性，他们先建立了rhodopsin基因和-ti.基因双缺陷小鼠 这样

8、的小鼠在黑暗环境中生长时光感受器发育和形态正常。白光照射后光感受器出现变性、凋亡并逐渐丧失。Choi等采用Affymetrix MotIK,Mu19K和U71芯片，RNA样品分别来源于连续白光照射2,5,8,16,24,48,96 h后正常及rhodopsin和arrestin基因双缺陷小鼠视网膜，杂交后比较分析差异表达基因。Mu11K, Mul9K和U74芯片共有34 325个不同的基因。杂交后其中14 510个基因(42. 3%)显示有明确的杂交信号，表明这些基因在视网膜内表达。其中3 877个基因在一个时间点或多个时间点显示差异，差异表达大于2倍以上的基因共2 673个。进一步采用sel

9、f-organizing map方法将差异表达基因分成24种不同的簇(cluster)或组(group). CO和C2组中的基因光照后表达水平明显下降，其中主要是光传导蛋白。特别有意义的是差异表达在感光细胞形态改变发生前便已十分明显。存在于其他组中的差异表达基因包括热休克蛋白、应急反应蛋白、转录调控因子等。令人感到十分惊奇的是与细胞凋亡有关的基因包括凋亡诱导基囚和抗凋亡基因表达水平的改变并不十分明显。2.2基因芯片技术在胰腺癌研究中的应用4常目前肿瘤的诊断、分型主要依据肿瘤的病理形态学特征。肿瘤的发生发展是一个多因素、多基因和多iRNA阶段的过程，其基因的异常要远远先于形态改变，利用基因芯片高

10、通量、准确、高效信息检测的特点，检测病变组织中特征性基因变化，为肿瘤的早期诊断和分型开辟了新的领域。Takikita等通过对161例肿瘤标本的相关分子Marker和患者的存活时间关癌发生中进行分析，发现当某些黏蛋白(mucin，MUC)家族成员如MUC。、MUC：和MUC，AC的表达增加时活时间明显缩短，尤其是MUC：的表达对分化性腺癌患者预后的判断有重要意义。Fukushima等结合激光捕获显微分离技术及寡聚核苷酸芯片检测了胰腺黏液性囊腺癌(MCN)、周围间质组织、正常胰腺导管上皮、胰腺腺泡的基因表达谱，发现与Notch通路相关的Jagged基因表达上调，Notch下游的达下调。这些基因的发

11、现有助于临床上难以与其他胰腺囊性疾病鉴别的MCN的诊断。Esposito用基因芯片分析组织学及病理学难以诊断的l例胰腺肿瘤，通过芯片检测及聚类分析，发现该肿瘤的基因表达谱与胰腺导管腺癌、胰腺囊性肿瘤、正常胰腺均有差异，认为可能是新的一类胰腺肿瘤，并命名为微囊管状乳头肿瘤。Karanjawala等121应用分析24例胰腺导管癌组织和18例非肿瘤组织的基因表达差异，发现Claudin18和annexinA8基因在胰腺导管癌中明显高表达，并通过组织芯片进一步验证，认为这两种基因可能是胰腺导管癌的分子诊断标记。Taniuchi等使用基因芯片发现PDAC细inter与运动及分子运输相关的RAB6KIFL

12、(RAB6ting，kinesin-like)基因表达上调，同进一步发现RAB6KIFL运输的目的蛋白discs大物5(discs large homolog 5)在胰腺癌中也有上调表达。通过RNA干扰(RNAi)抑制RAB6FL表达显抑制胰腺癌细胞的生长，其研究结果为胰腺癌基因治疗提供了新的靶点。2.3基因芯片技术在胃癌淋巴结转移预测诊断中的应用5转移是恶性肿瘤的重要生物学特征。也是导致肿瘤复发和影响预后的重要因素。胃癌居我国恶性肿瘤发病率的首位。目前基因与胃癌关系的研究取得了一系列的进展，使得利用胃癌患者的基因信息来预测患者是否伴淋巴结转移成为可能，并可为选择适当的治疗方式提供依据。从生物

