基因工程的主要技术原理

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1、 一 、 质 粒 DNA的 提 取 闭 合 环 状 的 质 粒 DNA， 在 变 性 后 不 会分 离 ， 复 性 快 ；（ 1） 原 理1 .碱 裂 解 法 提 取 质 粒 DNADNA双 链 变 性 DNA单 链复 性强 碱中 性 染 色 体 线 性 DNA和 或 有 缺 口 的 质 粒 DNA变 性 后 双链 分 离 ， 难 以 复 性 而 形 成 缠 绕 的 结 构 ， 与 蛋 白质 SDS复 合 物 结 合 在 一 起 ;当 K+取 代 Na+时 ,生 成不 溶 的 PDS, 这 些 复 合 物 从 溶 液 中 沉 淀 下 来 。变 性 利 用 宿 主 菌 线 状 染 色 体 DNA

2、与 闭 环 双 链 质 粒 DNA的 结 构 状 态 的 差 异 来 提 取 质 粒 DNA。 当 同 时 碱 变 性 时 ， 线 状 基 因 组 DNA变 性 充 分 而 质粒 DNA处 于 拓 扑 缠 绕 的 自 然 状 态 而 不 能 彼 此 分 开 。 当 条 件 恢 复 时 （ 酸 中 和 ） ， 质 粒 DNA迅 速 准 确 配置 重 新 形 成 完 全 天 然 超 螺 旋 分 子 ， 而 线 状 DNA则 与破 裂 的 细 胞 壁 ， 细 菌 蛋 白 相 互 缠 绕 成 大 型 复 合 物 ，被 SDS包 盖 。 当 K+取 代 Na+时 ,这 些 复 合 物 会 从 溶 液 中

3、 沉 淀 下来 ， 附 在 细 胞 碎 片 上 一 起 被 离 心 除 去 。 碱 裂 解 法 （ 2） 所 用 的 试 剂 作 用 葡 萄 糖增 加 溶 液 的 粘 度 ， 维 持 渗 透 压 ， 防 止DNA受 机 械 力 （ 震 荡 ） 的 作 用 而 降 解 。 EDTAMg2+、 Ca 2+的 螯 合 剂 ， 可 抑 制 DNA酶 的活 性 ， 防 止 DNA被 酶 降 解 。 NaOH -SDSNaOH ： 强 碱 ， 提 供 pH 12的 碱 性 条 件 ，使 DNA双 链 变 性 。SDS: 溶 解 细 胞 膜 蛋 白 和 细 胞 内 蛋 白 ， 并结 合 成 “ 蛋 白 SD

4、S”复 合 物 ， 使 蛋 白 质（ 包 括 DNA酶 ） 变 性 沉 淀 。 冰 醋 酸 把 醋 酸 钾 溶 液 的 pH 调 到 4.8。用 来 中 和 NaOH 变 性 液 ， 使 DNA复 性 。高 浓 度 的 K+置 换 Na+,生 成 不 溶 的 PDS用 于 沉 淀 DNA。 乙 醇DNA分 子 以 水 合 状 态 “ 溶 于 ” 水 里 ，乙 醇 能 夺 去 DNA分 子 的 水 环 境 。 KAc-H Ac缓 冲 液 RNase A降 解 RNA渣 滓 。以 免 提 取 后 的 DNA中 含 有 小 分 子 的 RNA。 TE缓 冲 液DNA保 存 液 。由 Tris-H C

5、l和 EDTA配 制 。 Tris-H Cl维 持 溶 液 中 pH 值 相 对 稳 定 ；EDTA抑 制 DNA酶 ， 防 止 DNA被 酶 降 解 。 蛋 白 变 性 剂 ， 进 一 步 抽 提 DNA溶 液 中 的 蛋白 质 ， 使 蛋 白 质 沉 淀 。但 苯 酚 会 残 留 在 DNA溶 液 中 。（ 现 多 用 各 种 商 品 化 的 层 析 柱 纯 化 DNA)。 酚 -氯 仿 选 用以 上 试 剂 有 商 业 试 剂 盒 ；也 可 以 自 己 配 制 。 （ 3） 碱 抽 提 法 提 取 质 粒 DNA的 步 骤 Solution I 的 配 制 ：使 用 “ 溶 液 ”悬 浮

6、 菌 体 。第 一 步 ： 悬 浮 菌 体25mM Tris-H Cl(pH 8.0)，10mM EDTA， 溶 液 II 破 坏 细 胞 膜 ， 蛋 白 质 和 DNA变 性 。第 二 步 ： 破 膜 ， 蛋 白 质 和 DNA变 性Solution II 的 配 制 ：第 三 步 ： 中 和溶 液 III使 DNA复 性 、 并 促 使 蛋 白 质 -SDS复合 物 和 染 色 体 DNA沉 淀 。Solution III的 配 制 ：0.2N NaOH ， 1.0%SDS5M 乙 酸 钾 （ 用 冰 醋 酸 调 pH 至 4.8） 上 清 液 中 含 有 闭 合 质 粒 DNA。第 四

