羊肚菌菌基土壤微生物群落结构和多样性研究

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1、羊肚菌菌基土壤微生物群落结构和多样性研究佚名 【摘要】为探讨羊肚菌(Morehella vulgaris)与菌基微生物及优势菌的关系，本试 验以取自4个不同地区(河北承德为野生菌，河北平泉、河北滦平和湖北松滋为栽培 菌)的羊肚菌菌基土壤为试验材料，采用Illumina MiSeq高通量测序技术，对羊肚菌 菌基土壤微生物群落结构和多样性进行研究.结果表明:羊肚菌菌基土壤微生物多样 性丰富不同地区、野生与栽培羊肚菌菌基微生物差异明显但存在共有细菌和真菌 菌群,其中共有细菌52纲561属;共有真菌26纲32属.共有细菌中优势菌属包括鞘 氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、假单胞菌属(Pseud

2、omonas)、马赛菌属 (Massilia)、芽殖杆菌属(Gemmobacter)和土地杆菌属(Pedobacter)等，可能与羊 肚菌生长有密切关系，需进一步研究.【期刊名称】河北农业大学学报 【年(卷)，期】2018(041)006 【总页数】6页(P38-43) 【关键词】羊肚菌;菌基土壤;MiSeq高通量测序;微生物类群;优势菌【正文语种】中文 【中图分类】S938.1;S181羊肚菌(Morchella vulgaris)是享誉世界的美味食用菌和药用菌，子实体含有丰富的蛋白质、多糖、多种微量元素和维生素，具有增强免疫功能、抗肿瘤、抗衰老等 功效1。羊肚菌为土生食用菌，土壤微生物对其

3、生长具有一定影响，在我国羊肚 菌主要分布于云南、甘肃、湖南、四川、青海、河南、河北、黑龙江、辽宁等地， 多生长在低温高湿环境、中性或略偏碱性肥沃土壤2,3。近年来，诸多研究者开始寻找与结实相关的关健微生物种类，沈洪4采用PCR- DGGE技术对云南羊肚菌内生细菌多样性的研究表明，内生细菌中主要有拟杆菌 门、变形菌门和厚壁菌门，可能与羊肚菌生长关系密切，并对羊肚菌生长土壤真菌 群落结构进行检测，发现子囊菌亚门的盘菌纲和担子菌亚门的异担子菌纲真菌类群 占大多数5。熊川等6 对羊肚菌菌塘土和非菌塘土细菌多样性分析，发现羊肚菌 菌塘土细菌多样性高于非菌塘土；其中Thermos- porotrichac

4、eae、 Myxococcaceae和Rhodospirillaceae等3科细菌占优势。2017年陈诚等7报 道，羊肚菌栽培后真菌多样性降低，发生白霉病后根际真菌种类增多，土壤真菌群 落结构和优势真菌类群发生变化。但目前尚未见不同地区、野生与栽培羊肚菌菌基 土壤微生物研究的相关报道。本研究运用高通量测序技术，研究不同地区、野生与 栽培羊肚菌菌基土壤群落结构及多样性，旨在探讨羊肚菌与菌基微生物及优势菌的 关系，寻找与羊肚菌生长关系密切的微生物菌群，为羊肚菌人工栽培稳产高产及功 能菌群开发提供依据。1材料与方法1.1样品采集本试验以羊肚菌菌基土壤为研究对象，于2017年5月分别采集自河北承德避暑

5、山 庄野生羊肚菌(1S)生长地，河北平泉(2P)、河北滦平(3L)和湖北松滋(4H)羊肚菌人 工栽培基地。选取长势良好的羊肚菌3株，小心挖取子实体及近菌基土壤，放于 保温盒中，带回实验室。用灭菌的镊子小心刮取羊肚菌菌基表面附着土壤，备用。 1.2 土壤样本DNA提取将土样放于灭菌离心管中，采用Soil Genomic DNA Kit试剂盒提取各土壤样本的DNA，用超微量分光光度计检测所提基因组DNA的浓度和质量。 1.3宏基因组测序利用细菌16Sr DNA的V3-V4可变区通用引物341F(5-CCTACGGGNGGCWGCAG-3,)和 805R (5-GACTACHVGGGTATCTAAT

