安捷伦HPLC色谱柱选择与色谱柱维护保养ppt课件

Agilent Technologies 1页页HPLC色谱柱选择与维护保养色谱柱选择与维护保养Sa安捷伦科技安捷伦科技Agilent Technologies 2页页安捷伦安捷伦HPLC色谱柱选择色谱柱选择Agilent Technologies 3页页分离模式的选择分离模式的选择样品样品溶于有机溶剂溶于有机溶剂溶于水溶于水溶于四氢呋喃溶于四氢呋喃非离子化非离子化离子化离子化溶于有机溶剂溶于有机溶剂溶于水溶于水溶于正己烷溶于正己烷溶于甲醇或甲醇溶于甲醇或甲醇/水水或乙腈或乙腈或乙腈或乙腈/水水用硅胶的正相模式用硅胶的正相模式用键合相的正相模式用键合相的正相模式用键合相的反相模式用键合相的反相模式用键合相的反相模式用键合相的反相模式低分子凝胶渗透色谱低分子凝胶渗透色谱用键合相的反相模式用键合相的反相模式抑制电离反相键合相色谱抑制电离反相键合相色谱离子对键合相的反相模式离子对键合相的反相模式用硅胶的正相模式用硅胶的正相模式离子交换模式离子交换模式凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱大孔填料的离子交换模式大孔填料的离子交换模式用大孔填料的反相模式用大孔填料的反相模式分子量分子量2,000分子量分子量2,000Agilent Technologies 4页页 反相分配色谱反相分配色谱 极性极性:固定相固定相 流动相流动相固定相固定相-极性极性流动相流动相(己烷己烷,庚烷庚烷)-非极性非极性极性极性物质后出峰物质后出峰正相色谱正相色谱 20%反相色谱反相色谱80%正相正相&反相色谱反相色谱Agilent Technologies 5页页 硅胶基质硅胶基质-pH 38 Al2O3.nH2O-pH114 聚合物基质聚合物基质-pH114高或低高或低pH下下,硅胶会溶解硅胶会溶解化学修饰困难化学修饰困难孔结构复杂孔结构复杂,孔径不均匀导致柱效不够高孔径不均匀导致柱效不够高,有有机溶剂可能导致聚合物基质溶涨而受损机溶剂可能导致聚合物基质溶涨而受损柱填料基质柱填料基质Agilent Technologies 6页页C-18柱柱-性能影响因素性能影响因素键合类型键合类型碳覆盖率碳覆盖率封端封端 化学性质化学性质物理性质物理性质硅胶纯度硅胶纯度色谱柱尺寸色谱柱尺寸颗粒形状颗粒形状粒径粒径表面积表面积孔径孔径Agilent Technologies 7页页硅胶纯度硅胶纯度 填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度色谱柱尺寸色谱柱尺寸 填料床的长度和内径填料床的长度和内径颗粒形状颗粒形状 球型或不规则型球型或不规则型粒径粒径 平均颗粒直径平均颗粒直径,通常通常3-10m表面积表面积 颗粒外表面和内部孔表面的总和颗粒外表面和内部孔表面的总和,以以m2/gram表示表示孔径孔径 颗粒的孔或腔的平均尺寸颗粒的孔或腔的平均尺寸,范围范围80-300 色谱柱物理性质色谱柱物理性质C-18柱柱-性能影响因素性能影响因素Agilent Technologies 8页页键合类型键合类型 单体键合单体键合-键合相分子与基体单点相连键合相分子与基体单点相连 聚合体键合聚合体键合-键合相分子与基体多点相连键合相分子与基体多点相连碳覆盖率碳覆盖率 与基体物质相连的键合相的量与基体物质相连的键合相的量封端封端 键合步骤之后键合步骤之后,用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来来色谱柱化学性质色谱柱化学性质C-18柱柱-性能影响因素性能影响因素Agilent Technologies 9页页二氧化硅二氧化硅NaNaK KM gM gAlAlCaCaTiTiFeFeZrZrCuCuCrCrZnZnZorbax Rx-SI LZorbax Rx-SI L1010 3 34 41.51.52 2ndnd3 3ndndndndndnd1 1Zorbax SI LZorbax SI L1717ndndndnd57579 9323221218888 1 1ndnd8888Nucl eosi lNucl eosi l5656N/AN/A N/AN/Andnd13013057577676ndndN/AN/A N/AN/AndndHypersi lHypersi l29002900 N/AN/A404030030038386565230230 N/AN/A N/AN/A N/AN/A N/AN/And=nd=未检出未检出金属浓度（金属浓度（ppm)ppm)A类硅胶类硅胶Original ZORBAX SIL(1970s)由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表面上金属含量高面上金属含量高(硅羟基的硅羟基的pKa低低),导致碱性化合物发生拖尾导致碱性化合物发生拖尾B类硅胶类硅胶(高纯高纯)ZORBAX Rx-Sil(1987)由于金属含量低由于金属含量低,硅羟基硅羟基pKa高高,碱性化合物不发生拖尾碱性化合物不发生拖尾Zorbax Rx-SIL:11种金属种金属 35 ppm(未检出其他杂质未检出其他杂质,4,000,选择选择 300 的孔径的孔径Agilent Technologies 14页页大孔径填料适用于大分子分析大孔径填料适用于大分子分析*大孔径大孔径300 全多孔色谱柱全多孔色谱柱 可用于分离蛋白质和多肽可用于分离蛋白质和多肽 分子量虽小但分子量虽小但hydrodynamic volume(水动力学体积水动力学体积)较大的较大的分子分子*Poroshell 色谱柱色谱柱 高流速下高流速下,高柱效分析大分子的蛋白质和多肽高柱效分析大分子的蛋白质和多肽色谱柱填料孔径必须适合色谱柱填料孔径必须适合待测物分子自由进出填料待测物分子自由进出填料孔孔,与孔内表面的键合与孔内表面的键合相进行分离分配相进行分离分配Agilent Technologies 15页页300 孔径可改善蛋白质和多肽峰形孔径可改善蛋白质和多肽峰形0.2000.020.040.060.080.100.120.140.160.18300SB-C18(300)SB-C18(80)PW 1/2Leu EnkephalinM.W.