细菌的简单染色法和革兰氏染色法

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1、实验一 细菌的简单染色法和革兰氏染色法一、目的要求1. 学习微生物涂片、染色的基本技术，并掌握革兰氏染色的方法。2. 初步认识细菌的形态特征，掌握无菌操作技术。3. 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。二、基本原理1. 简单染色法：用单一染料进行细菌染色， 操作简便，适于菌体一般形状和细菌排列的观察。 常用碱性染料 进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱碱性溶液中，细 菌细胞通常带 负电荷 ，而碱性染料在电离时， 其分子的染色部分带正电荷 (酸性 染料电离时， 其分子的染色部分带正电荷) ，因此碱性染料的染色部分很容易与 细菌结合使细菌着色， 经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明

2、的对比， 在显微镜下 易于识别。常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。2. 革兰氏染色法 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是 1884 年由丹麦医生Gram创立的。革兰氏染色法(Gram stain)不仅能观察到细菌的形态特征而且还 可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用 G+ 表示；染色反应呈红色(复染颜色)的称为革兰氏染色阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同造成的。 革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中， 当用乙醇处理时， 由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，

3、 通透性降低， 使结晶 紫碘复合物被保留在细胞内而不易着色， 因此， 呈现蓝紫色； 革兰氏阴性细菌 的细胞壁中肽聚糖含量低， 而脂类物质含量高， 当用乙醇处理时， 脂类物质溶解， 细胞壁的通透性增加， 使结晶紫碘复合物易被乙醇抽出而脱色， 然后又被染上 了复染液(番红)的颜色，因此呈现红色。革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料(basic dye)初染液；媒染剂(morda nt);脱色剂(decolorisi ng age n)和复染液(cou ntersta in)。碱性染料的 作用象在细菌的简单染色法基本原理中所述的那样， 而用于革兰氏染色的初染液 一般是结晶紫(crystal vio

4、let)。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和力或附 着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上， 使不易脱落， 不同类型的细胞脱色 反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95%的酒精(ethanol)。复染液也是一种碱性染料， 其颜色不同于初染液， 复染的目的是使被脱色的细胞染上 不同于初染液的颜色， 而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色， 从而将细胞区分 成 G 和 G 两大类群，常用的复染液是番红。三、器材大肠杆菌(Escherichia coli),金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,枯草芽 抱杆菌(Bacillus subtilis)，藤黄微球菌(Micr

5、ococcus luteus)，蜡样芽抱杆菌(B. cereu91220h斜面培养物；革兰氏染液，载玻片，显微镜等。四、操作步骤1. 涂片 取两块载玻片，各滴一小滴蒸馏水于玻片中央，用接种环以无菌 操作分别从培养1416h的枯草芽抱杆菌和培养24h的大肠杆菌的斜面上挑取少 量菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。载玻片要洁净无油迹；滴蒸馏水和取菌不宜过多；涂片要均匀，不宜过厚。2. 干燥 室温自然干燥。3. 固定 固定时通过火焰 2 3次即可。此过程称热固定，其目的是使细胞 质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。热固定温度不易过高，以载玻片背面不烫手为宜，否则会改变甚至破坏细 胞形态。4.

6、 染色（1 ）简单染色法： 染色 滴加染液于涂片上 （ 染液刚好覆盖涂片薄膜为宜 ）。吕氏碱性美蓝染 色12min;石炭酸复红或草酸铵结晶紫染色约 1min。 水洗 倾去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。 水洗时，不要直接冲洗液面，而应使水从载玻片的一段流下，水流不易过急过大，以免涂片薄膜脱落。 干燥 自然干燥或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。 镜检 涂片干燥后镜检。（2）革兰氏染色法： 初染加草酸铵结晶紫一滴，约12min，水洗。 媒染 滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min,水洗。 脱色 将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用 95酒精滴洗至流出 酒精刚刚不出现蓝色时为止，约 2

7、030s,立即用水冲净酒精。 复染用番红液染12min，水洗。 镜检 干燥后， 置油镜下观察。 革兰氏阴性菌呈红色， 革兰氏阳性菌呈紫 色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。（3）混合涂片法：按上述方法， 在同一玻片上， 以大肠杆菌和枯草芽抱杆菌或金黄色葡萄球菌混合 涂片、染色、镜检进行比较。革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度， 如脱色过度， 则阳性菌可被 误染为阴性菌;而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染 色结果， 如阳性菌培养时间过长， 或已死亡及部分菌自行溶解了， 都常呈阴性反 应。实验二 细菌的芽孢和荚膜染色法一、实验目的1.

8、学习并掌握芽孢和荚膜染色法2. 初步了解芽孢和荚膜的形态。二、基本原理芽抱又叫内生抱子(endosopre,是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的 休眠体， 通常呈圆形或椭圆形。 细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、 芽孢在芽孢 囊内的位置、芽抱囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。芽抱染色法是利用细菌的芽抱和菌体对染料的亲和力不同的原理， 用不同染 料进行着色， 使芽抱和菌体呈不同的颜色而便于区别。 芽抱壁厚、透性低，着色、 脱色均较困难，因此，当先用弱碱性染料，如孔雀绿(malachite greer)或碱性品红(basic fuchsin)在加热条件下进行染色时，此染料不仅可进入菌体，而且

9、也可进入芽抱，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽抱的染料则难以透出， 若再用复染液(如番红液)或衬托溶液(如黑色素溶液)处理，则菌体和芽抱易 于区分。荚膜是包围在细菌细胞外面的一层粘液性物质， 其主要成分是多糖类， 不易 染色，故常用衬托染色法， 即将菌体和背景着色， 而把不着色且透明的荚膜衬托 出来。荚膜很薄，易变形，因此，制片时一般不用热固定。三、器材枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)，腊样芽抱杆菌(B. cereuS)，球形芽抱 杆菌(B. sphaericu，生抱梭菌 (Clostridium sporogenes ;圆褐固氮菌 (Azotobacter chrooc

