聚合酶链式反应2

聚合酶链反应Polymerase chain reaction,PCR1一、什么是PCR？l PCR是一种模拟天然DNA复制的体外扩增DNA序列的技术，用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。2二、PCR技术的诞生和发展1869年 Friedrich Miescher 发现DNA。1953年 Waston和Crick提出了DNA双螺旋结构。1958年 Matthew Meselson和Franklin Stahl论证 了DNA的半保留复制方式。1960s中期从细胞中分离基因。1960年代末和70年代初基因的体外分离技术。1985年 美国PE-cetus公司的人类遗传研究室的 mullis等人发明了PCR技术。3三、PCR技术的原理l 加热使双链加热使双链DNA解开螺旋解开螺旋ll在退火温度条件下在退火温度条件下引物同模板引物同模板DNA杂交杂交ll在在Taq DNA聚合酶，聚合酶，dNTPs，Mg2+和合适和合适pH缓冲液存在条件下缓冲液存在条件下延伸引物延伸引物ll重复上述变性重复上述变性退火退火引物延伸过程至引物延伸过程至25-40个个循环。靶序列被扩增上百万倍，循环。靶序列被扩增上百万倍，l达到体外扩增核酸序列的目的。达到体外扩增核酸序列的目的。4PCR原理示意图模板DNA加热，变性变性DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA 温度下降，退火退火5引物与模板DNA杂交引物延伸延伸形成两条与模板DNA完全一致的DNA链经过若干个循环后，模板DNA大量扩增6四、四、PCRPCR反应基本条件反应基本条件PCRPCR反应基本要素：反应基本要素：l模板模板DNADNA、引物、酶、引物、酶、dNTPdNTP、MgMg2+2+、缓冲体系缓冲体系71.1.DNADNA模板模板l来源广泛，容易获得；来源广泛，容易获得；l模板用量较少；模板用量较少；l纯度要求较低；纯度要求较低；l纯化方法较简便；纯化方法较简便；l纯化目的纯化目的：除去影响：除去影响PCR反应的杂质，反应的杂质，暴露模板暴露模板DNA。8l传统的传统的DNA纯化方法纯化方法：l采用去垢剂破坏细胞组份，蛋白水解酶消化去除蛋白质，最后用有机溶剂去除蛋白质和细胞膜成分，用乙醇沉淀核酸。l快速的快速的DNA纯化方法：纯化方法：l用高温低渗液体（如水煮沸）溶解细胞，直接用于PCR扩增。92.2.引物引物PrimerPrimer l 引物（引物（primer）是是PCR特异性反应特异性反应的关键，的关键，PCR的效率和特异性取决于两的效率和特异性取决于两个方面，个方面，一是一是引物与模板引物与模板DNA的特异结的特异结合；合；二是二是多聚酶对引物的有效延伸。多聚酶对引物的有效延伸。l 设计引物的总原则：设计引物的总原则：提高扩增的效提高扩增的效率和特异性。率和特异性。10引物设计基本原则v引物长度：一般以1530bp为宜v引物扩增跨度：一般以200500bp为宜v引物碱基分布：尽可能随机v引物碱基G+C含量：宜在45%55%左右11v引物内部不应形成二级结构v引物的特异性v引物3末端的碱基与模板DNA严格配对v3末端的末位碱基最好选T、C、G，而不选A12v引物5末端的碱基没有严格的限制v引物中最好能加上合适的酶切位点v引物浓度：一般为0.10.5mol/L，以产生所需要结果的最低引物量为好133.3.脱氧核糖核苷三磷酸脱氧核糖核苷三磷酸dNTPdNTPv使用浓度为使用浓度为20-200mol/Lv最低的适宜最低的适宜dNTP浓度可根据特定靶序列浓度可根据特定靶序列长度和碱基组成来确定。长度和碱基组成来确定。v四种四种dNTPs的浓度应相同。的浓度应相同。vdNTP溶液具有较强的酸性溶液具有较强的酸性，通常把通常把dNTP配成配成510mmol/L贮存液，用贮存液，用NaOH调调pH至中性，分装后至中性，分装后-20冻存冻存。144.4.Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 最早用于最早用于PCR反应的酶是反应的酶是Klenow酶酶缺点：热稳定性差；缺点：热稳定性差；酶反应温度偏低。酶反应温度偏低。现在都用现在都用Taq DNA聚合酶，具有良好的热聚合酶，具有良好的热稳定性。稳定性。浓度：浓度：1-2.5U/1001时效果最佳。时效果最佳。15目前主要有两种目前主要有两种Taq DNA聚合酶供应：聚合酶供应：v从栖热水生杆菌中提纯的天然酶从栖热水生杆菌中提纯的天然酶v大肠杆菌合成的基因工程酶大肠杆菌合成的基因工程酶165.5.MgMg2+2+lMg2+的作用的作用：为DNA聚合酶活性所必需。lMg2+的浓度的浓度：一般为1.52.0mmol/L，对应dNTP浓度为200mol/L左右。l注意注意：所制备的模板DNA中不应含有高浓度的螯合剂如EDTA，也不应含有高浓度的带负电荷的离子基团，如磷酸根。176.6.扩增反应缓冲液扩增反应缓冲液 v最为常用的缓冲体系是最为常用的缓冲体系是1050mmol/L Tris-HCl(pH8.38.8，20)。v反应混合物中反应混合物中50mmol/L以内的以内的KC1有利于引有利于引物退火物退火.v小牛血清白蛋白小牛血清白蛋白(100g/ml)或明胶或明胶(0.01%)或或Tween 20(0.05%-0.1%)有助于有助于Taq DNA聚聚合酶的稳定。合酶的稳定。