=556Angiotensin II(血管紧张素血管紧张素 II)M.W.=1046Insulin BM.W.=3,496Cyt CM.W.=12,327Rnase(核糖核酸酶核糖核酸酶)M.W.=13,684Lysozyme(溶菌酶溶菌酶)M.W.=13,900孔径孔径,分子量对峰宽的影响分子量对峰宽的影响(梯度分离梯度分离)选择合适的选择合适的填料孔径分析填料孔径分析大分子可获得大分子可获得最佳峰形最佳峰形Agilent Technologies 16页页300 孔径可改善大分子的峰形孔径可改善大分子的峰形 色谱柱色谱柱:4.6 x 150 mm,5 mm 流动相流动相:60%MeOH:40%0.1%三氟乙酸三氟乙酸 流速流速:0.75 mL/min 温度温度:RT 检测器检测器:UV 282 nm 溶液中的分子尺寸决定适宜的色谱柱孔径溶液中的分子尺寸决定适宜的色谱柱孔径 窄的峰宽表明待测分子进入填料孔没有受到阻碍窄的峰宽表明待测分子进入填料孔没有受到阻碍SB-C3 (80)300SB-C3 (300)Pw 1/2=0.442Pw 1/2=0.125 OONHOHOCHOHOO HO HOOOOOOOCH3CH3OCH3OCH3CH3CH2CH2CH2CH3CH3CH3H3CH3CH3C0 5 10Time(min)0 5 10Time(min)Tylosin(泰乐菌素泰乐菌素)MW.926分子量虽小但分子量虽小但 hydrodynamic volume(水动力学体积水动力学体积)较大的分子较大的分子Agilent Technologies 17页页键合类型键合类型 -对色谱分离的影对色谱分离的影响响单齿键合：单齿键合：提高传质速率提高传质速率,加快色谱柱平衡加快色谱柱平衡双齿键合：双齿键合：增加色谱柱稳定性增加色谱柱稳定性,增加色谱柱的载样增加色谱柱的载样量量C-18柱柱-性能影响因素性能影响因素CHCHCHCHCHCHOSiOOOOSiSiSiCHCHCHCHCHCHSi333333333333SiSiOOSiSiOOAgilent Technologies 18页页碳覆盖率碳覆盖率-对色谱分离的影响对色谱分离的影响高碳覆盖率：提高分辨率高碳覆盖率：提高分辨率,分析时间长分析时间长低碳覆盖率：缩短运行时间低碳覆盖率：缩短运行时间封端封端 -对色谱分离的影响对色谱分离的影响封端：减轻待测组份与硅胶表面残留的酸封端：减轻待测组份与硅胶表面残留的酸性硅羟基反应而引起的色谱峰拖尾现象性硅羟基反应而引起的色谱峰拖尾现象对于极性样品对于极性样品,未封端与经过封端处理未封端与经过封端处理的色谱柱在选择性上有明显差异的色谱柱在选择性上有明显差异C-18柱柱-性能影响因素性能影响因素Agilent Technologies 19页页 固定相键合固定相键合二甲基硅烷二甲基硅烷 封端封端四甲基硅烷四甲基硅烷SiOOHOOCH3SiRCH3CH3SiCH3CH3SiRCH3R=C8,C18,etc.OOHOHOCH3SiRCH3CH3SiRCH3+ClCH3SiCH3CH3OHOHOHOHCH3ClRCH3(TMS)传统键合及封端技术传统键合及封端技术 Agilent Technologies 20页页取代基：五个取代基：五个 旁侧基团旁侧基团:异丙基异丙基Zorbax StableBond 空间位阻保护空间位阻保护-抗水解能力抗水解能力键合相键合相流失流失,保留减弱保留减弱另一个裸露的硅羟基另一个裸露的硅羟基,潜在的拖尾因素潜在的拖尾因素普通硅胶柱低普通硅胶柱低 pH 2不稳定不稳定,发生水解发生水解安捷伦专利的空间位阻保护安捷伦专利的空间位阻保护 Agilent Technologies 21页页液相柱液相柱-保留值与保留值与pH的关系的关系 pH变化值变化值0.1RS变化值变化值1.6色谱柱：色谱柱：Zorbax StableBond C18 4.6 X 250mm,5um部件号：部件号：880975-906流动相：流动相：27%甲醇：甲醇：73%磷酸磷酸pH 2.5&2.6温度：温度：500C流速：流速：1.0mL/min.Agilent Technologies 22页页12346750123456Time(min)01234561234675Time(min)pH 7.00pH 7.25色谱柱色谱柱:ZORBAX Eclipse XDB-C8 4.6 x 75 mm,3.5 m流动相流动相:44%25 mM磷酸磷酸,pH 7.00:56%甲醇甲醇流速流速:1.0 mL/min 温度温度:25C 检测检测:UV 250 nm 可电离的组份的分离可能会随可电离的组份的分离可能会随pH变化发生显著变化变化发生显著变化 甚至很小的甚至很小的 0.050.25 个个pH变化单位变化单位.样品样品:1.ketoprofen 2.ethyl paraben 3.Hydrocortisone 4.fenoprofen 5.propyl paraben 6.Propranolol 7.ibuprofen液相柱液相柱-保留值与保留值与pH的关系的关系0.25 个个pHAgilent Technologies 23页页液相柱液相柱-保留值与保留值与pH的关系的关系pH变化：变化：0.2个个pH(7.07.2)保留时间改变：保留时间改变：1.2分钟分钟(13.614.8分钟分钟)保留时间随保留时间随pH改变不明显改变不明显保留时间随保留时间随pH改变改变不明显不明显(酸性环境中酸性环境中)Agilent Technologies 24页页保留时间保留时间酸性组份酸性组份中性组份中性组份碱性组份碱性组份 方法稳定区方法稳定区 方法波动区方法波动区(pKa+1.5)方法稳定区方法稳定区液相柱液相柱-保留值与保留值与pH的关系的关系Agilent