10、occum)或胶质芽抱杆菌(B. mucilaginosu约2d无氮培养基琼脂斜面培养 物;孔雀绿染液，番红水溶液，苯酚品红溶液，黑色素溶液。荚膜染色液：绘图墨水， 1甲基紫水溶液， 1结晶紫水溶液， 6葡萄糖 水溶液， 20硫酸铜水溶液，纯甲醇等。四、操作步骤(一)荚膜染色技术方法一：(1) 将培养 24h 左右的枯草芽抱杆菌或其他芽抱杆菌，作涂片、干燥、固定。(2) 滴加35滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。( 3)用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿沸腾，切忌使染液 蒸干，必要时可添加少许染液。加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约 45min。 这一步也可不加热，改用饱和的孔雀绿水溶液

11、染 10min。( 4)倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再退色为止。(5)用番红水溶液复染1mi n,水洗。( 6)待干燥后，置油镜观察，芽抱呈绿色，菌体呈红色。方法二：（1）取两支洁净的小试管，分别加入 0.2mL 无菌水，再往一管中加入 23 接 种环的腊样芽孢杆菌的菌苔， 另一管中加入 23 接种环的生孢梭菌的菌苔， 两管 中各自充分混合成浓厚的菌悬液。（2）在菌悬液中分别加入 0.2mL 苯酚品红溶液，充分混合后，于沸水浴中加热 35min。（3）用接种环分别取上述混合液 23 环于两载玻片上，涂薄，风干后，将载 玻片稍倾斜于烧杯上，用 95乙醇冲洗至无红色液流出。（4）再用自来水

12、冲洗，滤纸吸干。（5）取 12 接种环黑色素溶液于涂片处，立即展开涂薄，自然风干后，油镜 观察，在淡紫色背景的衬托下，菌体为白色，菌体内的芽孢为红色。（二）荚膜染色技术1. 湿墨水法（1）制备菌和墨水混合液 加一滴水于洁净的载玻片上，然后挑取少量菌体与其 混合均匀。（2）加盖玻片 将一洁净的盖玻片盖在混合液上，然后在盖玻片上放一张滤 纸，轻轻按压以吸去多余的混合液。（3）镜检 用低倍镜和高倍镜观察，若用相差显微镜观察，效果更好。 背景灰色，菌体较暗，在菌体周围呈现明亮的透明圈即为荚膜。2. 干墨水法（1）在载玻片一端滴一滴 6葡萄糖水溶液，取少许培养了 72h 的圆褐固氮 菌在水滴中制成菌悬液

13、，充分混匀。（2）取一滴新配好的黑色素溶液（也可用绘图墨水）与菌悬液混合，另取一 块载玻片作为推片，将推片一端平整的边缘与菌悬液以30角接触后，顺势将菌悬液推向前方，使其成匀薄的一层，风干。（ 3）用纯甲醇固定 1min。（4）加番红液数滴于涂片上，冲去残余的甲醇，并染30s，以细水流适当冲洗，吸干后油镜检查，背景黑色，荚膜无色，细胞红色。3. Anthony 法（ 1）涂片 按常规取菌涂片。（ 2）固定 空气中自然干燥。不可加热干燥固定。（ 3）染色 用 1结晶紫水溶液染色 2min。（ 4）脱色 以 20硫酸铜水溶液冲洗，用吸水纸吸干残液。（ 5 ）镜检 干后用油镜观察菌体染成深紫色，菌体

14、周围的荚膜呈淡紫色。毎細雀对自乍啤舸a?m$ *&诅加阳”山乙“啊丄炀漪如唯阳水初楞男fl阴型壇（e） （皿咏呼 wwh uww）-uwawaww 艸WS0WWBaWTWYWWflM UIS7焰6MM mwwwww Ujiiio w*wwwwww# www （乙）另口 mi 土 如者 才皿j#與TN0即鬃斟亦e乙出烽f（如舉青峯）區皑g BWMDWSB :唯與呵勧Ml咖mmM刚心藩 沁叶嫁肇顾t 电 壷 WMWM （0 I* （）、fizl 。昜驾W 胡干 财 wiz wra ww w -iwwo-o 诫另心os#芮 诫硏任sb W MBMBWsBU0lU0Pn8Sd）MWWS68!6u!jn

15、屮 snieeg）與士阿昇零竺区碱 三 。伽Y3SKWBHMOW 4WWO WKlWWSSSM 乍呗 WMW 师瀚1&玮14m剽。圭显蚀0弭條乎加IW。隔晡咖马咖旳和血曾smw W 聚硏紗osj!芮阴苜剜创硏师妙貝媪詡轨斜r WWWt WOWMO EfB阴询 WMOMWWSWwwww 亘 珈HgA 丑加蚩MfWif阜咖晋臺目时RWMXWM多以甲）旌 碱M纸加刊丄邀乙o-oo-oas?W 田社詡怪錨6防WSSM?W 阴1W書目林MT臭到加亘鱸川叼轴訂“旦黯”KWX、二WSSMMOfllW 丽報圭鳏昭乎仙E煮J 來壷轴目、一WWlQiirWWWWB HW(4) 制片 取一滴菌液于载玻片上的一端，然

16、后将玻片倾斜，使菌液缓缓流向另一端，用 吸水纸吸去玻片下端多余菌液，室温(或37C)自然干燥。干后应尽快染色，不宜放置时间过长。(5) 染色 涂片干燥后，滴加硝酸银染色A液覆盖3-5min用蒸馏水充分洗去A液。用B 液冲去残水后，再加 B液覆盖涂片染色约数秒至1min当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水 冲洗。若加b液后显色较慢，可用微火力n热，直至显褐色时立即水洗。自然干燥。配制合格的染色剂(尤其是B液)、充分洗去A液再加B液、掌握好B液的染色时间均是 鞭毛染色成败的重要环节。(6) 镜检 干后用油镜观察。观察时，可从玻片的一端逐渐移至另一端，有时只在涂片的 一定部位观察到鞭毛。菌体呈深褐色，