6、CC-3), 真菌 18Sr DNA 的 V4 可变区通用引物 3NDF(5- GGCAAG- TCTGGTGCCAG-31) 和 Euk_V4_R (5-CGGTAT- CTRATCRTCTTCG-3)。扩增条件为 94 C 3 min, 94 C 30 s,45 C 20 s,65 C 30 s, 5 个循环，94 C 20 s, 55 C 20 s,72 C 30 s , 20个循环，72 C 5 min。第二轮扩增，引入Illuminn桥式PCR兼容引物。 扩增体系：1 pL 10 pmol/L 的 primer F, 1 pL 10 mol/L 的 Primer R，基因组 DNA

7、20 mg ,15pL 2xTag酶，加ddH2O补足至30 pL。PCR扩增产物经琼脂 糖凝胶电泳检测后回收纯化，应用Illumina Miseq平台进行宏基因组测序。测序 服务和生物信息分析工作由上海生工完成。1.4数据预处理测序获得的原始数据需要进行过滤：去除引物接头序列；根据PE reads之间的 overlap关系，将成对的reads拼接(merge)成一条序列；按照barcode标签序 列识别并区分各样本数据；对各样本数据的质量进行质控过滤，得到各样本有效数 据8。1.5数据分析选取97%相似水平下的OTU进行生物信息统计分析。采用Mothur软件进行 Alpha多样性分析，包括计

8、算群落分布多样性的Shannon指数和Simpson指数， 以及计算群落分布丰度的Chao1指数和ACE指数9。采用RDP classifier贝叶 斯算法对97%相似度水平的OTU代表序列进行分类学分析。用R语言工具统计 各样本物种组成及相对丰度，并绘制柱状图和韦恩图。2结果与分析2.1羊肚菌菌基土壤微生物多样性分析羊肚菌菌基土壤样本Alpha多样性结果见表2和表3。表 2 土壤样本细菌 Alpha 多样性统计 Table 2 The Alpha diversity statistics of bacteria in soil sample 样品 SampleOTUShannonSimpso

9、nACEChao1 覆盖率 Coveragerate1S61737.430.0020229.1913872.2987%2P71466.310.0132732.0720167.4 693%3L50615.820.0223047.0013996.9393%4H85507.170.0036662.4324891 .1292%表 3 土壤样本真菌 Alpha 多样性统计 Table 3 The Alpha diversity statistics of fungi in soil sample 样品 SampleOTUShannonSimpsonACEChao1 覆盖率 Coverage rate1S

10、11943.410.158524.495909.4096%2P10493.850.078405.165054.7496 %3L9770.430.9262848.8616770.5697%4H11023.440.099006.364988.6896% 4个地区土壤样本细菌和真菌所建文库覆盖率均在90%左右，说明测序结果比较可靠，能够有效反映样本环境。1S和4H样本中细菌和真菌的Shannon指数相 对较高，Simpson指数较低。2P和4H样本中细菌的ACE指数和Chao1指数相 对较高。样本3L中真菌ACE指数和Chao1指数明显高于其他样本。2.2不同地区羊肚菌菌基土壤微生物群落结构分析2.

11、2.1 土壤微生物纲水平上的分布经宏基因组测序，4个土壤样本中共检测出76 个细菌纲，共有的菌纲52个，多分布于a-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、B- 变形菌纲(Betaproteobacteria)、y-变形菌纲(Gammaproteobacteria)，鞘脂杆 菌纲(Sphingobacteriia)，酸杆菌纲(Acidobacteria)和放线菌纲(Actinobacteria) 中，6个细菌纲在4个土壤样本中总丰度比例均达50%以上，介于54.04% 74.77%之间。共检测出真菌纲53个，共有的菌纲26个，其中盘菌纲(Pezizomycetes)为3L样本中明显

12、优势类群，相对丰度比例高达98.86%。1S、 2L、4H中，除盘菌纲外，多分布于壶菌纲(Chytridiomycetes)、接合菌纲 (Zygomycota)、粪壳菌纲(Sordariomycetes)、座囊菌纲(Dothideomycetes) 散囊菌纲(Eurotiomycetes)，上述真菌纲在这3个样本中的总丰度分别为7.58%， 29.48%，29.53%。2.2.2 土壤微生物属水平上的分布图1-A显示土壤样本细菌属水平的分布。共检 测出细菌属953个。其中样本1S共检测出410类菌属，Gp6和Gp4为优势菌属， 占总丰度15.93% ；样本2P共检测出401类菌属，土地杆菌属(