13、信息学的角度以样本的分类特征基因作为肿瘤分子标志物来寻找和研究与肿瘤有关的基因表达特征具有重要的生物学意义。SVM是一种统计学习理论的分析方法，该技术在二分类问题的应用中显示出良好的学习和泛化能力，已被广泛应用于诸多研究领域。本研究采用SVM技术筛选得到一组由6个基因构成的基因群。该基因群主要与凝血系统、补体系统活化和调节、氨基酸与蛋白质合成代谢等功能有关。其中SERPIN家族的功DX21等。能主要为中和过度表达的丝氨酸蛋白酶活性。参与凝血、纤维蛋白溶解、补体激活、炎性反应、组织重建等过程。维持机体内环境稳定。恶性肿瘤患者常存在血液高凝状态，SERPIN的过度表达可能在肿瘤转移调控中起重要作用

14、。PDI是内质网分子伴侣家族重要成员，可催化蛋白质分子中二硫键的形成。并在蛋白质翻译及翻译后进行的转运过程中起蓖要作用。结直肠癌细胞和组织中PDI表达下降，可能与其限制蛋白质的正常合成有关。SMS表达下降可能与其减少氨基酸合成和代谢有关。C1S和CD46可能通过参与补体系统调节在胃癌转移中起一定作用。2.4基因芯片技术在老年性聋研究中的应用6DNA突变是老年性聋产生的原因之一。检测基因突变对于阐明老年性聋的分子机制以及疾病的早期诊断具有重要意义。将DNA芯片用于检测分子突变，不仅可准确地确定突变位点和突变类型，更主要的是它的快速高效是其他方法无法比拟的，它可以同时检测多个基因乃至整个基因组的突

15、变。Rodriguez等利用先天性引物延伸芯片比较94例早发性老年性聋患者和50例正常，以人的基因序列变异频率，以寻找与老年性聋相关的基因。该芯片包含8个耳聋相关基因(GJB2，GJB6，GJB3，G耳聋SLC26A4，SLC26A5，12SrRNA和tRNASer)的198个突研究结果显示，老年性聋组和正常对照组等位基因的碱基改变分别为117和10，正常人和早发性老年性聋患者间没有统计学差异。在老年性聋组，这些碱基改变仅发生在GJB2和SLC26A4基因中。但还发现，携带两个GJB2轻度突变体的个体发生早发性老年性聋的危险有可能增加。利用基因芯片技术筛选老年性聋相关基因，探讨老年性聋的发病机

16、制，最终目的都是为了指导老年性聋的早期诊断、预防和治疗。由于感音神经性耳聋病变的不可逆性，疾病的预防就显得尤为重要。目前，利用基因芯片技术研究老年性聋预防的报道尚不多见。细胞凋亡是哺乳动物老年性聋的一个重要机制，Someya等引研究结果显示，热量限制可以明显降低小鼠耳蜗TUNEL阳性细胞和c鹪puse-3阳性细胞数量；基因芯片微阵列分析显示，热量限制可使24种细胞凋亡基因下调，包括Bak和Bim。以上研究结果表明，热量限制可以通过抑制内耳组织的细胞凋亡减慢老年性聋的发展进程。该研究为老年性聋的预防知识提供了实验依据。2.5基因芯片技术在乙型肝炎病毒耐药和分型检测中的价值7黄文瑶等人研究应用基因

