哺乳动物胚胎与配子生物工程技术.ppt

《哺乳动物胚胎与配子生物工程技术.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《哺乳动物胚胎与配子生物工程技术.ppt（99页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、哺乳动物胚胎工程 Mammal Embryo Engineering 第一节、胚胎移植 （ Embryo Transplant） 定 义： 将良种母畜配种后的早期胚 胎取出 ， 移植到同种 、 生理状态相同的其 他母畜体内 ， 使之继续发育成为新个体 。 一、概述 提供胚胎的母畜称为供体（ Donor） 接受胚胎的母畜称为受体（ Recipient） 二、胚胎移植的过程及意义 1、 充分发挥良种母畜的繁殖潜力 。 2、 加速品种改良 ， 扩大良种畜群 。 3、 诱产双胎 ， 提高生产效率 。 4、 防疫需要和克服不孕 。 5、 基础研究手段 。 6、 满足畜牧业现代化的需要 。 1、 遗传物质

2、 来自 亲代 。 2、 营养物质 来自 受体 。 三、胚胎移植的特点 四、胚胎移植的生理学基础和原则 1、 母畜发情后生殖器官的孕向发育； 2、 早期胚胎呈游离状态； 3、 胚胎移植基本上不存在免疫问题； 4、 胚胎与供受体的关系 。 (一 )生理学基础 (二 )胚胎移植的基本原则 1、 胚胎移植前后所处环境的一致性 。 种属的一致性； 生理的一致性； 收集和移植部位的一致性 。 2、 胚胎发育的期限 不超过周期黄体的寿命。 通常是在供体发情配种后 3-8天内收集胚胎。 3、胚胎的质量 0-2d 1-3d 2-3d 3-5d 4-5d 5-6d 5-7d 7-8d 7-9d 8-10d 9-1

3、1d 五、胚胎移植的技术过程 供受体的选择； 供体的超排处理与配种和受体的同期发情； 胚胎的收集； 胚胎的检查； 胚胎移植 。 牛 胚 胎 移 植 示 意 图 Boer胚胎移植示意图 优良公 Boer羊 供体母 Boer羊超排 手术取胚 受体母山羊同期发情 后代 (一 )供体和受体的选择 供体： 良种母畜 。 受体： 良好的繁殖性能 ， 健康 、 体况中上等 。 (二 )供体超数排卵处理和受体 母畜的同期发情 1、超排目的 得到足够量的合格胚胎。 2、超排方法 （ 发 情9 11 天 ） FSH PG 法 牛 超 数 排 卵 早： FSH1.5mg； 晚： FSH1.5mg 早： FSH1.0

4、mg；晚： FSH1.0mg 早： FSH0.6mg+PGF20.4mg；晚： FSH0.6mg 早： FSH0.4mg；晚： FSH0.4mg 发情后配种或输精两次，每隔 6h输一次 (为 0d) 第 6 7d冲洗子宫：盐酸利多卡因尾椎麻醉 桑椹胚早期囊胚 PMSG 法 牛 超 数 排 卵 发情第 16 17d，注射 PMSG1500 3000IU 隔日注射 hCG1000 1500IU 24 48h发情，配种或输精（为第 0d） 第 6 7d冲洗子宫，获得桑椹胚早期囊胚 FSH PG 法 羊 超 数 排 卵 早： FSH（国产， 7.5mg/瓶）；晚： FSH 早： FSH；晚： FSH

5、早： FSH + PGF22ml ；晚： FSH 24 48h发情，配种或输精两次（为第 0d） 发情周期第 12 13d（绵羊）、 16 18d（山羊） 第 6d冲洗子宫，获得桑椹胚早期囊胚 同时静脉注射 LH100 150IU *国产 FSH总量为 150 300IU （一） PMSG 法 羊 超 数 排 卵 发情周期的 12 13d（绵羊）、 第 16 18d（山羊）注射 PMSG800 1500IU 24 48h发情，配种或输精（为第 0d） 同时注射 hCG500 750IU 第 6d冲洗子宫，获得桑椹胚早期囊胚 （二） PMSG 法 小 鼠 超 数 排 卵 注射 PMSG10 20

6、IU 48小时后注射 hCG10 20IU， 公母合笼 24小时后刺破输卵管，获得早期受精卵 3、 受体母畜的同期发情 与供体母畜超排同时进行 。 P4、 PGF2a (三 )供体母畜的配种 要求： 1、 优良公畜的精液； 2、 精子活率高 、 密度大且两次配种 。 同期发情与超排程序 放栓 发情鉴定 配种 0-9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 7:00 FSH 4ml 18:00 FSH 4 ml 7:00 FSH 2.5ml 18:00 FSH 2.5ml 7:00 FSH 2ml 14:00 PG6ml 18:00 FSH 2ml 7:00 FSH 1