17、鞭毛显褐色、通常呈波浪形。2. 改良的LeifsorK染色法(1) 载玻片的准备、菌种材料的准备用硝酸银染色法。(2) 制片 用记号笔在载玻片反面将玻片分成 3-4个等分区，在每一小区的一端放一小滴菌 液。将玻片倾斜，让菌液流到小区的另一端，用滤纸吸去多余的菌液。室温或37C自然干燥。(3) 染色加Leifso氏染色液覆盖第一区的涂面，隔数min后，力卩染液于第二涂面，如此 继续染第三、四区。间隔时间自行议定，其目的是为了确定最佳染色时间。在染色过程中仔细观 察，当整个玻片都出现铁锈色沉淀、染料表面现出金色膜时，即直接用水轻轻冲洗(不要先倾去 染料再冲洗，否则背景不清)。染色时间大约10min

18、自然干燥。(4) 镜检 干后用油镜观察。 菌体和鞭毛均呈红色。(二)运动性观察玻片的准备、菌种材料的准备同鞭毛染色法。1. 压滴法(1) 制片 在洁净载玻片上加一滴无菌水，挑取一环菌液与水混合，再加一环0.01的美蓝 水溶液与其混合均匀。用镊子取一洁净的盖玻片，使其一边与菌液边缘接触，然后将盖玻片慢慢 放下盖在菌液上。观察专性好氧菌时，可在放盖玻片时压入小气泡，以防止细菌因缺氧而停止运 动。(2) 镜检 先用低倍镜找到标本，再用高倍镜观察。也可用油镜观察，用油镜时，盖玻片厚 度不能超过0.17nm观察时，要用略暗光线。有鞭毛细菌可作直线、波浪式或翻滚运动，两个细菌之间出现明显的位移而与布朗运动

19、或随 水流运动区别。2. 悬滴法(1) 涂凡士林 取洁净凹载玻片，在其四周涂少许凡士林。(2) 加菌液 在盖玻片中央滴一小滴菌液。为便于观察时寻找菌液位置，可用记号笔在菌 液周围画上记号。菌液不能加得太多，为了便于观察，也可用接种环挑取一环菌液于盖玻片中央。(3) 盖凹玻片 将凹玻片得凹槽对准盖玻片中心得菌液，并轻轻盖在盖玻片上。轻轻按压 使盖玻片与凹玻片粘合在一起，把液滴封闭在小室中。翻转凹玻片，使菌液滴悬在盖玻片下并位 于凹槽中央。若菌液加得过多，此时菌液就会流到凹玻片上面影响观察。(4) 镜检 先用低倍镜找到标本，并将液滴移至视野中央，然后用高倍镜观察。若用油镜 观察，盖玻片厚度不能超过

20、0.17nm并要十分细心，以免压卒盖玻片、损伤镜头。观察过程要在略暗的光线下进行。实验四 酵母菌的形态观察及死、活细胞的鉴别实验要求1. 观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死、活细胞的染色方法。2. 掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。二、基本原理酵母菌是多形的、不运动的单细胞微生物， 细胞核与细胞质已有明显的分化， 其大小通常比常见细菌大几倍甚至几十倍。 繁殖方式也比较复杂， 无性繁殖主要 是出芽生殖， 仅裂殖酵母属是以分裂方式繁殖； 有性繁殖是通过接合产生子囊孢 子。本实验通过用美蓝染色制成水浸片和水碘水浸片来观察生活的酵母形态和 出芽生殖方式。美蓝是一种无毒性染料， 它

21、的氧化型是蓝色的， 而还原型是无色的 ，用它来 对酵母的活细胞进行染色， 由于细胞中新陈代谢的作用， 使细胞内具有较强的还 原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以 酵母的活细胞无色 ， 而对于 死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱， 而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。 因此，用美蓝水浸片不仅可以观察酵母的形态， 还 可以区分死、活细胞。但美蓝的浓度、作用时间等均有影响，应加注意。三、器材酿酒酵母（Saccharomyces cervisiae或卡尔酵母（S. calsbergensiS ; 0.05%, 0.1%吕氏碱性美蓝染液，革兰氏染色用的碘液；显微镜，载玻片

22、，盖玻片等。四、操作步骤1. 美蓝浸片观察（ 1）在载玻片中央滴加 1 滴 0.1吕氏碱性美蓝染液,液滴不可过多或过少, 以免盖上盖玻片时, 溢出或留有气泡。 然后按无菌操作法取在豆芽汁琼脂斜面上 培养 48h 的酿酒酵母少许,放在吕氏碱性美蓝染液中,使菌体与染液均匀混合。（ 2 ）用镊子夹盖玻片一块,小心地盖在液滴上。盖片时应注意,不能将盖玻片平 放上去,应先将盖玻片地一边与液滴接触,然后将整个盖玻片慢慢放下,这样可以 避免产生气泡。（ 3）将制好地水浸片放置 3min 后镜检。先用低倍镜观察, 然后换用高倍镜观 察酿酒酵母的形态和出芽情况,同时可以根据是否染上颜色来区别死、活细胞。（4）染

23、色0.5h后，再观察一下死细胞数目是否增加。（ 5）用 0.05吕氏碱性美蓝染液重复上述的操作。2. 水碘浸片观察在载玻片中央滴一滴革兰氏染色用的碘液， 然后再在其上加三滴水， 取酿酒 酵母少许，放在水碘液滴中，使菌体与溶液混匀，盖上盖玻片后镜检。实验五细菌、放线菌、酵母及其它真菌菌落的比较及微观形态观察、目的要求1. 观察细菌、放线菌、酵母、青霉和平菇菌丝等代表种类的菌落形态特征。2. 观察细菌、放线菌、酵母、青霉和平菇菌丝等代表种类的菌体的微观特征。3. 学习描述菌落特征的方法。二、基本原理菌落形态是指某种微生物在一定的培养基上由单个菌体形成的群体形态。细菌、 放线菌、酵母、霉菌和食用菌，