13、Pedobacter)、假 单胞菌属(Pseudomonas)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、马赛菌属 (Massilia)占明显优势，总丰度达25.53% ；样本3L中共检测出389类菌属，芽 殖杆菌属(Gemmobacter )和假单胞菌属(Pseudomonas )优势明显，总丰度达 20.84% ；样本4H共检测出378类菌属，优势菌属Gp6和土地杆菌属 (Pedobacter )占总丰度 15.14%。图1-B显示真菌属水平上的分布。共检测出真菌属320个。样本3L中群落多样 性较低，羊肚菌属(Morchella)占明显优势，其余3个样本群落多样性相对较高， 但群落组成

14、差异明显：样本1S中羊肚菌属(Morchella)为优势菌；样本2P中 Ophiosphaerella为真菌优势菌，但其原生动物数量较多；样本4H中除真菌腐霉 属(Pythium)外，枝顶孢属(Acremonium)有相对优势。AB图1样本细菌(A)、真菌(B)属水平群落结构分布图Fig.1 The distribution map of the community structure of the sample bacteria(A)and the fungi(B)2.3不同地区羊肚菌菌基土壤样本细菌和真菌类群分析在97%相似水平下得到每个样本的OTU数(图2),1S、2P、3L、4H各自独

15、有的 细菌OTU数分别为3302，4593，3195，5762，各自独有的真菌OTU数分别为 1024，895，934,941。4个地区土壤样本细菌中共有OTU数589个，真菌中 共有OTU数17个。使用MUSCLE对共有OTU聚类中丰度最大的前50个代表 性序列进行比对，采用FastTree根据最大似然法构建进化树(图3,图4)。AB图2细菌(A)、真菌(B)OTU样本分布韦恩图Fig.2 The OTU Wayne distribution map of sample bacteria(A)and fungi(B) 图3样本细菌16S rDNA共有OTU序列系统发生进化树Fig.3 The

16、 16S rDNA common OTU sequence phylogenetic tree of sample bacteria图4样本真菌18S rDNA共有OTU序列系统发生进化树Fig.4 The 18S rDNA common OTU sequence phylogenetic tree of sample fungi从系统进化树看，4个土壤样本都存在的细菌属有假单胞菌属、土地杆菌属、鞘氨 醇单胞菌属、黄杆菌属(Flavobacterium)、根瘤菌属(Sphingomonas)、节杆菌属 (Arthrobacter)、链霉菌属(Streptomyces)、溶杆菌属(Lysobac

17、ter)、亚硝化螺菌 属(Nitrosospira)、锰氧化菌属(Aminobacter )等。样本中共有真菌属有羊肚菌属、 枝顶孢属、枝孢菌属(Cladosporium)、青霉属(Penicillium)、酵母菌属 (Saccharomyces)和粪壳菌属(Sordaria)等。2.4不同地区土壤样本相似度分析UniFrac分析利用各样品序列间的进化信息来比较环境样品在特定进化谱系中是否 有显著的微生物群落差异，通过UPGMA构建进化树，显示不同地区土壤样本微 生物进化上的相似性及差异性。细菌水平上，4H和2P样本间具有较高相似性， 1S样本与其余样本相似度较低。真菌水平上，同样是4H和2P

18、样本间具有较高相 似性，而3L样本与其它样品相似度较低。3讨论研究表明，根际微生物与植物的健康息息相关，微生物群落结构和功能决定着植物 的健康状况10 。基于微生物组概念研究开发微生物菌剂用做生物肥料或生防制剂 等11-12已经成为未来研究和应用的新趋势。羊肚菌是纯土生菌，目前栽培成功 的梯棱、六妹、七妹等品种都是纯土腐生营养类型13，但产量一直不稳定。因此 从菌基土壤中寻找与羊肚菌生长密切相关的微生物显得尤为重要。本试验4个土壤样本的多样性和物种丰度存在差异，野生土壤1S样本微生物多样 性明显高于人工栽培羊肚菌4H、2P和3L，但样本丰度低于3种人工栽培羊肚菌 菌基土壤，可能与1S是野生羊肚