7、.5ml 14:00 取栓 18:00 FSH 1.5ml 配 种 配 种 检 查 黄 体 冲 胚 移 胚 (四 )胚胎的收集 1、 手术法收集胚胎手术 优点：冲卵比较彻底 缺点：手术对动物剌激性大 从子宫角顶端冲洗输 卵管：牛、羊、兔 胚胎在输卵管中 从输卵管伞处冲洗 输卵管：猪、马 胚胎在输卵管中 胚胎在子宫角时 从子宫角上端向基部冲洗 2、非手术法收集胚胎 优点：对动物损伤小， 缺点：冲卵不彻底，需要冲卵液多 非 手 术 法 收 集 胚 胎 (五 )胚胎的检查 第 6天收集的胚胎（未拣） 1、检胚 二细胞至四细胞胚胎 2、胚胎鉴定 荧光活体染色体 醋酸荧光素 （ FDA， fluores

8、ceindiacetate） ， 培 养 3-6 ， 活胚胎显示荧光 ， 死胎无荧光 。 测定代谢活性法 1h测定葡萄糖的消耗量 2-5g以上 。 形态学法 原 核 8 细 胞 正 常 胚 胎 桑椹胚 早期囊胚 异常胚胎示意图 未受精卵 胞质中有空泡 卵 裂 球 脱 落 卵 裂 球 分 散 卵 裂 球 不 规 则 受 精 卵 退 化 透明带破裂 透明带不规则 卵圆形透明带 胚胎的移植 手术法： 各种家畜 非手术法： 牛 、 马 (七 )供体和受体的观察 健康状况； 是否发情 。 六、胚胎移植目前存在的问题 和发展前景。 1、 超排效果不够稳定 。 2、 胚胎回收率低 。 3、 移植成功率低 5

9、0-60%. (一 ) 问题 (二 )发展前景 1、 提高稳定超排效果 。 2、 改进非手术法收集和移植胚胎 的技术和器具 . 3、 胚胎移植技术应与胚胎切割 、 胚胎冷冻 、 早期胚胎的性别鉴定等结合起来 。 第二节 胚胎冷冻与体外受精 (一 )意义 1、 建立胚胎库 ， 保存优良种畜与濒危动物资源 。 2、 使胚胎移植不受时间与地点的限制 。 3、 胚胎运输取代种畜引进 。 一、胚胎冷冻 (二 )冷冻原理 形成冰晶 胞外水分 渗透压升高 细胞脱水、 蛋白质变性 胞内水分 形成大的冰晶 细胞死亡 胞外溶液效应 抗冻保护剂 胞内形成大的冰晶 胞外溶液效应 冷冻保护剂：甘油 、 DMSO、 乙二

10、醇 、 丙二醇 。 (三 )冷冻及解冻方法 1、 缓慢降温法 以低于 0.2-0.8 /min速度降低到 70 再投入液氮 ， 解冻速度也不超过 25 /min 优点：脱水完全 ， 细胞内不易形成冰晶 缺点：费时 ， 需要特殊仪器 2、 快速冷冻 ， 快速解冻 胚胎采集洗涤 加 1.4mol/L甘油中平衡 20 装管 0 平衡 10 以 1 /分降 至 - 6 -7 并平衡 10 以 0.3-0.5 /min 降至 -35 -38 后投入液氮。 投入 37 水 中解冻 1，然 后用 0.20M蔗 糖 PBS液洗 2 次。 3、 一步冷冻法 采用 25%的甘油 、 丙二醇 、 乙二醇中的 任何两

11、种保护剂组成高浓度的玻璃化液 ， 分 两步移入低 、 高浓度的保护剂中 ， 装管并在 4 平衡 10 然后投入液氮 。 （ DMSO对胚 胎的毒性很大 ） 25 25% 甘油 13 25% 甘油 、 0.25M蔗糖 10 4 25%甘油 、 25% 丙二醇 30 液氮 解冻：胚胎 25 水温 0.5mol/L蔗糖 5 保存液冲洗 3-4 装枪移植 。 二、体外受精 (一 )卵母细胞体外成熟 1、 采卵： 剖腹 、 腹腔镜 、 屠宰场 卵子分四类 形态正常 ， 卵丘细胞致密 卵丘细胞部分脱落 卵丘细胞全部脱落：裸卵 卵子已退化 2、 未成熟卵子的培养 TCM-199+胎牛血清 +丙酮酸 ， 可加

12、 cAMP、 血清 、 生长因子 、 生殖激素 (FSH、 17-雌二醇 ， hCG) 39 5%CO2饱和湿度 20-30h M199+PMSG10/ml+hCG10/ml 17-雌二醇 1mg/L 10%猪卵泡液 10%FSC+半胱氨酸 69mg/L 培 养 成 熟 牛 卵 母 细 胞 (二 )精子体外获能 1、 精子洗涤： 多次离心 2、 精子获能 BO液 咖啡因 ， 肝素 、 BSA、 钙离子载体 改良 Tyrode 10mg/ml肝素 (三 )体外受精 微滴： 5-10 个 卵 母 细 胞 加 0.64-1 106/ml 精子 39 5%CO2气体 Tyride18-24h BO 6