24、每一种微生物在一定的培养条件下形成的菌落各具有 某些相对的特征，利用观察这些特征，来区分各大类微生物及初步识别、鉴定微生物， 方法简便快速，在科研和生产中常被应用。微观特征是鉴定微生物种类的主要依据，通过显微观察可以了解四大类微生物的主 要特征。三、器材圆褐固氮菌或大肠杆菌，枯草芽胞杆菌，灰色链霉菌，酿酒酵母，青霉或其 它霉菌，平菇或其它食用菌菌丝体。载玻片，盖玻片，无菌水滴瓶，酒精灯，接种环、接种钩、显微镜等。四、操作步骤1. 菌落形态观察观察比较圆褐固氮菌或大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、灰色链霉菌、酿酒酵母、 青霉或其它霉菌、 平菇或其它食用菌菌丝体在平板培养基上形成的菌落特征， 按 照下列菌落

25、描述的方法记录结果。（1）大小：大、中、小。或用十字交叉法测量菌落直径。（2）形态：圆形、不规则形。（3）干湿：干燥、湿润、粘稠。（4）高度：扁平、隆起、凹下。（5）透明度：透明、半透明、不透明。（6）颜色：白色、乳白色、黄色、金黄色、绿色、红色、褐色等。中间与边缘有无 区别。（7）边缘：整齐、不整齐。2. 菌落微观形态观察（1）取细菌固定玻片，用油镜观察细菌的形态。（2）取放线菌固定玻片，用低倍镜和高倍镜观察放线菌的形态。（3）取酵母菌固定玻片，用低倍镜和高倍镜观察放线菌的形态。（4）取青霉或黑曲霉固定玻片，用低倍镜和高倍镜观察其菌丝和分生孢子梗的 形态。（5）挑取少量平菇或其它食用菌的菌丝

26、体， 用低倍镜和高倍镜观察其形态， 观察有无锁状联合。边观察，边用铅笔绘图。左眼观察视野，右眼观察图纸。实验六 细菌和放线菌培养基的制备 培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用 以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。在自然界中，微生物种 类繁多，营养类型多样，加之实验和研究目的不同，所以培养基种类很多。培养 基可以为微生物生长、繁殖提供充足的水分、碳源、氮源、能源、无机盐和生长 因子等，不同微生物对 pH 要求不同，酵母和霉菌一般的培养基一般是偏酸性的， 而细菌和放线菌的培养基一般是偏碱性的，所以配制培养基时需要调整 pH 值。根据培养基的成分不同， 培

27、养基可 以分为天然培 养基、 合成培养基和半合成 培养基；根据培养基的物理状态可以分为固体培养基、 半固体培养基和液体培养 基；根据培养基的用途可以分为基础培养基、 加富培养基、 鉴别培养基和选择培 养基。本实验主要学习制备培养细菌和放线菌的 2 种培养基。一、牛肉膏蛋白胨培养基（培养细菌用）（一）目的要求1. 明确培 养基 的配制原理。2. 掌握配制培养基的一般方法和步骤。（二）基本原理 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普遍的细菌基础培养基， ，由于 这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质， 培养基中的牛 肉膏主要为微生物生长提供碳源、 能源、磷酸盐和维生素， 蛋白胨

28、主要提供氮源 和维生素，而 NaCl 提供无机盐，琼脂作凝固剂。琼脂在常用浓度下（ 1.5%2%） 下96C时溶化，在45C时凝固，通常不被微生物分解利用。由于这种培养基多用于培养细菌，因此要用稀酸或稀碱将其 pH 调至中性或 微碱性，以利于细菌的生长繁殖。牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：牛肉膏3.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g琼脂20g水1000mLpH7.47.6三）器材1、溶液或试剂：牛肉膏，蛋白胨，NaCI，琼脂，1mol/LNaOH , 1mol/LHCI。2、仪器或其它用具：试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装装置， 天平，药匙，高压蒸汽灭菌锅，pH试纸（pH5.59.0

29、），棉花，报纸或牛皮纸， 记号笔，线绳或尼龙绳，纱布等。（四）操作步骤1. 称量 按照培养基配方比例依次称取牛肉膏、蛋白胨、 NaCl 放入烧杯中。 注意牛肉膏常用玻棒挑取， 放在小烧杯或培养皿中称量， 用热水溶化后倒入烧杯； 蛋白胨易吸潮，在称取时动作要迅速；严防药品混杂，一把药匙用于一种药品， 或称取一种药品后，洗净插干，再称取另一种药品。瓶盖也不要盖错。2. 溶化 在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然好在石棉 网上加热使其溶解， 或在磁力搅拌器上加热溶解。 将药品完全溶解后， 补充水到 所需总体积，将称好的琼脂加入后，再加热溶化。加热时要用玻棒不断搅拌，防 止糊锅或溢出。

30、最后补足所损失的水分。 如果是制备三角瓶盛固体培养基时， 可 以先将一定量的液体培养基装入三角瓶， 再按比例加入琼脂， 不必加热溶化， 而 是加热和溶化同步进行，节省时间3. 调pH先用精密试纸测量培养基的原始 pH，如果偏酸，用滴管向培养基 中逐滴加入1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH,直至pH达 到7.6。反之，用1mol/LHCl进行调节。对于有些要求pH较精确的微生物或实验，其pH的调节可以用酸度计进行。4. 过滤趁热用4层纱布过滤，以利某些实验结果的观察。一般没有特殊要 求的情况下，这一步可以省去（本实验不需过滤）。5. 分装 按实验要求，可将配制的培养基装入

31、三角瓶或试管内。 分装试管时， 分装量为试管总长的1/51/4，灭菌后制成斜面。分装三角瓶的量以不超过三角 瓶容积的一半为宜。注意分装速度要迅速，防止培养基凝固；不要将培养基溅到 管（瓶）口，以免沾污棉塞而引起污染。6. 加棉塞 培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口塞上棉塞（或泡沫塑料 塞及试管帽等）。棉塞要求松紧适度，既能阻止外界微生物进入而引起污染，又 能够保证有良好的通气性能。正确地棉塞要求形状、大小、 松紧与试管口（或三角瓶口）完 全适合，过紧则妨碍空气流通， 操作也不便；过松则达不到滤菌 的目的。加塞时，大头朝外，试 管内塞入2/3,试管外留1/3。手 提棉塞，试管不下落为不松，拔