Technologies 25页页液相柱液相柱-保留值与保留值与pH的关系的关系StableBond C18 pH 18 Bonus-RP pH 29 Extend C18 pH 211.5 Eclipse XDB C18 pH 29 Agilent Technologies 26页页复杂组分的流动相复杂组分的流动相pH选择技巧选择技巧色谱柱色谱柱:ZORBAX Extend-C184.6 x 150 mm,5 mm 流动相流动相:30%缓冲液缓冲液:70%MeOH pH 7 缓冲液缓冲液20 mM Na2HPO4 pH 11缓冲液缓冲液 20 mM TEA 流速流速:1.0 mL/min 温度温度:RT 检测器检测器:UV 254 nm0 512,345Time(min)76Extend-C18pH 71.Maleate 马来酸盐马来酸盐 2.Scopolamine 东莨菪碱东莨菪碱 pKa 7.6 3.PseudoEphedrine 假麻黄碱假麻黄碱 pKa 9.8 4.Doxylamine 抗敏安抗敏安(多西拉敏多西拉敏)pKa 9.2 5.Chlorpheniramine 氯苯吡胺氯苯吡胺pKa 9.1 6.Triprol内径内径ine 苯丙烯啶苯丙烯啶pKa 6.5 7.Diphenhydramine 苯海拉明苯海拉明 pKa 9.0Extend-C18pH 110 5 101234Time(min)657 高高pH下下,碱性成分的保留增加碱性成分的保留增加待测物待测物pKa+1.5以外以外的流动相的流动相pH可保证方法的稳定性可保证方法的稳定性Agilent Technologies 27页页Zorbax 色谱柱发展史色谱柱发展史1973 ZORBAX SIL发明专用于发明专用于HPLC分离的球状、小颗粒硅胶分离的球状、小颗粒硅胶(专利专利)1977 ZORBAX ODS单官能团单官能团,单层键合相发明者之一单层键合相发明者之一1978 ZORBAX column首先推出色谱柱的质量信誉保证首先推出色谱柱的质量信誉保证1982 ZORBAX GF-250 改善了蛋白质尺寸分离的稳定性改善了蛋白质尺寸分离的稳定性1987 ZORBAX Rx-SIL推出适合碱性化合物的推出适合碱性化合物的HPLC分离的全新硅溶胶技术分离的全新硅溶胶技术(专利专利)1990 ZORBAX StableBond增强了低增强了低pH条件下键合相的稳定性条件下键合相的稳定性(专利专利)1996 ZORBAX Eclipse XDB双封端技术提高了中等双封端技术提高了中等pH条件下键合相的稳定性条件下键合相的稳定性(专专利利)1997 Zorbax LC/MS column 15和和30 mm(3.5um)快速快速,高分辨率高分辨率,高通高通量量LC/MS色谱柱色谱柱1998 ZORBAX Bonus-RP 极性键合技术使碱性化合物的分离得到改善极性键合技术使碱性化合物的分离得到改善(专利专利)1999 ZORBAX CombiHT 专为小规模组合化学样品制备设计的高通量色谱柱专为小规模组合化学样品制备设计的高通量色谱柱1999 ZORBAX Eclipse dsDNA 用于分析双链用于分析双链DNA的多孔硅胶柱的多孔硅胶柱1999 ZORBAX Carbohydrate 分析单分析单,双双,三糖和糖醇的专用柱三糖和糖醇的专用柱1999 Zorbax Extend C18独特宽独特宽pH跨度跨度,高高pH下使用的硅胶基质色谱柱下使用的硅胶基质色谱柱(专专利利)2001 Zorbax SB-aq可在低可在低pH下下(18)使用使用100%水相的填料水相的填料(专利专利)2002 Zorbax Poroshell 300SB蛋白质高速蛋白质高速,高效反相分离新填料高效反相分离新填料2002 ZORBAX 3.0mm 内径内径.3-mm 柱径溶剂节省柱柱径溶剂节省柱2003 ZORBAX sub 2 micron1.8um粒径的高通量粒径的高通量,超高速色谱柱超高速色谱柱(5月月1日上日上市市)2003 ZORBAX PrepHT 高通量全系列制备柱高通量全系列制备柱-分析柱向制备柱直接放大分析柱向制备柱直接放大(6月月1日上日上市市)Agilent Technologies 28页页键合相键合相-适用适用pH范围范围StableBond,pH 1-81.使用空间位阻大的硅烷使用空间位阻大的硅烷2.未未-封端封端Eclipse XDB,pH 2-91.致密键合的二甲基烷基硅烷致密键合的二甲基烷基硅烷2.专利技术双专利技术双-封端封端Bonus-RP,pH 2-91.极性烷基固定相极性烷基固定相2.使用空间位阻大的硅烷使用空间位阻大的硅烷3.三封端三封端Extend-C18,pH 2-11.51.独特的双齿键合结构独特的双齿键合结构 2.双封端双封端SiOSiOSilica SupportC18C18SiONHOSilica-based 色谱柱 Packing with Alkyl/am内径e Stationary PhaseORRSiOHSiOSiRRROOHRCHCHCHCHCHCHOSiOOOOSiSiSiCHCHCHCHCHCHSi333333333333ORSiSiOSiORR1CH3CH3CH3CH3RR1CH3R1R1R1CH3R11 1SiSiPGPGPGR 1R 1极性官能团极性官能团低低pH下下,分析酸分析酸性性,碱性和中性组碱性和中性组分分,峰形优异峰形优异,柱寿命长柱寿命长中等中等pH下下,分析酸性分析酸性,碱性和中性组分碱性和中性组分,尤其碱性组分峰形优异尤其碱性组分峰形优异,柱寿命长柱寿命长中等中等pH下下,分析酸性分析酸性,碱性和中性组分碱性和中性组分,可用可用于于100%全水相全水相,尤其尤其极性组分峰形优异极性组分峰形优异,柱柱寿命长寿命长中中高高pH下下,分析酸性分析酸性,碱性和中性组分碱性和中性组分,尤其碱性组分峰形优异尤其碱性组分峰形优异,柱寿命长柱寿命长Agilent Technologies 29页页SB-C1880 A&300 