17、芯片技术同时检测拉米夫定和阿德福韦的敏感及耐药检测情况。211例样品中有210例显色判读信号正常，1例无信号，原因可能是DNA拷贝数低于基因芯片的最低检出限。一般来说，慢性HBV感染的病毒拷贝数一般较高(2000IUmL)，而基因芯片检测的病毒拷贝数大于1IUmL，能够适用慢性HBV感染的检测。我们共检测到67例拉米夫定耐药患者，耐药突变类型主要为rtl80M、rt204V和204I，没有检出阿德福韦者。检测情况与测序结果相比，一致性很好，证明基因芯片检测有很高的准确度及特异性。此外，本实验采用PCR和反向点杂交膜芯片技术，针对HBV基因设计3种亚型和耐药突变位点的探针，并固定在固相支援物(硝

18、酸纤维素膜或尼龙膜)上，然后以标记了生物素的引物扩增该区段序列，其PCR产物与膜条上的探针进行杂交，再通过过氧化物酶(POD)和TMB(四甲基联苯胺)的显色反应即可进行检测。检测结果可直接用肉眼分辨，操作简便、快捷且成本低。2.6基因芯片技术在白血病研究中的应用82.6.1基因芯片技术在复发和预后相关基因检测中的应用复发相关基因检测尽管儿童AI工的治疗有了很大提高，但是复发患儿的预后仍然较差。为了确定复发相关基因并寻求化疗失败的机制，Beesley等用HGul33A基因芯片对11对ALL患儿初诊和复发的骨髓标本进行分析，发现复发者过度表达与细胞生长和增殖及肿瘤生成、药物抵抗代谢有关的基因，并对

19、这些基因进行验证。结果这些基因能够成功地区分初诊和复发时的谱系，同时还发现初诊时高表达这些基因者预后不良。因此可以用基因芯片筛选复发相关基因。预后相关基因检测Winter等应用AU133芯片预测分析了50例初诊并接受肿瘤研究项COG9404治疗的T-m患个基因组成的基因分类子，其中7个基因在治疗失败的患儿和T-ALL耐药细胞株中表达明显增高，被确定为T-ALL耐药的候选基因。为证实结果的可靠性，他们又对接受COG8704项目治疗的42例患儿进行，并成功将惟一l例诱导缓解失败患儿鉴定出来。因此，基因芯片可以预测初诊T-ALL患儿诱导缓解在经结果的可能性，为临床确立诱导缓解方案起到决定性作用。近年

20、来，初诊T-ALL儿童的生存预后状况有显提高，而复发T_ALL儿童的生存预后仍然较差。Gottardo等用寡核苷酸芯片分析了患儿的基因表达谱，确定了3个与凋亡和细胞增殖有关的新基因：CFLAR、NOTCH2、BTG3；又对L患儿的患儿进行验证，结果发现被归属到不良预后结果一组的患儿有明显增高的累积复发率和更差的五年生存率。因此基因芯片能够用于发现与T-ALL患儿预关的新基因。2.7基因芯片技术在分子营养学上的应用9分子营养学的研究方法主要有分子遗传学方法、分子流行病学方法、生物化学方法和细胞生物学方法。近年来，基因芯片、反转录PCR、蛋白质组学等技术已成为营养学家和相关科研工作者的有力研究工具

21、。虽然基因芯片技术的发展时间不长，目前在营养学上的应用尚处在初始阶段，但是由于基因芯片技术具有快速准确、高度重复性、微型化和自动化等传统营养学研究无法比拟的优点，其在营养学上的应用前景具有非常大的潜力。基因芯片技术应用于分子营养学研究主要体现在以下两个方面。2.7.1探讨营养素对基因表达的控制作用基因芯片技术可以在分子水平监测多达数千乃至整个基因组所有基因的表达，可以检测营养素对整个细胞、组织甚至整个系统及作用方式上的影响。第二军医大学实验室利用DNA芯片技术分析并克隆了缺锌新生小鼠脑特异性表达基因，经不同锌水平饲料喂养后，仔鼠脑组织产生特异性的表达基因，将其脑组织进行DNA芯片(该芯片含有1