19、菌有关；3种人工栽培羊肚菌菌基土壤样本中， 4H微生物多样性高于样本2P和3L，可能与松滋温度适宜、湿度大，适于微生物 生长有关。而河北平泉和滦平为首次种植羊肚菌，推测土壤微生物群落结构尚未发 生明显改变，可能是造成羊肚菌菌基土壤微生物多样性水平相对较低的原因。4个土壤样本的细菌类群中，变形菌门的变形菌纲、拟杆菌门的鞘脂杆菌纲、酸杆 菌门的酸杆菌纲和放线菌门的放线菌纲均占明显优势；真菌类群中，优势菌群为盘 菌纲、壶菌纲、接合菌纲和粪壳菌纲，这与沈洪从羊肚菌内生菌及土壤中检测到的 优势菌群基本一致4-5。3L样本中盘菌纲为明显优势菌群，可能与土壤中羊肚菌 菌丝量及生长状态有关。但Unclassi

20、fied Bacterial Class仍占有一定比例，表明 羊肚菌土壤中仍存在大量未知的细菌和真菌类群。不同样本中的优势菌属有一定差异，但存在共有类群。细菌中共有菌群有假单胞菌 属、黄杆菌属、鞘氨醇单胞菌属、根瘤菌属、节杆菌属、链霉菌属、溶杆菌属、亚 硝化螺菌属、锰氧化菌属等。研究发现，假单胞菌属是双孢菇子实体发生所必需的 环境微生物14，该属的恶臭假单胞菌能促进羊肚菌菌核生成15，可能对羊肚菌 子实体形成有一定影响。此外，假单胞菌属能够抑制土壤病原菌生长，并能降解环 境中有毒有害物质16，是具有生物防治功能的重要土壤细菌类群17。鞘氨醇单 胞菌属广泛分布于土壤中，是清理土壤中一些有毒物质的

21、有效微生物类群之一 18， 该属某些菌株具有固氮和脱氮的特征，可利用的底物广泛，并对植物致病菌起到拮 抗作用19，并能在菌基分泌糖类等营养物质促进羊肚菌吸收20。节杆菌属是土 壤中重要的解磷细菌21-22，对土壤有毒物质的降解有一定作用。研究表明，适 合羊肚菌生长的土壤一般为中性或略偏碱性23，可能与菌基土壤中能够产碱的黄 杆菌属有关24。根瘤菌属与亚硝化螺菌属能够参与土壤中的氮循环，增加羊肚菌 可利用的氮素营养。溶杆菌属能够通过降解有机物和其他微生物获取营养，易在根 围定殖，为病害抑制土壤因子25。而锰氧化菌属具有良好的净化作用26。由此 推测，这些细菌存在羊肚菌菌基土壤中，对土壤活性调节起

22、到一定作用，并对羊肚 菌生长产生促进作用。土壤样本共有真菌类群有羊肚菌属、枝顶孢属、枝孢菌属、青霉属、酵母菌属和粪 壳菌属等。其中枝顶孢属的一些细菌对线虫有防治作用27，且能够合成生物碱， 具有抗肿瘤抗病毒等生物活性28。枝孢菌属和粪壳菌属分解木质素和纤维素能力 较强29，能够为羊肚菌生长提供更多的有机物。4结论(1) 不同地区羊肚菌菌基土壤微生物多样性和物种丰度差异明显，野生羊肚菌菌基 土壤微生物多样性明显高于人工栽培羊肚菌，丰度与人工栽培羊肚菌明显不同。(2) 不同地区、野生与栽培羊肚菌菌基微生物有共有细菌和真菌菌群，其中共有细 菌52纲561属；共有真菌26纲32属。(3) 不同土壤样本

23、中优势菌属存在差异，共有优势菌纲为变形菌纲、鞘脂杆菌纲、 酸杆菌纲和放线菌纲。共有优势细菌分属于鞘氨醇单胞菌属、假单胞菌属、马赛菌 属、芽殖杆菌属(Gemmobacter )和土地杆菌属。参考文献：【相关文献】1 顾可飞，周昌艳，邵毅，等.云南省野生牛肝菌与羊肚菌营养成分分析J.食品研究与开发， 2017，38(17):129-133.2 Du X H , Zhao Q ,ODonnell K, et al.Multigene molecular phylogenetics reveals true morels(Morchella)are especially species-rich in

24、 ChinaJ.Fungal Genetics and Biology , 2012,49(6):455-469.3 闫晓雪，时小东，张国珍，等.西南地区部分野生羊肚菌ITS序列鉴定及生境分析J.微生物学杂 志，2016 , 36(6):48-53.4 沈洪，陈明杰，赵永昌，等.羊肚菌内生细菌DGGE鉴定J.上海农业学报，2008 , 24(2):58-60.5 沈洪，汪虹，赵永昌，等.采用变性梯度凝胶电泳研究羊肚菌土壤真菌群落结构J .食用菌学报， 2009,16(2):6-12.6 熊川，李小林，李强，等.羊肚菌菌塘土壤细菌群落的结构及多样性J.湖南农业大学学报启然 科学版，2015,41