32、掉棉塞时不发出较大声响为不 紧。棉塞制作过程如图2.1所示。三角瓶封口可以用棉塞，也 可以用8层纱布重叠而成。7. 包扎 加塞后，取7支同样规图2.1棉塞的制作过程示意图格的试管，棉塞顶端用双层报纸或1层牛皮纸覆盖，再用线绳或尼龙绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期 等。三角瓶加塞后直接覆盖双层报纸或 1层牛皮纸，用同样的方法扎好。&灭菌将上述培养基在在压力0.11MPa,温度121C条件下灭菌2030min。 如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。9. 摆放斜面 灭菌结束后，应使压力自然降低至 0时，打开锅盖，将锅盖错 开一条10几cm的缝隙，利用锅体余热将报纸和棉塞烘干，然后

33、去掉锅盖，当培养基温度降至5060C时取出，摆放斜面。将有棉塞的一端搁在玻棒或小木条 上，斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。10. 无菌检查随机抽取几把冷却凝固后的培养基，放在37C的温箱中培养2448h,以检查灭菌是否彻底。二、高氏（Gause）1号培养基（培养放线菌用）（一）目的要求1. 明确培的配制原理。2. 掌握配制培养基的一般方法和步骤。（二）基本原理高氏1号培养基是分离和培养放线菌的合成培养基。 这种培 养基是 由可溶性 淀粉（作为碳源），KNO3 （作为氮源）、NaCl、K2HPO4?3H2O、MgSO4?7H2O（作为无机盐，提供钠、钾、磷、镁、硫等离子）和FeSQ?7H2O

34、（作为微量元素， 提供铁离子 ）等组成。由于磷酸盐和镁盐相混合时产生沉淀，因此，在混合培养 基成分时，一般是按配方的顺序依次溶解各成分。对于象FeSO4?7H2O 这样的微量成分，则可预先配成高浓度的贮备液，在配制培养基时按需要加入一定的量。高氏 1 号培养基配方如下：可溶性淀粉20 gKNO31 gNaCl0.5 gK2HPO4?3H2O0.5 gMgSO4?7H2O0.5 gFeSO4?7H2O0.01 g琼脂20 g水1000mLpH7.47.6（三）器材可溶性淀粉， KNO3， NaCl， K2HPO4?3H2O， MgSO4?7H2O 和 FeSO4?7H2O， 琼脂， 1mol/L

35、NaOH ， 1mol/LHCl 。试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装装置，天平，药匙，高压蒸 汽灭菌锅，pH试纸（pH5.59.0）,棉花，报纸或牛皮纸，记号笔，线绳或尼 龙绳，纱布等。（四）操作步骤1. 称量和溶化 按配方先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将淀粉调成糊状，再加入少于所需水量的沸水中， 继续加热， 使可溶性淀粉完全溶化。 再称取其它 各成分依次逐一溶化。 对微量成分 FeSO4?7H2O 可先配成高浓度的贮备液后再加 入，方法是先在100mL水中加入1g的FeSO4?7fO配成0.01g/mL,再在1000mL 培养基中加入 1mL 的 0.01g/mL 的

36、贮备液即可。待所有药品完全溶解后，补充水 分到所需的总体积。如要配制固体培养基，则先加入琼脂溶化后再加其它物质。2. pH 调节、分装、包扎、灭菌及无菌检查同前。实验七 真菌分离和培养用培养基的制备一、马丁氏（ Martin ）培养基（分离真菌用）（一）目的要求通过对分离真菌用的马丁氏（Martin）培养基配制，掌握对选择培养基的配 制方法，并明确选择的原理。（二）基本原理马丁氏培养基是 一种用来分离真菌的选择性培养基。此培 养基是 由葡萄糖、 蛋白胨、KH2PO4、MgSO4?7H2O、孟加拉红（玫瑰红，Rose Benga）和链霉素 等组成。其中葡萄糖主要作为碳源，蛋白胨主要作为氮源，KH

37、2PO4和MgSO4?7H2O 作为无机盐，为微生物提供钾、磷、镁离子。而孟加拉红和链霉素 主要是细菌和放线菌的抑制剂， 对真菌无抑制作用， 因而真菌在这种培养基上可 以达到优势生长，从而达到分离真菌的目的。马丁氏培养基配方如下：KH2PO4MgSO4?7H2O 蛋白胨 葡萄糖 琼脂 水 pH1g0.5g5g10g15-20g1000mL自然此培养液 1000mL 加 1%孟加拉红 1%水溶液 3.3mL 。临用时每 100mL 培养 基中加入 1%链霉素液 0.3mL。（三）器材KH2PO4、MgSO4?7H20、蛋白胨、葡萄糖、琼脂、孟加拉红、链霉素。 试管、玻棒、铝锅、量筒、培养基分装装

38、置、天平、药匙、高压灭菌锅等。（四）操作步骤1、称量和溶化 按培养基配方， 准确称取各成分， 并将各成分依次溶化在少 于所需要的水量中。 待各成分完全溶化后， 补足水分到所需体积。 再将孟加拉红 配成1%的水溶液，在1000mL培养液中加入1%的孟加拉红溶液303mL,混匀 后加入琼脂加热溶化。2、分装、包扎、灭菌及无菌检查同实验六。3、链霉素加入 由于链霉素受热容易分解， 所以临用时将培养基溶化后待温 度降至45C左右时才能加入。可先将链霉素配成 1%的溶液，在100mL培养基 中加1%链霉素液0.3mL，使每mL培养基中含链霉素30微g。二、马铃薯葡萄糖培养基（简称 PDA 培养基，培养真

39、菌用）（一）目的要求通过对培养真菌用的 PDA 培养基配制，掌握对半合成培养基的配制方法， 并明确选择的原理。（二）基本原理马丁氏培养基是 一种用来培养真菌的半合成培养基。此培 养基是 由马铃薯、 葡萄糖、琼脂等组成。 其中马铃薯煮汁可以提供碳源、 氮源、无机盐和维生素等， 葡萄糖主要作为碳源，琼脂为凝固剂。马铃薯的表皮中含有龙葵碱的化学成分， 对菌丝生长有抑制作用，所以马铃薯在使用时要去皮。在 PDA 培养基上大多数 真菌都可良好生长。在 PDA 培养基基础上，可以添加一些其它物质，使培养基 营养更为丰富和全面， 真菌菌丝可以生长的更好。 如综合 PDA 培养基就是在 PDA 基础上添加0.