13、-8h 液滴示意图 卵母细胞质成熟：细胞质成熟较难鉴定，因此， 通常只检查细胞核的成熟。 卵母细胞核染色 制片：压片。 固定：固定液 乙醇：乙酸 3： 1， 24h 染色： 1地衣红， 40乙酸 镜检：光学显微镜 制片、固定、染色示意图 (四 )早期胚胎的体外发育培养 许多动物早期胚胎均存在 体外发育 阻滞 现象 。 M199+0.875g/L牛磺酸 6%mg/L半胱氨酸 5% CO2 (五 )精子显微注射 指采用显微操作方法将处理后的精子核或 完整的精子直接注入卵质 ， 完成受精过程 。 细胞流式分类器 基本程序： 精子注射前处理：精子核 。 借 助显微操作仪将核直接穿过透明带和卵膜进入 卵

14、质中； 注射后的卵母细胞体外培养 。 胞质内授精（ ICSI） 带下授精 第三节 胚胎显微操作 显微操作仪分割 徒手分割 0.1-0.2%链霉蛋白酶 软化透明带 一、胚胎分割 胚胎分割 二、细胞核移植 单个卵裂球或体细胞核 ， 移入去核的成熟卵 母细胞中采用一定的方法激活卵母细胞 ， 使 供体核和受体核融合为重构胚 ， 经移植后发 育成新个体的技术 。 “ 多莉 ” doly 核移植的程序图 克隆技术路线图 “多 莉” doly 显微注射仪 显微注射仪操作臂 显微注射仪操作臂 显微注射仪操作臂 拉针仪 煅烧仪 磨针仪 核移植技术的操作过程 供体核的分离技术 a、 胚细胞 胚胎干细胞 类胚胎干细

15、胞 b、 体细胞 受体细胞的去核技术 a、 受精卵：松弛素 b、 成熟卵母细胞 核卵重组技术：移入供体核 卵母细胞的激活与细胞融合 核移植胚的培养与移植或 重复克隆技术 。 三、转基因动物 是指将外源基因通过显微操作 ， 整 合到某种动物的基因组中 ， 并使之在 转录及翻译的水平上得以表达 ， 从而 改变该物种的生物学特性 。 转 基 因 动 物 的 制 备 转基因的意义 提高家畜的经济性状 ， 以家畜为畜主生产有用的生物活性物质 ， 抗病育种 ， 利用转基因猪生产人类所需的器官 。 转基因动物制备过程 基因导入方法 1、 显微注射 转基因小鼠制备过程 逆转录病毒感染法 胚胎干细胞介导法 精子

16、载体法 第四节性别控制技术 沉淀法 X精子体积较大 ， 沉淀快 梯度离心法 X、 Y精子 DNA含量有差异的原理 ， X较 Y大 电泳法 X、 Y精子表面所带电荷的差异 靠近正极 X、 负极 Y 一、精子分离方法 H-Y抗原法 抗 H-Y的抗体处理精子 ， 使 Y精子失能 精子的柱层析分离法 葡聚糖凝胶 G-50 X精子的 DNA含 量略多干 Y精子 速度慢 ， 受胎率较低 ， 价格昂贵 。 流式细胞分类器 二、胚胎的性别控制 细胞遗传学 核型分析 X染色体连锁酶活力测定法 雌性胚胎 X染色体连锁酶的活性是雄 性的两倍 。 H-Y抗原法 细胞毒性分析法 含有 H-Y抗血清与补体的培养液中培养

17、， 有 H- Y抗原的胚胎表现出一定的细胞溶解 。 间接免疫荧光法 先将 8细胞至囊胚期胚胎与 H-Y抗体反应 30分钟 ， 与 FITC标记的 IgM抗体反应 。 然后在荧光显微镜 下检查胚胎是否带有荧光素 ， 若有为雄性 。 Y染色体特异性 DNA探针法 用同位素标记的 Y染色体特异序列的探针 ， 用这一探针与从胚胎细胞中提取的少量 DNA杂 交 。 在雄性的 DNA片断 ， 即 SRY（ 性别决定区 ） 与 PCR扩增技术相结合 ， 用于胚胎性别鉴定 。 三、外界环境 控制饲养类型及营养水平 谷物 饲料为主的酸性饲料类型多 雄性 后代 青绿 饲料为主的饲料类型多 雌性 后代 营养不良 时

18、多 雄性 后代 营养丰富 时多 雌性 后代 控制配制年龄 过于年老的或过于年轻的母体常多 生雄性 ; 中年常多生雌性 。 交配特点 交配次数 雄兔于一天中进行多次交配 ， 发现后代中的 雌性越来越多 。 受孕时间 发情早期卵子刚排出时受孕后代雌性较多 ， 发情晚期卵子过度成熟后受孕者雄性多 。 人工授精时所采用的一些其他方法 在输精前 20-30 , 精氨酸阴道内注入 1ml：高 、 低 雄 ， 中 雌 复习思考题 名词解释：胚胎移植、细胞核移植、转基 因动物、精子显微注射 、胚胎冷冻 胚胎移植的意义。 胚胎移植的生理学基础。 胚胎移植的基本原则。 胚胎移植的技术过程。 胚胎移植目前存在的问题和发展前景。 胚胎冷冻的原理。 性别控制有哪些技术