ApH:18SB-C880 A&300 ApH:18SB-苯基苯基80 ApH:18反相色谱柱反相色谱柱Bonus-RP空间位阻保护空间位阻保护+三封端三封端80 ApH:29Extend-C1880 A&300 ApH:211.5Eclipse XDB双封端双封端Eclipse XDB-C1880 ApH:29Eclipse XDB-C880 ApH:29Eclipse XDB-苯基苯基80 ApH:29StableBond空间位阻保护空间位阻保护Poroshell 300SB-C18实心核多孔壳实心核多孔壳pH:18SB-CN80 A&300 ApH:18SB-C380 A&300 ApH:18Zorbax 产品系列产品系列SB-AQ空间位阻保护空间位阻保护80 ApH:18可使用可使用100%水相水相Extend双齿键合双齿键合+双封端双封端低低pH中中pH高高pHAgilent Technologies 30页页安捷伦安捷伦HPLC色谱柱维护保养色谱柱维护保养Agilent Technologies 31页页Zorbax色谱柱色谱柱=高柱效高柱效+长寿命长寿命min00.511.52Norm.01020304050 色谱柱色谱柱:ZORBAX SB-C18 4.6 x 30 mm,1.8um 流动相流动相:60%甲醇甲醇:40 水水 流速流速:1mL/min 温度温度:室温室温检测检测:UV 254 nm 柱效柱效进样次数进样次数#3#41663561381006857 63722006882 63813006895 63814006883 62945006815 63126006687 62367006653 61158006695 62219006781 63001050 681063021300 685865282034682363431234样品样品1.尿嘧啶尿嘧啶 2.苯酚苯酚 3.4-Cl-硝基硝基苯苯 4.甲苯甲苯Agilent Technologies 32页页色谱柱柱内体积和平衡时间色谱柱柱内体积和平衡时间单次样品运行时间单次样品运行时间=分析时间分析时间+色谱柱平衡时间色谱柱平衡时间色谱柱平衡时间色谱柱平衡时间=10倍柱内体积倍柱内体积 流速流速4.6 x 500.5 mL5 min4.6 x 300.3 mL3 min4.6 x 150.15 mL1.5 min4.6 x 1501.54 mL15 min2.1 x 500.10 mL5 min60 sec2.1 x 300.06 mL3 min36 sec2.1 x 150.03 mL1.5 min18 sec色谱柱色谱柱柱内柱内 平衡时间平衡时间 尺寸尺寸体积体积 流速流速(mm)(Vm)1.0 mL/min色谱柱色谱柱柱内柱内 平衡时间平衡时间 尺寸尺寸体积体积 流速流速(mm)(Vm)0.2 mL/min 1.0 mL/minAgilent Technologies 33页页清洗液相色谱柱清洗液相色谱柱冲洗色谱柱冲洗色谱柱-用比用比流动相更强的溶剂流动相更强的溶剂反相色谱柱反相色谱柱用以下溶剂至少各用以下溶剂至少各25mL冲洗色谱柱冲洗色谱柱(分析柱分析柱)不含缓冲盐的流动相不含缓冲盐的流动相100%甲醇甲醇100%乙腈乙腈75%乙腈乙腈+25%异丙醇异丙醇100%异丙醇异丙醇100%二氯甲烷二氯甲烷*100%己烷己烷*若使用己烷或二氯甲烷冲洗色谱柱若使用己烷或二氯甲烷冲洗色谱柱,则在重新使用反相则在重新使用反相流动相以前流动相以前,必须用异丙醇冲洗色谱柱必须用异丙醇冲洗色谱柱!正相色谱柱正相色谱柱用以下溶剂至少各用以下溶剂至少各50mL冲洗色谱柱冲洗色谱柱(分析柱分析柱)50%甲醇甲醇+50%三氯甲烷三氯甲烷100%乙酸乙酯乙酸乙酯Agilent Technologies 34页页0.12mm内径管线用于毛细管内径管线用于毛细管HPLC中中2.1内径色内径色谱柱谱柱0.17mm内径管线用于分析型内径管线用于分析型HPLC中中2.14.6内径内径色谱柱色谱柱0.25mm内径管线用于半制备型内径管线用于半制备型HPLC中中9.4内径色内径色谱柱谱柱0.5mm内径管线用于制备型内径管线用于制备型HPLC中中21.2内径色谱内径色谱柱柱连接管线与接头连接管线与接头色谱柱色谱柱:StableBond SB-C18,4.6 x 30 mm,3.5 mm 流动相流动相:85%H2O with 0.1%三氟乙酸三氟乙酸 :15%ACN 流速流速:1.0 mL/min 温度温度:35C50 m mL 柱外体积（管线）柱外体积（管线）4321Time(min)0.0 0.5 1.0 1.5 2.010 m mL 柱外体积柱外体积Time(min)0.0 0.5 1.0 1.5 2.04321样品样品:1.苯丙胺酸苯丙胺酸2.5-苯基苯基-3,6-二氧二氧-2-哌嗪乙哌嗪乙酸酸3.Asp-Phe 4.天冬甜素天冬甜素Agilent Technologies 35页页HPLC常用的色谱柱接头常用的色谱柱接头Troubleshooting LC Fittings,Part II.J.W.Dolan and P.Upchurch.LC/GC Magazine 6:788(1988)0.09 in.=2.33 mmSwagelok安捷伦安捷伦1100液液相相ParkerValcoUptight0.09 in.=2.33 mm0.08 in.=2.07 mm0.09 in.=2.33 mm0.13 in.=3.37mm0.17 in.=4.40mmWatersRheodyneAgilent Technologies 36页页如果伸出的管线长度过长，可能漏液如果伸出的管线长度过长，可能漏液 螺母坡度不匹配，密封性差螺母坡度不匹配，密封性差 死体积区死体积区如果伸出的管线长度不够，可能产生死体积如果伸出的管线长度不够，可能产生死体积HPLC常用的色谱柱接头常用的色谱柱接头Agilent Technologies 37页页活塞杆与密封圈活塞杆与密封圈蓝宝石活塞杆蓝宝石活塞杆 1/包装包装部件号：部件号：5063-6586活塞杆密封圈活塞杆密封圈（Vespel聚酰亚胺用于聚酰亚胺用于反相反相）2/包装包装部件号：部件号：5063-6589*己烷对己烷对Vespel聚酰亚胺有溶涨作用聚酰亚胺有溶涨作用活塞杆密封圈活塞杆密封圈（聚乙烯用于（聚乙烯用于正相正相）2/包装包装部件号：部件号：0905-1420Agilent Technologies 38页页样品样品:1.