40、3%的KH2PO4和0.15%的MgSO4?7H2O以及微量的维生素B1而配 制而成的。 由于多数真菌喜欢偏酸性环境， 而培养基灭菌过程中部分糖类会转变 为酸，所以一般不需要调 pH 值。如果是培养对酸碱度有特殊要求的真菌，可以 用稀盐酸或稀氢氧化钠调节。PDA 培养基配方如下：马铃薯（去皮）200g葡萄糖20g琼脂15-20g水1000mLpH自然）器材马铃薯、葡萄糖、琼脂等。小刀，试管、玻棒、铝锅、量筒、培养基分装装置、天平、药匙、纱布、高 压灭菌锅等。（四）操作步骤1. 马铃薯煮汁的制备将马铃薯洗净去皮，称量200g,用小刀切成长、宽为2cm,厚度为35mm 的土豆片，要求大小厚薄均匀。

41、在 1000mL水中煮沸1520min,煮至无白心为 止。用 46层纱布过滤,补充水分至 1000mL。2. 葡萄糖和琼脂的称量与溶化称取1520g琼脂，加入土豆汁中，继续加热，并不断搅拌，当琼脂充分溶 化后，加入葡萄糖，搅拌直至完全溶化。3. 分装、加棉塞、捆把、灭菌及灭菌同前。实验八 微生物的液体培养一、基本要求1. 掌握微生物液体发酵培养基的制作方法。2. 了解常见微生物液体培养的原理和方法二、基本原理固体发酵生产是将原料及菌体吸附在疏松的固体支持物上， 通过微生物的代 谢活动，使发酵原料转化成发酵产品。 优点是设备简单， 不需要结构复杂的发酵 罐；方法简单， 类似传统的制曲法； 能耗低

42、，不需要大量通气和搅拌； 原料粗放， 可用很多种其它发酵工艺无法利用的工农业副产品作原料； 不易染菌，因霉菌能 在水分较低的基质表面增殖而细菌不易生长； 产物回收所消耗溶剂和所产生废水 较少。其缺点是：设备占地面积多，劳动强度大，传质和传热困难，产率和收率 低，副产物多，培养过程进行检测困难。液体发酵生产是将发酵原料制成液体培养基，接种微生物， 通过其代谢活 动，使发酵原料转化成发酵产品。 液体发酵有表面发酵和深层发酵两种方式， 其 中深层发酵是发酵生产的主要方式。 表面发酵是在缺乏通气装置的情况下， 对一 些生长快速的微生物进行好氧静置培养。 这种发酵通常在表面形成菌膜层。 表面 发酵的优点

43、是设备简单，能耗低，原料粗放；其缺点是占地面积多，劳动强度大， 发酵时间长。深层发酵是微生物的菌体或菌丝均匀分散在液体培养基中，通过向培养液强制通气或不通气进行产物合成的发酵。 深层发酵的优点如下：占地面积小少，生 产规模大；发酵速度快，生产效率高；生产机械化，易于自动控制，劳动生产率 高；发酵设备密闭，传热传质好，生产便于管理；有利于产品提取，所得产品质 量高。其缺点是设备条件要求较高。摇瓶培养是一种在实验室进行制种、菌种筛选、性能鉴定、培养基优化时最 常用到的一种试验方法。特别是在菌种的生产中，液体发酵 菌种有着明显的优点，菌龄一致，延滞期短，便于接种等优 点。三、器材黑曲霉、裂褶菌、大肠

44、杆菌 ；PDA液体培养基、肉膏 蛋白胨液体培养基；250mL三角瓶；无菌水；摇床；超净工 作台；纱布等。四、操作步骤1. 菌种的活化：将斜面保存菌种活化12次，黑曲霉培 养25d，使其产生抱子。方法一：将裂褶菌斜面菌种活化23次，取培养4d的斜面菌种刮取菌苔，用无菌生理盐水进行稀释成菌悬液，备用。图2.2液体接种操作示意图方法二：将活化菌种接种子液体培养基培养 3d，再转接到发酵液体培养基，培养6d。2. 黑曲霉菌悬液的制备：用无菌水洗下黑曲霉的抱子制成菌悬液。然后吸 取2mL如图2.2所示接入液体发酵培养基中。3. 摇瓶发酵培养各组实验均取250mL锥形瓶若干，编号后，分别加入上述摇瓶培养基

45、80mL 于0.8 kg/cm2灭菌20min，冷却后分别接种种子液5mL;培养温度24C ;静置培 养1d后，振荡培养68d，摇床转速180rpm/min.4. 观察与测定(1) 菌丝体干重的测定 收取的发酵醪以2500rpm离心或过滤获得菌丝球， 70C烘干至恒重，以每100mL发酵醪中菌丝体干重(g/100mL)计。(2) 菌丝和菌丝球的观察观察菌丝球生长情况，大小、质地、颜色、内 部情况。挑取菌丝，在显微镜下观察菌丝生长情况。(3) 染菌检测 观察发酵液的色泽、气味、固液相状况；培养液涂片，Loffler 碱性美蓝单染色，镜检。同时，用牛肉膏蛋白胨培养基培养24- 48h检查染菌菌 落

46、。实验九 微生物的分离与纯化一、实验目的掌握倒平板的方法和几种分离纯化微生物的基本操作技术二、基本原理在土壤、水、空气或人及动、植物体中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活 在一起，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离它，以 得到只含有这一种微生物的纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件 要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑 制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀 释混合倒平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生