v在反应体系中加入适量（在反应体系中加入适量（10%）二甲亚砜）二甲亚砜（DMSO）可减少模板二级结构，提高可减少模板二级结构，提高PCR反应特异性。反应特异性。18五、五、PCRPCR反应循环参数反应循环参数1.变性温度与变性时间变性温度与变性时间 一般情况下，一般情况下，94 1min可使起始模板可使起始模板完全变性。完全变性。温度过高或高温持续时间过长，可对温度过高或高温持续时间过长，可对Taq DNA聚合酶活性和聚合酶活性和dNTP分子造成分子造成损害。损害。192.退火温度与退火时间退火温度与退火时间 退火温度影响着退火温度影响着PCR反应的反应的特异性特异性，主要，主要取决于取决于引物的长度引物的长度及及G+C含量含量。引物的长度在引物的长度在1525bp之间时，退火温度可之间时，退火温度可通过计算得到：通过计算得到：Tm=4（G+C）+2（A+T）203.延伸温度与延伸时间延伸温度与延伸时间温度：温度：建议选择在7075之间，此时，Taq DNA聚合酶具有最高活性。温度过高不利于引物和模板结合。时间：时间：根据待扩增片段的长度而定。72 时核苷酸掺入率为35100个核苷酸/秒。214.循环次数循环次数 v循环次数决定着扩增程度。循环次数决定着扩增程度。v在其它参数都已优化的条件下，最适循在其它参数都已优化的条件下，最适循环次数取决于模板环次数取决于模板DNA的初始浓度。的初始浓度。v在初使模板在初使模板DNA为为3105，1.5104，1103和和50拷贝分子时，其循环数可分别拷贝分子时，其循环数可分别为为2530，3035，3540，4045。v循环次数越多非特异性产物的量亦增加。循环次数越多非特异性产物的量亦增加。225 5、扩增反应曲线、扩增反应曲线 图图1 1 指数增长曲线指数增长曲线 图图2 2 非指数形式增长非指数形式增长y=A2y=A2n n y=A(1+R)y=A(1+R)n ny y为产物量；为产物量；n n为循环数；为循环数；A A为起始模板量；为起始模板量；R R为扩增效率。为扩增效率。ynyn23l理论上理论上PCR扩增效率应为扩增效率应为100%l在在PCR反应的后期，由于反应的后期，由于DNA聚合酶活聚合酶活性降低，模板拷贝数大量增加，引物及性降低，模板拷贝数大量增加，引物及dNTPs量被大量消耗及模板互补链之间量被大量消耗及模板互补链之间退火逐渐增加，退火逐渐增加，PCR扩增效率下降，扩增效率下降，PCR产物的指数形式增长也逐渐变为线产物的指数形式增长也逐渐变为线性增长直至出现性增长直至出现平台效应平台效应。l通过通过Y=A(1+R)n式估算式估算PCR产物的量。产物的量。24六、六、结果分析结果分析 v琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳可帮助判断扩增产物可帮助判断扩增产物 的的大小；大小；v点杂交点杂交除可鉴定扩增产物外，还有助于产除可鉴定扩增产物外，还有助于产物的分型物的分型(如，如，HLA-DQ分型分型)；vSouthernSouthern杂交分析杂交分析可从非特异扩增产物中可从非特异扩增产物中鉴定出特异产物的大小，增加检测的特异性鉴定出特异产物的大小，增加检测的特异性与敏感性。与敏感性。vPCR-ELISAPCR-ELISA，PCR-EIAPCR-EIA，PCR-OLAPCR-OLA等均有助于产物的精确分析。等均有助于产物的精确分析。25PCRPCR反应的特点：反应的特点：l1.高度的特异性高度的特异性 l2.高度的敏感性高度的敏感性 l3.操作简便快速操作简便快速l4.适用样品的广泛性适用样品的广泛性26PCR反应的自动化vTaq DNA聚合酶的发现使PCR的自动化成为可能。v1988年，PE-cetus公司推出第一台PCR扩增仪。v1995年，定量PCR仪出现。27常用的PCR扩增仪形式机械手：机械手：用3个不同温度的水浴，样品用一个机械手臂控制在不同温度间移动。优点：温度转换快，耗时少；设备较简单，容易控制和维修 28空气加热/光加热循环装置：用热空气枪借空气作为热传播媒介或用光照射加热，由风扇提供外部冷空气，加上精确的温度传感器构成不同的温度循环。优点优点：不用金属精密加工，成本低；整个系统没有液体流动及制冷剂，安全程度高。29变温金属块作恒温装置：通过半导体加热和冷却，在一个铝合金金属块上来完成PCR过程。优点优点：装置比较牢固耐用；温度变换平稳，有利于保持 Taq DNA聚合酶的活性。30313233PCR技术的应用34 遗传性疾病的基因诊断遗传性疾病的基因诊断 例如：地中海贫血 1 2 3 41.正常内对照2.Basts水肿标本3.反应体系故障扩增失败4.分子量标准PCR用于用于-地贫地贫Basts水肿产前诊断水肿产前诊断35病原体的检测病原体的检测例如：人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）等的检测。病毒性疾病的早期诊断对该疾病的防治十分重要。PCR方法能从具有大量宿主核酸存在的条件下，特异性扩增病毒DNA核酸序列而加以检测，敏感性与特异性均优于传统常规检测方法。36检测癌基因和抑癌基因检测癌基因和抑癌基因例如：ras癌基因 p53基因等 PCR 快速、灵敏、大规模检测37PCR在法医学上的应用在法医学上的应用l目的目的：个人认识l 亲子鉴定l 性别鉴定l1985年，英国遗传学家Jeffreys制备出DNA指纹图（DNA fingerprint），其本质为具有个体特异性的限制性内切酶片段长度多态图谱（RFLP）。3839