22、4000个来自于人体多种不同组织的基因)分析，发现5个锌上调基因，3个锌下调基因，其中5个为已知基因，3个查不到与已知小鼠基因的同源序列，未知基因其功能日前尚处于进一步的研究中。角化的细胞生长因子(keratinocytegrowthfactor，KGFCF-7)是组成纤维细胞生长因子家族中的一员，开始被认为是细胞牛长分化的旁泌性调节因子。而维生素D能抑制某些生长因子。为明确维生素D是否参与FGF-7的表达，Lyakhovich等1应片技术检测1，25一二羟维生素D，处理过的乳腺癌细胞的FGF-7表达，发现无论在mRNA水平还是在蛋白水平都有明显的增加，从而首次揭示了维生素D可能通过调节FGF

23、-7的表达而调节细胞的生长分化。Rao等81采用微阵列芯片对低硒饮食的C578小鼠小肠的基因表达进行检测，对照为高硒饮食组84个基因的表达量增加两倍，而48个基因表达减少了75，其中高表达的主要有关DNA损伤氧化诱导基因、细胞增殖基因，表达减少的主要有谷胱甘肽过氧化物酶、P4503A1、289等，结果表明硒含量可能调节与肿瘤有关的多余途径。Kim等一。发现两位同胞兄弟的德国患者患有夜旨及轻度视黄醛缺乏，但无维生素A缺乏的其他临床症状，血浆中protei视黄醛结合蛋白(retinaldehydebindRBP)含量较少，血浆视黄醛明显降低，但患者的生理功能及生长未受影响，并发现该患者的RBP基因

24、存在两处点突变，如利用DNA芯片技术检测其RBP基因存在的两处突变，就町以在早期患者无I晦床症状时发现患者缺乏维生素A，从而达到早期诊断、早期治疗的。2.7.2阐明营养相关疾病的分子机制利用基因芯片技术研究营养素与基因表达之间的关系，为揭示抗病和预防机制提供了理论依据。如营养与肿瘤相关基阒表达的研究(抑癌基闪表达与突变)；营养与心脑IfIL管疾病关系的分子学研究；营养与高血压、糖尿病和免疫系统的分子水平研究等。3 结语 基因芯片技术是一种快速、高效的核酸分析手段，它的出现给分子生物学、细胞生物学及医学领域带来了新的革命，成为后基因组时代最重要的基因功能分析技术之一。笔者认为，目前影响基因芯片技

25、术广泛使用的主要因素是:基因芯片制备比较复杂，除了使用已经商品化的少数几种基因芯片外，科研人员要制备适合于自己科研课题的墓因芯片比较困难，因而开发更为简便，成本较低，适合于科研人员操作的墓因芯片制备技术是当前的迫切任务。另外，商品化的基因芯片价格昂贵，分析检测设备的成本较高也影响了墓因芯片技术的推广。故此，今后需要在降低成本方面加强研究。在基因芯片技术本身的发展方面，笔者认为进一步微型化以及提高检测的分辫率和准确性是今后的发展方向。10参考文献1. 国外医学临床生物化学与检验学分册 2002年第 23卷第 1期 7页2. 国际检验医学杂志2006年3月第27卷第3期249页3. Chin j

26、Ocu1 Fundus Dis, July 2003, Vol 19 NO. 4，中华眼底病杂志2003年7月第19卷第4期 260页4. J Int Oncol , October 2009,Vol.36,No.10, 728页国际肿瘤学杂志2009年10月第36卷第10期5. 中华消化杂志2009年10月第29卷第10期689页Chin j Dig, October 2009,Vol.29,No.10,6896.中华耳鼻咽喉头颈外科杂志2009年9月第44卷第9期784页7.国际检验医学杂志2009年7月第30卷第7期677页8.国际儿科学杂志2009年11月第36卷第6期583页9.中国临床营养杂志2009年10月第17卷第5期302页10. 国外医学临床生物化学与检验学分册 2002年第 23卷第 1期 9页