47、物，直至得到纯菌株。土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微生物无论是数量和种类都是极其多 样的，因此，土壤是我们开发利用微生物资源的重要基地，可以从其中分离、纯化到 许多有用的菌株。三、器材高氏1号琼脂培养基，肉膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基，盛9mL无菌 水的试管，盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接 种环， 10酚，无菌培养皿，链霉素，土样等。四、操作步骤1. 稀释涂布平板法(1) 倒平板 将肉膏蛋白胨培养基、高氏1 号琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基溶 化，待冷至5560C时，向高氏1号琼脂培养基中加入10%酚数滴，向马丁氏培养基 中加入链霉素溶液，使每

48、mL培养基中含链霉素30卩。然后分别倒平板，每种培养基 制三皿，其方法是右手持盛培养基的试管或三角瓶，置火焰旁边，左手拿平皿并松动 试管塞或瓶塞，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出，如果试管内或三角烧瓶内的培 养基一次可用完，则管塞或瓶塞不必夹在手指中。试管(瓶)口在火焰上灭菌，然后左 手将培养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15mL，加盖后轻轻摇动培养 皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待凝后即成平板。也可将平皿放在火焰附近 的桌面上，用左手的食指和中指夹住管塞并打开培养皿，再注入培养基，摇匀后制成 平板，最好是将平板放室温23d,或23C培养24h,检查无菌落及皿盖无冷凝水后再 使

49、用。(2) 制备土壤稀释液 称取土样10g,放入盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角 烧瓶中，振摇约20mi n,使土样与水充分混合，将菌分散。用一支1mL无菌吸管从中 吸取1mL 土壤菌悬液注入盛有9mL无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混匀。然后 再用一支1mL无菌吸管从此试管中吸取1mL注入另一盛有9mL无菌水的试管中，以 此类推制成 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6各种稀释度的土壤溶液。(3) 涂布 将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上 10-4、10-5、10-6 三种稀释度，然后用三支1mL无菌吸管分别由10-4、10-5、1O6三管土壤稀释液中各吸

50、 取0.2mL对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂布棒在培养基表面轻轻的涂 布均匀，如图 2.3所示。图2.3 从土壤中分离微生物的操作过程示意图(4) 培养 将高氏1号培养基和马丁氏培养基平板倒置于28C温室中培养35d, 肉膏蛋白胨平板倒置于37C温室中培养23c。(5) 挑菌 将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到上述三种培养基的斜面上， 分别置28C和37C温室中培养，待菌苔长出后，检查菌苔是否单纯，也可用显微镜 涂片染色检查是否是单一的微生物，若有其他杂菌混杂，就要再一次进行分离、纯化， 直到获得纯培养。整个分离过程见图2. 稀释混合平板法此法与稀释涂布平板法基本相同，无菌操作也

51、一样，所不同的是先分别吸取 O.5mL104、10-5、10-6稀释度的土壤悬液对号放入平皿，然后再倒入溶化后冷却到45C 左右的培养基，边倒入边摇匀，使样品中的微生物与培养基混合均匀，待冷凝成平板 后，分别倒置于28C和37C温室中培养后，再挑取单菌落，直至获得纯培养。3. 平板划线分离法(1) 按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称。(2) 划线 在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述101的土壤悬液 一环在平板上划线。戈懺的方法很多，但无论哪种方法划线，其目的都是通过划线将 样品在平板上进行稀释，使形成单个菌落。常用的划线方法有下列两种： 用接种环以无菌操作挑取土壤悬液

52、一环，先在平板培养基的一边作第一次平行 划线34条，再转动培养皿约70角，并将接种环剩余物烧掉，待冷却后通过第一次 划线的部分作第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线的部分作第三次平行划 线和通过第三次平行划线的部分作第四次平行划线。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于 温室培养。 将挑取有样品的接种环再平板培养基上作连续划线。完毕后，盖上皿盖，倒置温 室培养。(3) 挑菌同稀释涂布平板法，一直到菌分纯为止。实验十微生物大小测定及直接计数一、基本要求1. 掌握利用显微测微尺测量微生物大小的基本方法。2. 掌握使用血球计数板进行微生物计数的基本方法。二、基本原理1. 大小测定的基本原理 微生物细胞大

53、小，是微生物的基本 形态特征之一。由于菌体很小，只能在 显微镜下测量。用来测定微生物大小的 工具有目镜测微尺和镜台测微尺(图2.4)。镜台测微尺是中央部分刻有精确等 分线的载玻片。一般将1mm等分为100 格(或2mm等分为200格)，每格长度图2.4镜台测微尺等于0.01mm (即10卩m)。是专用于校 正目镜测微尺每格长度的。目镜测微尺是一块可放在目镜内隔 板上的圆形小玻片，其中央刻有精确的 刻度，有等分50小格或100小格两种， 每5小格间有1长线相隔。由于所用接 目镜放大倍数和接物镜放大倍数的不 同，目镜测微尺每小格所代表的实际长 度也就不同。因此，目镜测微尺不能直 接用来测定微生物的

54、大小，在使用前必须用静态测微尺进行校正，以求得在一定放大倍数的接目镜和接物镜下该目镜测 微尺每小格的相对值，然后才可用来测定微生物的大小。2. 基本原理用血球计数板在显微镜下直接计数， 是一种常见的微生物计数方法。此法的 优点是直观、快捷。将经过适当稀释的菌悬液（或抱子悬浮液）放在血球计数板 载玻片和盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室的容积是一 定的（0.1mm3），所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位 体积内的微生物总数目。由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和， 故又称为总 菌计数法。血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由4条槽构成3个平台。中间 的平台

55、又被一短横槽横隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格图2.5血球计数板构造图网cm9个大方格，中间的大方格即为计数室。 微生物的计数就在计数室中进行。血球计数 板的构造见图2.5计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格，而每个中方格又分为25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中 方格，而每个中方格又分为16个小方格，（图2.5CD）。但无论是哪种规格 的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即 16X 25=400小方格（见 图 2.5D）。每一个大方格边长为1mm，则每个大方格的面积为1 mm2，盖上盖玻片后， 载玻片和盖玻片之间的高度

