实验八酶联免疫吸附试验ELISA教学要求

一 教学要求掌握酶联免疫吸附试验的基本方法及其原理学习双抗夹心法检测抗原物质的基本操作实验八 酶联免疫吸附试验（ELISA）1 二 实验原理 酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA)是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)上发展起来的一种新型免疫测定技术，ELISA过程包括：抗原吸附在固相载体上，这个过程称为包被，加待测抗体,再加相应酶标记抗体，生成抗原-待测抗体-酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体的量。待测抗体的量与有色产物成正比。同理也可包被抗体，测定抗原含量。ELISA最常用的四种方法：直接法测定抗原；间接法测定抗体；双抗体夹心法测定抗原；竞争法测定抗原。2（1）直接法测定抗原A.将抗原吸附在载体表面；B.加酶标抗体，形成抗原抗体复合物；C.加底物。底物的降解量抗原量。3（2）间接法测定抗体A.将抗原吸附于固相载体表面；B.加抗体,形成抗原-抗体复合物;C.加酶标抗体；D.加底物。测定底物的降解量抗体量。4（3）双抗体夹心法测定抗原A.将抗体吸附于固相表面;B.加抗原，形成抗原-抗体复合物;C.加酶标抗体;E.加底物。底物的降解量抗原量。5（4）竞争法测定抗原A.将抗体吸附在固相载体表面;B.加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体；对照只加入酶标抗原；C.加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差未知抗原量。6三 材料与器材（略）7（1）抗体包被：羊抗人IgG 酶联板每孔加100 L，4 过夜；甩净。（2）封闭：2%小牛血清，每孔加100 L，37 封闭30 min；封闭后洗三次（前两次用自来水冲、甩；第三次用洗液，并静置 3 min，甩）（3）加待测抗原：正常人血清稀释成,1:5,1:10,1:20,1:40,1:80,生理盐水作为对照，每孔加 100 L，注意从高稀释度到低稀释度加样，37 孵育1h；洗三次（4）加酶标抗体：HRP-IgG（PBS-Tween，5%BS；1：800稀释），每孔加 100 L，37，30 min；洗三次 四四 操作操作 步骤步骤8（5）酶催化反应：底物显色剂（0.2 mol/L Na2HPO4 加1:1的0.1M柠檬酸，3%H2O2 加1.5L/mL，TMB（DMSO溶，10 mg/mL）每孔加50 L，37 闭光反应15 min；（6）加2mol/L H2SO4 50 L 终止反应，观察颜色反应，并用酶标仪测量OD。9五 注意事项（1）正确洗涤酶标板，加洗涤液时要小心，勿使洗涤液溢出，流入周围孔中，造成交叉污染。洗涤后应尽量甩干孔内残液。洗涤液加入孔后，须保持 3 min再弃去。（2）加样品时应从最高稀释度逐一加至最低稀释度，这样可以不换吸头。（3）底物应在临用前配制，同时注意避光。10六 思考题（1）分析酶标抗体不纯对抗原检测结果的影响（双抗夹心法）（2）比较免疫荧光法和ELISA的最适检测对象。11