尿嘧啶尿嘧啶2.苯酚苯酚3.N,N-二甲基苯胺二甲基苯胺更换前更换前 更换后更换后色谱柱色谱柱:Bonus-RP 4.6 x 75 mm,3.5 mm 流动相流动相:30%H2O :70%MeOH流速流速:1.0mL/min温度：室温温度：室温检测器检测器:UV 254nm0.0 0.5 1.0 1.5 Time(min)2130.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Time(min)213塔板数塔板数 USP拖尾因子拖尾因子(5%)1.22351.722.34911.483.54321.15塔板数塔板数USP拖尾因子拖尾因子(5%)1.36701.452.104571.093.100851.00活塞杆与密封圈活塞杆与密封圈Agilent Technologies 39页页检测器用灯检测器用灯Agilent Technologies 40页页检测器用灯检测器用灯Agilent Technologies 41页页检测器用灯检测器用灯Agilent Technologies 42页页1.DAD的氘灯替代的氘灯替代VWD的氘灯的氘灯*关闭灯电源关闭灯电源,冷却冷却5min以上以上*将将lamp设定的设定的VWD configuration的灯类型改为的灯类型改为2140-05902.灯能量测试灯能量测试*以水为流动相以水为流动相*灯预热灯预热10min以上以上*在化学工作站在化学工作站Diagnosis状态下进行波长校准状态下进行波长校准,将紫外灯的使用时间归零将紫外灯的使用时间归零 DAD的氘灯替代的氘灯替代VWD的氘灯的氘灯Agilent Technologies 43页页DAD故障诊断与维护故障诊断与维护要进行要进行DAD故障诊断故障诊断,单击单击DAD图标图标,然后选择然后选择Show Module Test选项选项,进入进入DAD测试测试选项画面选项画面DAD故障诊断测试共有故障诊断测试共有8项内项内容：容：DAD Self-TestDAD Intensity TestDAD Cell Test常做的常做的DAD维护：维护：更换灯更换灯清洗或更换流动池窗清洗或更换流动池窗Agilent Technologies 44页页Diagnosis界面故障原因分析界面故障原因分析故故障障选选择择框框可能原因框可能原因框 诊断过程故障分析诊断过程故障分析 样品分析过程中故障分析样品分析过程中故障分析在在Diagnosis画面中为用户提供了在诊断过程画面中为用户提供了在诊断过程或样品分析过程中出现的问题以及可能的原因或样品分析过程中出现的问题以及可能的原因Agilent Technologies 45页页样品溶剂溶解强度样品溶剂溶解强度 样品溶剂溶解能力强于流动相导致色谱峰峰形问题：裂分峰或宽峰样品溶剂溶解能力强于流动相导致色谱峰峰形问题：裂分峰或宽峰色谱柱色谱柱:ZORBAX StableBond SB-C8,4.6 x 150 mm,5 mm 流动相流动相:82%H2O:18%ACN进样体积进样体积:30 mLA.样品溶剂样品溶剂100%乙腈乙腈0 10Time(min)12B.样品溶剂样品溶剂流动相流动相0 10Time(min)12样品样品:1.Caffeine(咖啡因咖啡因)2.Salicylamide(水杨酰胺水杨酰胺)Agilent Technologies 46页页中性分析时为何要使用缓冲液？中性分析时为何要使用缓冲液？色谱柱色谱柱:ZORBAX Eclipse XDB-C8,4.6 x 75 mm,3.5 m 流动相流动相:44%A:56%甲醇甲醇流速流速:1.0 mL/min 温度温度:25C 检测检测:UV 250 nm 含缓冲液的流动相可改善保留含缓冲液的流动相可改善保留,分离和色谱峰峰形分离和色谱峰峰形.样品样品:1.ketoprofen 2.ethyl paraben 3.hydrocortisone 4.fenoprofen 5.propyl paraben 6.propranolol 7.ibuprofenA=pH 7.0水水A=pH 7.0 水水+25 mM 磷酸缓磷酸缓冲液冲液012345Time(min)1234675012341,4,6,7235Time(min)Agilent Technologies 47页页0 2.5 5.0 7.5Time(min)1234560 2.5 5.0Time(min)123456增加缓冲液浓度减少拖尾增加缓冲液浓度减少拖尾色谱柱色谱柱:ZORBAX Eclipse XDB-C84.6 x 150 mm,5 mm流动相流动相:40%磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液60%ACN流速流速:1.5 mL/min.温度温度:40CUSP Tf1.1.622.1.653.1.634.1.775.1.836.1.1210 mM 磷酸盐磷酸盐pH 7.0USP Tf1.1.412.1.503.1.334.1.395.1.366.1.0025 mM 磷酸盐磷酸盐pH 7.0 在中等在中等pH下下,离子强度较高离子强度较高,能有效掩蔽硅羟基的二次作用减少拖尾能有效掩蔽硅羟基的二次作用减少拖尾样品样品:Tricyclic Antidepressants（三环抗抑郁剂）三环抗抑郁剂）1.Desipramine（脱甲丙咪嗪）脱甲丙咪嗪）2.Nortriptyline（去甲替林）去甲替林）3.Doxepin（多塞平）多塞平）4.Imipramine（丙咪嗪）丙咪嗪）5.Amitriptyline（阿米替林）阿米替林）6.TrImipramine（三甲丙咪嗪）三甲丙咪嗪）Agilent Technologies 48页页TEA对碱性成分峰形的影响对碱性成分峰形的影响0 2.5 5.0Time(min)12345色谱柱色谱柱:ZORBAX Eclipse XDB-C8,4.6 x 150 mm,5 mm 流动相流动相:85%25 mM Na2HPO4:15%ACN 流速流速:1.0 mL/min.