25、(4):428-434.7 陈诚，李强，黄文丽，等.羊肚菌白霉病发生对土壤真菌群落结构的影响J .微生物学通报， 2017,44(11):2652-2659.8 Schmieder R,Edwards R.Quality control and preprocessing of metagenomic datasetsJ.Bioinformatics , 2011 , 27(6):863-864.9 吴昊.不同类型群落物种多样性指数的比较研究J.中南林业科技大学学报，2015 , 35(5):84-89.10 Berendsen R L , Pieterse C M , Bakker P A.

26、The rhizosphere microbiome and plant healthJ.Trends in Plant Science,2012,17(8):478-486.11 Berg G , Zachow C ,Muller H, et al.Next-generation bio-products sowing the seeds of success for sustainable agricultureJ.Agronomy , 2013 , 3(4):648-656.12 Berg G.Plant-microbe interactions promoting plant grow

27、th and health:perspectives for controlled use of microorganisms in agricultureJ.Applied Microbiology and Biotechnology , 2009 , 84(1):11-18.13 贺新生.羊肚菌(生物学基础、菌种分离制作与高产栽培技术)M.北京：科学出版社，2017.14 Hayes W A , Randle P E , Last F T.The nature of the microbial stimulus affecting sporophore formation in Agari

28、cus bisporus(Lange)SingJ.Annals of Applied Biology,1969,64(1):177-18715 刘伟，张亚，何培新.羊肚菌生物学与栽培技术M.长春：吉林科学技术出版社,2017.16 张望月，高健，张超，等.五种假单胞菌的分离鉴定及其生物活性J.微生物学报，2013 , 53(9):957-965.17 岳东霞，张要武.番茄根际促生菌-假单胞菌的生防作用J.华北农学报，2009 , 24(5):210-213.18 李莹，庄源益，蔡宝立，等.鞘氨醇单胞菌对土壤中漠氨酸降解作用的研究J.农业环境科学学 报，2004，23(6):1164-1167.

29、19 Berg G，Ballin G.Bacterial antagonists to Verticillium dahliae KlebJ.Phytopatho， 1994，141:99-110.20 Takeuchi M，Sakane T，Yanagi M，et al.Taxonomic study of bacteria isolated from plants:proposal of Sphingomonas rosa sp.nov.,Sphingomonas pruni sp.nov.,Sphingomonas asaccharolytica sp.nov.,and Sphingom

30、onas mali sp.novJ.Int J Syst Bacteriol,1995，45(2):334- 341.21 陈燕，杨小龙，曹郁生.1株高效聚磷节杆菌的分离鉴定及其聚磷特性研究J.安徽农业科学， 2011，39(1):447-450.22 常安然，李佳，张耸，等.基于宏基因组学16S rDNA测序对烟草根际土壤细菌群落组成分析 J.中国农业科技导报，2017，19(2):43-50.23 陈大春.羊肚菌对生态条件的要求和关键栽培技术J.农业与技术，2015，35(6):6.24 山OHAepoB bA,钱伯钦.不发酵革兰氏阴性杆菌一黄杆菌属J.国夕卜医学：微生物学分册， 1985

31、 , 3(3):126-127.25 姜英华，胡白石，刘凤权.重要土传病原菌拮抗细菌的筛选与鉴定J.中国生物防治，2005 , 21(4):260-264.26 王冰清，张丽梅，于丹婷，等.土壤及铁锰结核中锰氧化菌的氧化特性分析J.环境科学学报， 2015 , 35(1):262-269.27 姚磊，徐良雄，薛璟花，等.枝顶孢属真菌的抑菌活性及其代谢产物研究J.热带亚热带植物学 报，2012 , 20(2):192-196.28 毛东霞，郭丹丹，吴玲玲，等.石油污染土壤中产苦参碱真菌的分离与鉴定J.浙江大学学报:农 业与生命科学版，2015,41(5):586-592.29 张华姣，王永宏，韩立荣，等.枝状枝孢菌F4-1液体发酵产纤维素酶及部分酶学性质研究J. 西北农业学报，2012 , 21(9):149-153.