7、步 ： 离 心 除 去 沉 淀0.6倍 体 积 的 异 丙 醇或 2倍 体 积 的 乙 醇 。第 五 步 ： 纯 化 DNA上 清 液 过 柱 或 酚 -氯 仿 抽 提 。第 六 步 ： 沉 淀 DNA 与 待 扩 增 的 模 板 DNA区 段 的 两 3端 序 列互 补 （ 5端 相 同 ） 的 短 DNA。 位 置 33引 物 设 计 现 在 多 用 专 业 软 件如 Primer5.0等二 、 引 物 （ primer) 设 计 引 物 的 长 度一 般 引 物 设 计 为 长 1830bp。 引 物 的 特 异 性引 物 应 与 核 苷 酸 序 列 数 据 库 的 其他 序 列 无 明

8、 显 同 源 性 。 引 物 的 碱 基 序 列5端 根 据 需 要 可 设 计 成 某 个 内 切 酶 的 切点 顺 序 、 RNA聚 合 酶 识 别 序 列 、 突 变 位点 或 生 物 素 标 记 等 ， 方 便 与 以 后 操 作 。5ATG CAG AAACTG ATCG ATCG ATCG AT33G CTAG CTACTTAAG 53端 （ 特 别 是 最 末 及 倒 数 三 个 碱 基 ） 必 须 与模 板 严 格 配 对 ， 5端 可 以 不 配 对 。template primer 尽 可 能 提 高 G +C含 量 ， 以 提 高 引 物 与 模板 的 结 合 力 , G

9、 +C含 量 以 45%-65%为 宜 。 引 物 的 碱 基 组 成避 免 连 续 4个 以 上 相 同 碱 基 排 列 或 内 部 回 文序 列 .5G G CAG TCTG CCAG TCTAC3CTG CCAG TCTAC3G ACG G 5T发 卡 结 构1）2） 形 成 引 物 二 聚 体 （ dimer）两 个 引 物 之 间 不 能 有 两 个 以 上 的 连 续碱 基 序 列 互 补 。5G G TCTG CCAG TCTAC33CAG G ACTTAG TCACT5primer1 primer2 引 物 的 Tm值Tm=（ G +C)4 + (A+T)2适 当 提 高 复

10、性 温 度 可 以 提 高 引 物 与 模 板 结合 的 特 异 性 ， 减 少 非 特 异 产 物 的 出 现 。实 际 复 性 温 度 选 择 低 于 Tm值 5-10 oC。经 验 公 式 计 算 ：Tm值 是 指 溶 液 中 有 半 数 的 DNA分 子 解 链 为单 链 时 的 温 度 。 两 条 引 物 的 Tm值 尽 可 能 相等 或 相 近 ， 最 好 相 差 不 超 过 2 oC。 三 、 增 加 PCR特 异 性 的 措 施（ 1） 引 物 设 计（ 2） 引 物 的 退 火 温 度 （ 3） 循 环 次 数（ 4） Taq DNA聚 合 酶 ， 利 用 高 保 真 DNA

11、聚 合 酶（ 5） 降 落 PCR（ 6） 热 启 动 PCR （ 7） 巢 式 PCR 四 . PCR技 术 的 扩 展（ 1） 巢 式 PCR nest PCR 为 了 增 加 产 物 的 特 异 性 ， 设 计 2组 引 物 （ 套 嵌 引物 ） ， 结 合 位 点 依 次 位 于 前 一 组 引 物 之 间 ， 进 行 2轮 扩 增 。 第 一 轮 的 PCR产 物 稀 释 100-200倍 作 为 下一 轮 的 扩 增 模 板 ， 进 行 不 饱 和 扩 增 （ 10-15 cycles） 。1 3 24 （ 2） 热 启 动 PCR hot start PCR94 4 min (预

12、 变 性 ) 94 30 sec, 60 30 sec, 72 2 min 72 7 min 35个 循 环ddH 2O10 x Buffer 25 mmol/L MgCl210 mmol/L dNTP10 M上 游 引 物10 M下 游 引 物DNA模 板DNA Taq聚 合 酶 （ 3） 降 落 PCR配 制 的 体 系 不 变 , PCR扩 增 的 程 序 设 置上 变 化 :94 4 min,94 30 sec,66 30 sec, 每 2个 循 环 降 1-2 , 20 cycles, 72 2 min,94 30 sec,56 30 sec, 15 cycles, 72 2 min