温度温度:35CUSP TF 5%1.1.292.1.333.1.634.2.355.1.57No TEA10 mM TEAUSP TF 5%1.1.192.1.183.1.204.1.265.1.14Time(min)0.02.55.035421pH 7样品样品:1.Phenylpropanolamine（去甲麻黄碱）去甲麻黄碱）2.Ephedrine（麻黄素）麻黄素）3.Amphetamine（苯丙胺）苯丙胺）4.MethAmphetamine（脱氧麻黄碱）脱氧麻黄碱）5.Phenteramine （苯丁胺）苯丁胺）Agilent Technologies 49页页竞争酸对酸性组分的峰形的影响竞争酸对酸性组分的峰形的影响色谱柱色谱柱:ZORBAX StableBond SB-C184.6 x 150 mm,5 mm流动相流动相:40%A:60%ACN流速流速:1.0 mL/min.温度温度:室温室温样品样品:Ibuprofen（异丁苯丙酸）异丁苯丙酸）pKa 4.4pH 35 mM NaH2PO4Tf=1.8pH 35 mM NaH2PO41%乙酸乙酸pH 2.50.1%三氟乙酸三氟乙酸Tf=1.0Tf=1.09A:乙酸和三氟乙酸均能作为竞争酸填加至流动相中乙酸和三氟乙酸均能作为竞争酸填加至流动相中 三氟乙酸由于所需浓度较低三氟乙酸由于所需浓度较低,可作为首选可作为首选Agilent Technologies 50页页色谱柱技术色谱柱技术 5988-6467EN流动相对色谱的影响流动相对色谱的影响(TE40)液相色谱柱液相色谱柱:ZORBAX Eclipse XDB-C8色谱柱尺寸色谱柱尺寸:4.6 x 50 mm 3.5m部件号部件号:935967-906UV:254 nm流速流速:1 mL/min.室温室温1.Uracil2.Butylparaben3.Naphthalene4.Dipropylphthalate5.Acenaphthene1.尿嘧啶尿嘧啶2.尼帕尔金丁酯尼帕尔金丁酯3.萘萘4.二丙基邻苯二甲酸酯二丙基邻苯二甲酸酯5.苊苊刻度混合刻度混合:Dial-a-Mix A:水水 B:甲醇甲醇,用泵抽取用泵抽取50%B体积比混合体积比混合:Vol/Vol250 mL水水+250 mL甲醇甲醇,用泵用泵抽取抽取100%混合液混合液定容混合定容混合:Mix-to-Mark 250 mL甲醇甲醇,用水定容至用水定容至500 mL,用泵抽取用泵抽取100%混合液混合液预混合（重量比混合）预混合（重量比混合）:Premixed(w/w)200 g甲醇甲醇+200 g水水,用泵抽取用泵抽取100%混合液混合液改变流动相配比方改变流动相配比方式式,可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）Agilent Technologies 51页页液相分析液相分析-小诀窍小诀窍1.提高柱温，可增加柱效（提高灵敏度）提高柱温，可增加柱效（提高灵敏度）2.减小柱内径，可增加柱效（提高灵敏度）减小柱内径，可增加柱效（提高灵敏度）3.缩短检测器响应时间，可增加柱效（提高灵敏度）缩短检测器响应时间，可增加柱效（提高灵敏度）4.减小柱外体积，可增加柱效（提高灵敏度）减小柱外体积，可增加柱效（提高灵敏度）5.使用超纯硅胶，可增加柱效（提高灵敏度）使用超纯硅胶，可增加柱效（提高灵敏度）6.使用高能量氘灯，可增加柱效（提高灵敏度）使用高能量氘灯，可增加柱效（提高灵敏度）7.使用中孔透光氘灯，可增加柱效（提高灵敏度）使用中孔透光氘灯，可增加柱效（提高灵敏度）8.改变流动相改变流动相pH，可增加柱效（提高灵敏度），可增加柱效（提高灵敏度）9.改变有机相改变有机相%，可增加柱效（提高灵敏度），可增加柱效（提高灵敏度）10.改变键合相改变键合相，可增加柱效（提高灵敏度），可增加柱效（提高灵敏度）11.改变有机添加剂改变有机添加剂，可增加柱效（提高灵敏度），可增加柱效（提高灵敏度）12.改变流动相配比方式改变流动相配比方式，可增加柱效（提高灵敏度），可增加柱效（提高灵敏度）Agilent Technologies 52页页生化生化 多肽多肽-5988-6316EN升温对于反相升温对于反相 HPLC分离强疏水肽的影响分离强疏水肽的影响(B27)Polypeptide流动相流动相:A:含含0.05%三氟乙酸的水三氟乙酸的水B:含含0.05%三氟乙酸的乙腈三氟乙酸的乙腈2%B/min进样量进样量:100L(50g的的6M脲脲/5%乙酸乙酸)UV:210 nm流速流速:1 mL/min室温室温液相色谱柱液相色谱柱:ZORBAX StableBond-C18色谱柱尺寸色谱柱尺寸:4.6 x 250 mm 5m部件号部件号:880975-902室温室温300C400C500C600C700C提高柱温，可增加柱提高柱温，可增加柱效（提高灵敏度）效（提高灵敏度）Agilent Technologies 53页页环保环保样品样品:除草剂除草剂流动相流动相:52/48 0.1 M乙酸乙酸钠钠/甲醇甲醇,pH 6流速流速:0.45 mL/min温度温度:40,90检测检测:UV除草剂除草剂:柱温的影响柱温的影响Herbicides:Effect of Column Temperature1.西玛津西玛津2.敌草隆敌草隆3.扑灭津扑灭津4.扑灭净扑灭净5.