56、为 0.1mm，所以计数室的容积为0.1 mm3。在计数时，通常数5个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再 乘上16或25,就得到一个大方格的总菌数，然后再换算成1mL菌液中的总菌数。下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设 5个中方格中 总菌数为A，菌液稀释倍数为B,那么1个大方格中的总菌数（即0.1 mm3中的 总菌数为A/5 X 25 X Bo因 1mL=1cm =1000mm故1mL菌液中的总菌数=A/5X25X10X1000X3=50000 X?B （个）同理，如果是16个中方格的计数板，设5个中方格的总菌数为A,贝U1mL 菌液中总菌数=A /5 X 16X

57、 10X 1000X B =32000A ?B（三、器材1. 大小测量：枯草芽胞杆菌染色玻片标本或酵 母、霉菌的分生抱子、食用菌的担抱子，目镜测微尺， 镜台测微尺，显微镜，擦镜纸，吸水纸，香柏油等。2. 直接计数：酿酒酵母菌悬液或霉菌抱子悬浮 液，血球计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细管。四、操作步骤（一）微生物大小的测定1. 目镜测微尺的标定（1）放置目镜测微尺 取出接目镜，旋开接目镜透镜，将目镜测微尺的刻 度朝下放在接目镜筒内的隔板上，然后旋上接目透镜，最后将此接目镜插入镜筒 内。（2）放置镜台测微尺 将镜台测微尺置于显微镜的载物台上，使刻度面朝上。图2.6目镜测微尺校正（3）校正目镜测微尺

58、 先用低倍镜观察，对准焦距,当看清镜台测微尺后，转动接目镜，使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻 度平行，移动推进器，使目镜测微尺和镜台测微尺的某一区间的两对刻度线完全 重合，然后计数出两对重合线之间各自所占的格数（图2.6）。根据计数得到的目镜测微尺和镜台测微尺重合线之间各自所占的格数，通过如下公式换算出目镜测微尺每小格所代表的实际长度。目镜测微尺每小格长度（卩m）=两对重合线间镜台测微尺的格数 X10/两对重合线间目镜测微尺格数。同法校正在高倍镜和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。2. 菌体大小的测定目镜测微尺校正后，移去镜台测微尺，换上枯草芽胞杆菌染色玻片标本 （或 酵母、霉菌的分生抱子

59、、食用菌的担抱子），调整焦距使菌体清晰，转动目镜测 微尺（或转动标本），测出枯草芽胞杆菌的长和宽各占几格，将测得的格数乘以 目镜测微尺每小格所代表的长度，即可换算出此单个菌体的大小值。而且一般是 用对数生长期的菌体来进行测量的。3. 取出目镜测微尺，将接目镜放入镜筒，再将目镜测微尺和镜台测微尺分 别用擦镜纸擦拭后，放入盒内保存。（二）微生物的直接计数1. 稀释 将酿酒酵母菌悬液（或抱子悬浮液）进行适当稀释，菌液如不浓，可不 必稀释。2. 镜检计数室在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需 冲洗后才能进行计数。洗净后用手指捏住两侧甩干，切不可用纸擦拭。3. 加样品 将清洁干燥的血球计

60、数板盖上盖玻片， 再用无菌的细口滴管将稀 释的菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴（不可过多），让菌液延缝隙靠毛细渗透作用 自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。4. 显微镜计数 静置5分钟后，将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。在计数前如发现菌液太浓 或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有2-10个菌体为宜。每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的中格）中的军体进行 计数。位于格线上的菌体只数上方和有线上的。 如遇酵母出芽，芽体大小达到母 细胞的一半时，即作两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的

61、值来 计算样品的含菌量。5. 清洗血球计数板使用完毕后，将血球计数板在水龙头上用水柱冲洗，切 勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检观察每小格内是否有残留 菌体，或其它沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。实验十一 水中细菌总数的测定一、目的要求1. 学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。2. 了解水源的平板菌落计数的原则。二、基本原理本实验应用平板计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多， 它们对营养和其他生长条件的要求差别很大， 不可能找到一种培养基在一种条件 下，使水中所有细菌均能生长繁殖， 因此， 以一定的培养基平板上生长出来的菌 落，计算出来的水中细菌总数

62、仅是一种近似值。 目前一般是采用普通肉膏蛋白胨 琼脂培养基。三、器材肉膏蛋白胨琼脂培养基，无菌水；灭菌三角瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培 养皿，灭菌吸管，灭菌试管等。四、操作步骤1. 水样的采取（1）自来水 先将自来水龙头用火焰灼烧 3min 灭菌，再开放水龙头使水流 5min 后，以灭菌三角瓶接取水样，以待分析。（2）池水、河水或湖水 应取距水面 1015cm 的深层水样，先将灭菌的带 玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛 满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入冰箱中保存。2. 细菌总数测定（1）自来水 用灭菌吸管吸取 1mL 水样，注入灭菌

63、培养基中。共做两个平皿。 分别倾注约15mL已溶化并冷却到45C左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基， 并立即在桌面上作平面旋摇，使水样与培养基充分混匀。 另取一空的灭菌培养皿，倾注肉膏蛋白胨琼脂培养基15mL，作空白对照。 培养基凝固后，倒置于37C温箱中，培养24h，进行菌落计数。两个平 板的平均菌落数即为 1mL 水样的细菌总数。（2）池水、河水或湖水等 稀释水样 取 3 个灭菌空试管，分别加入 9mL 灭菌水。取 1mL 水样注 入第一管 9mL 灭菌水内，摇匀，再自第一管取 1mL 至下一管灭菌水内，如此稀 释到第三管，稀释度分别为 10-1、10-2、10-3。稀释倍数看水样污浊程度而定，以 培养后平板的菌落数在 30300个之间的稀释度最为合适，若三个稀释度的菌数 均多到无法计数或少到无