13、72 7 min 无 带 ,先 降 ,再 稳 定 扩 增 有 带 ,先 高 温 稳 定 扩 增 ,再 降退 火 温 度 60 （ 4） 长 片 段 PCR long-range PCR 引 物 设 计l 25-30bpl Tm相 差 不 超 过 1 扩 增 参 数l 缩 短 热 变 性 时 间 ， 94 2 minl 尽 可 能 使 升 温 、 降 温 过 程 缩 短l 适 当 增 加 延 伸 时 间 ， 可 到 20min l 二 步 法 扩 增94 2 min (预 变 性 ) 94 30 sec, 65 17 min 72 7 min 35个 循 环 （ 4） 长 片 段 PCR lon

14、g-range PCR 反 应 体 系l 选 用 扩 增 长 片 段 的 Taq酶l 选 用 扩 增 高 GC含 量 的 PCR buffer 结 合 热 启 动 和 降 落 PCR进 行 低 浓 度 的 引 物 （ 限 制 引 物 ） 首 先 被 用 完 ， 随 后只 有 高 浓 度 的 引 物 ， 继 续 合 成 单 链 DNA。 最 后产 物 中 99%是 单 链 DNA。（ 5） 不 对 称 PCR3 55 3引 物 少用 于 扩 增 单 链 DNA， 单 链 DNA更 适 于 测 序 。 引 物 浓 度 ： 两 个 引 物 的 浓 度 相 差 100倍 。 （ 5） 不 对 称 PC

15、R 退 火 温 度 不 对 称一 条 引 物 长 ， 另 一 条 引 物 短PCR时 ， 先 是 低 温 退 火 ， 一 定 循 环 后 ，提 高 退 火 温 度 ， 使 短 的 引 物 不 能 结 合 模板 ， 达 到 产 生 单 链 。 （ 6） 反 向 PCR扩 增 两 个 引 物 外 侧 的 未 知 序 列把 线 性 DNA模 板 转 变 成 环 形 分 子 。templatetemplate3 55 3（ 传 统 PCR只 扩 增 两 个 引 物 质 之 间 的 已 知 序 列 ） 。技 术 关 键 ： 使 引 物 的 外 侧 序 列 “ 转 变 ” 成 内 侧 序 列 。 （ 7）

16、 TAIL-PCR templatetemplate5 33 5P1 P2 P3 ADP1, P2, P3为 特 异 性 引 物 ， 25bp, Tm 65 左 右AD为 简 并 引 物 ， 15-16bp, Tm 44-45已 知 序 列 Liu, YG and Whittier RF (1995). Genomics 25:674-681. 1、 Southern blot双 链 DNA 限 制 性 内 切 酶 消 化 电 泳 分 离检 测 放 射 自 显 影 转 膜 NaOH 变 性洗 膜 杂 交标 记 的 探 针NaOH 或 高 温 变 性u原 理 和 方 法 :五 .分 子 杂 交

17、技 术 u应 用 : 基 因 拷 贝 数 检 测 ;基 因 文 库 筛 选 , 获 取 目 的 基 因 ;遗 传 疾 病 诊 断 ;转 基 因 样 品 检 测 , 等 2、 Northern blot是 相 对 于 Southern blot而 命 名 的 。 利 用DNA-RNA链 或 RNA-RNA链 杂 交 的 原 理 ，通 过 DNA（ 或 RNA） 探 针 检 测 RNA样 品 。u原 理 和 方 法 : 单 链 RNA 变 性 胶 电 泳 分 离检 测 放 射 自 显 影 转 膜洗 膜 杂 交标 记 的 探 针NaOH 或 高 温 变 性 u应 用 :主 要 用 于 基 因 在 转

18、 录 水 平 上 的 表 达 研 究 。基 因 时 空 特 异 性 表 达 ， 及 表 达 模 式 分 析 ；候 选 基 因 表 达 分 析 ， 有 利 于 排 除 候 选 基 因 ， 等 Pi36-1 Pi36-2RiceG AAS预 测 CRG 2(2) CRG 3(0) CRG 4(0)5.8 kb 4.8 kb 6.4 kba b c物 理 图 谱 NBS-LRRNBS-LRR RM5647(5) Northern blot的 原 理 与 Southern blot相 比 有 三 点 不 同 :(1)检 测 的 对 象 不 同 .(2) 变 性 方 法 是 不 同 的 , 它 不 能 用 碱 变 性 ,因 为 碱 变 性 会 导 致 RNA的 降 解 .(3)探 针 不 同 . Western blot通 过 抗 体 与 靶 蛋 白 的 抗 原 特 异 性 反 应 检测 蛋 白 质 样 品 。主 要 用 于 基 因 在 蛋 白 质 水 平 上 的 表 达 研究 。 Western blot的 原 理 与 Southern blot相 比 有 两 点 不 同 :(1) 检 测 的 对 象 不 同 .(2) 探 针 的 性 质 不 同 ,在 Western blot中 使 用 的 探 针 是 抗 体 (蛋 白 质 )