异丙甲草胺异丙甲草胺1.Simazine2.Diuron3.Propazine4.Prometryn5.Metolachlor液相色谱柱液相色谱柱:Zorbax StableBond-C18色谱柱尺寸色谱柱尺寸:4.6 x 150 mm,5m部件号部件号:883975-902 目录目录P6254090提高柱温，可增加柱提高柱温，可增加柱效（提高灵敏度）效（提高灵敏度）Agilent Technologies 54页页生物制药生物制药液相色谱柱液相色谱柱:Zorbax 300 StableBond-C3色谱柱尺寸色谱柱尺寸:4.6 x 150 mm,5m 部件号部件号:883995-909肽类肽类/蛋白质蛋白质:升温对分离的影响升温对分离的影响Peptides/Proteins:Effect of Elevated Temperature样品样品:多肽多肽 流动相流动相:A=5:95,乙腈乙腈:水水,0.10%三氟乙酸三氟乙酸(V/V%)B=95:5,乙腈乙腈:水水,0.085%三氟乙酸三氟乙酸(V/V%)梯度梯度:在在 20 min内内 15-53%,后运行时间后运行时间 12 min流速流速:l.0 mL/min 温度温度:室温室温-60检测检测:UV 215 nm1.亮氨酸脑啡亮氨酸脑啡呔呔 2.血管紧张素血管紧张素II 3.核糖核酸酶核糖核酸酶A 4.牛胰岛素牛胰岛素 5.细胞色素细胞色素C 6.溶菌酶溶菌酶 7.肌红蛋白肌红蛋白 8.碳酸酐酶碳酸酐酶1.L e u c i n e Enkephalin2.Angiotensin II3.Rnase A4.Insulin(BOV)5.Cytochrome C6.Lysozyme7.Myoglobin8.C a r b o n i c anhydrase 目录目录P611提高柱温，提高柱温，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）Agilent Technologies 55页页生物制药生物制药液相色谱柱液相色谱柱:Zorbax StableBond-C8色谱柱尺寸色谱柱尺寸:150 mm,5m减小毛细管内径来提高减小毛细管内径来提高低浓度样品的检测灵敏度低浓度样品的检测灵敏度Reducing Capillary ID to Improve Sensitivityfor Concentration-Limited Samples流动相流动相:60%乙腈乙腈/40%水水流速流速:内径内径 0.3 mm-4 uL/min内径内径 0.5 mm-10 uL/min内径内径 1.0 mm-50 uL/min内径内径 4.6 mm-1.0 uL/min温度温度:室温室温检测器检测器:UV 254 nm样品样品:200 ng联二苯联二苯(100 nl)目录目录P611减小柱径，可增减小柱径，可增加柱效（提高灵加柱效（提高灵敏度）敏度）Agilent Technologies 56页页色谱柱技术色谱柱技术 5988-6454EN使用小体积色谱柱对于检测器使用小体积色谱柱对于检测器响应时间的重要性响应时间的重要性(TE32)液相色谱柱液相色谱柱:ZORBAX StableBond-C18色谱柱尺寸色谱柱尺寸:4.6 x 15 mm 3.5m部件号部件号:831975-902流动相流动相:乙腈乙腈:1%甲酸甲酸=32:68UV:254 nm流速流速:1.0 mL/min.30C进样量进样量:5 L响应时间响应时间:4.0秒秒响应时间响应时间:2.0秒秒响应时间响应时间:1.0秒秒响应时间响应时间:0.5秒秒响应时间响应时间:0.1秒秒1.尿嘧啶尿嘧啶2.乙酰水杨酸乙酰水杨酸3.N-乙酰苯胺乙酰苯胺1.Uracil2.Acetylsalicylic acid3.Acetanilide缩短检测器响应时间，可缩短检测器响应时间，可增加柱效（提高灵敏度）增加柱效（提高灵敏度）Agilent Technologies 57页页色谱柱技术色谱柱技术 5988-6428EN不同硅胶类型比较不同硅胶类型比较(TE1)流动相流动相:含含0.05%甲醇的二氯甲甲醇的二氯甲烷烷 液相色谱柱液相色谱柱1.toluene2.benzanilide3.phenol4.benzyl alcoholZorbax SilSpherisorbZorbax Rx-Sil1.甲苯甲苯2.N-苯甲酰苯胺苯甲酰苯胺3.苯酚苯酚4.苯甲醇苯甲醇使用高纯硅胶，使用高纯硅胶，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）Agilent Technologies 58页页有机化学有机化学 5988-6366ENpH对苯胺取代物分析的影响对苯胺取代物分析的影响(ORCH1)流动相流动相25mM磷酸磷酸:甲醇甲醇=58:42 流速流速:1 mL/min 22C液相色谱柱液相色谱柱:ZORBAX StableBond-C18色谱柱尺寸色谱柱尺寸:4.6 x 150 mm 5m部件号部件号:883975-9021.对位甲氧基苯胺对位甲氧基苯胺2.间位苯甲胺间位苯甲胺3.3-氨基氨基-苯甲腈苯甲腈4.对位氯苯胺对位氯苯胺5.间位氯苯胺间位氯苯胺6.邻位氯苯胺邻位氯苯胺1.p-anisidine2.m-toluidine3.3-amino-benzonitrile4.p-chloroaniline5.m-chloroaniline6.o-chloroanilinepH:2.5pH:7.0改变流动相改变流动相pH，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）Agilent Technologies 59页页生化生化 肽肽 5988-6293EN三氟乙酸浓度对于反相肽的分离的影响三氟乙酸浓度对于反相肽的分离的影响(B10)Peptide流动相流动相:A:水和三氟乙酸水和三氟乙酸B:乙腈和三氟乙酸乙腈和三氟乙酸0-30%B（30 min.内）内）流速流速:1 mL/minUV:254 nm进样量进样量:6uL十肽菌素标样十肽菌素标样S1-S5（疏水性有略微差异疏水性有略微差异）40C液相色谱柱液相色谱柱:ZORBAX 300 SB-C8色谱柱尺寸色谱柱尺寸:4.6 x 150 mm 5m部件号部件号:883995-9061.0%三氟乙酸三氟乙酸0.05%三氟乙酸三氟乙酸0.25%三氟乙酸三氟乙酸改变流动相改变流动相pH，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）Agilent Technologies 60页页食品分析食品分析 5988-6360EN流动相强度对单糖和二糖分离的影响流动相强度对单糖和二糖分离的影响(FD4)流动相流动相:乙腈乙腈/水如图水如图流速流速:1 mL/min示差折光检测器示差折光检测器液相色谱柱液相色谱柱:ZORBAX NH2 色谱柱尺寸色谱柱尺寸:4.6 x 250 mm 5m部件号部件号:880952-7081.果糖果糖2.葡糖葡糖3.蔗糖蔗糖4.Palatinose5.海藻糖海藻糖6.异麦芽糖异麦芽糖1.Fructose2.Glucose3.Saccharose4.Palatinose5.Trehalulose6.Isomaltose乙腈乙腈/水水70/30乙腈乙腈/水水75/25 改变有机相改变有机相%，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）Agilent Technologies 61页页色谱柱技术色谱柱技术 5988-6468EN有机改性剂和有机改性剂和pH对于选择性的影响对于选择性的影响(TE5)流动相流动相:25 mM磷酸缓冲液磷酸缓冲液流速流速:1.0 mL/min.22C液相色谱柱液相色谱柱:ZORBAX StableBond-CN色谱柱尺寸色谱柱尺寸:4.6 x 150 mm 5m部件号部件号:883975-9051.anisidine2.m-toluidine3.4-cl-aniline4.3-aminobenzonitrile5.3-cl-aniline6.2-cl-aniline1.甲氧基苯胺甲氧基苯胺2.间位苯甲胺间位苯甲胺3.4-氯氯-苯胺苯胺4.3-氨基苯甲腈氨基苯甲腈5.3-氯氯-苯胺苯胺6.2-氯氯-苯胺苯胺42%甲醇甲醇：58%缓冲液缓冲液 30%甲醇甲醇：70%缓冲缓冲液液pH 2.6pH 3.0改变有机相改变有机相%，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）Agilent Technologies 62页页色谱柱技术色谱柱技术 5988-6453ENZORBAX Eclipse系列色谱柱系列色谱柱的选择性的选择性(TE31)液相色谱柱液相色谱柱:ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl色谱柱尺寸色谱柱尺寸:4.6 x 150 mm 5m部件号部件号:993967-912流动相流动相:甲醇甲醇:水水=70:30UV:254 nm流速流速:1.0 mL/min.室温室温Zorbax Eclipse XDB-苯基苯基Zorbax Eclipse XDB-C8Zorbax Eclipse XDB-C181.尿嘧啶尿嘧啶2.苯酚苯酚3.4-氯氯-硝基苯硝基苯4.甲苯甲苯5.萘萘1.Uracil2.Phenol3.4-Cl-nitrobenzene4.Toluene5.Naphthalene改变键合相，改变键合相，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）Agilent Technologies 63页页生物制药生物制药液相色谱柱液相色谱柱:Zorbax Extend-C18色谱柱尺寸色谱柱尺寸:2.1 x 150 mm,5um部件号部件号:773700-902三氟乙酸和氢氧化铵用于肽类三氟乙酸和氢氧化铵用于肽类RP-HPLCESI-MS分离的选择性比较分离的选择性比较Selectivity Comparison of TFA and NH4OH for Peptide RP-HPLCESI-MS Analysis流速流速:0.25 mL/min.温度温度:25 梯度梯度:5-60%B in 20 min.LC/MS:正离子正离子,ESI-Vf 70V,Vcap 4.5 kV,N2-35 psi,12 L/min.,300样品样品:4L(各各50 ng)三氟乙酸条件三氟乙酸条件:A-0.1%三氟乙酸水溶液三氟乙酸水溶液B-0.085%三氟乙酸三氟乙酸 80%的乙腈溶的乙腈溶液液NH4OH条件条件:A-20 mM NH4OH水溶液水溶液B-20 mM NH4OH 80%的乙腈的乙腈溶液溶液 目录目录P613改变有机添加剂，改变有机添加剂，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）Agilent Technologies 64页页生化生化 肽肽 十肽菌素十肽菌素 5988-6299EN酸对于反相肽的分离的影响酸对于反相肽的分离的影响(B16)decapeptide流动相流动相:A:含相应的酸的水相含相应的酸的水相 B:含相应的酸的乙腈含相应的酸的乙腈 0%-30%B（30 min.内）内）进样量进样量:6L肽标样肽标样UV:254 nm流速流速:1 mL/min40C液相色谱柱液相色谱柱:ZORBAX 300 SB-C8 色谱柱尺寸色谱柱尺寸:4.6 x 150 mm 5m部件号部件号:883995-9061.十肽菌素十肽菌素 S12.十肽菌素十肽菌素 S23.十肽菌素十肽菌素 S34.十肽菌素十肽菌素 S45.十肽菌素十肽菌素 S51.decapeptide S1 2.decapeptide S2 3.decapeptide S3 4.decapeptide S4 5.decapeptide S50.1%三氟乙酸三氟乙酸0.025 M H3PO4改变有机添加剂，改变有机添加剂，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）Agilent Technologies