聚合酶链式反应课件

基因克隆（感受态细胞制备、转化、质粒提取、酶切鉴定）基因克隆（感受态细胞制备、转化、质粒提取、酶切鉴定）Western blot（蛋白质提取、（蛋白质提取、SDS-PAGE、转膜、免疫检测）、转膜、免疫检测）RT-PCR（RNA 提取、逆转录、提取、逆转录、PCR）实验内容实验内容实验考试实验考试分子生物学技术分子生物学技术 聚合酶链式反应聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）Kary B.MullisUSA,for his invention of the polymerase chain reaction(PCR)method The Nobel Prize in Chemistry 1993 体外体外高效、快速、特异高效、快速、特异地扩增目的基因或地扩增目的基因或DNA片段片段 PCR 基本原理基本原理 PCR反应体系反应体系 PCR 结果分析结果分析 PCR 方法拓展方法拓展 PCR 的应用的应用PCR 的基本原理 其原理类似于其原理类似于DNA的体内复制的体内复制，在试管中的在试管中的DNA的体外合成。的体外合成。5353Direction ofunwindingContinuous replicationPrimer53Primer53Discontinuous replication53Primer岡崎片段岡崎片段(okazaki fragment)replication forkDNA的体内复制：的体内复制：原料：原料：template DNA（genomic DNA），），RNA primer，dNTPs酶：酶：解旋酶，引物酶，解旋酶，引物酶，DNA聚合酶，聚合酶，连接酶连接酶反应条件：反应条件：胞液环境，胞液环境，37 反应过程：反应过程：起始（模板起始（模板DNA解链、形成引发体）、解链、形成引发体）、延长、终止延长、终止（三阶段）（三阶段）产物：产物：模板模板DNA（基因组基因组DNA）拷贝数增加拷贝数增加一倍一倍PCR：template DNA（genomic DNA，cDNA）,a pair of specific oligonucleotide primer，dNTPsDNA polymerasebuffer，三种，三种变化的温度变化的温度（94，50-70，72），），cycles（25-35）denaturation、annealing、extension（三阶段，（三阶段，多循环多循环）目的目的DNA（特异性）（特异性）拷贝数增加拷贝数增加 倍倍Denaturation（变性）（变性）template DNA(dsDNA)95denaturation ssDNA Annealing（退火）（退火）Primer（引物）：两条寡核苷酸链；分别与待（引物）：两条寡核苷酸链；分别与待扩增的扩增的目标片段两端目标片段两端的序列互补。的序列互补。primersExtension（延伸）（延伸）Taq 酶酶dNTPSn 新合成的链又可作为下轮循环反应的模板新合成的链又可作为下轮循环反应的模板。lDNA聚合酶聚合酶：催化反应体系中游离的单核苷酸：催化反应体系中游离的单核苷酸（dNTPs）由引物）由引物53方向，按碱基配对的原则方向，按碱基配对的原则延伸，形成两条与模板延伸，形成两条与模板DNA互补的复制链。互补的复制链。变性变性-退火退火-延伸延伸一个一个PCR循环循环n尽管尽管PCR扩增扩增DNA非常有效，但目的非常有效，但目的DNA序序列的指数扩增并不是一个无限制的过程。列的指数扩增并不是一个无限制的过程。n在正常的反应条件下，在正常的反应条件下，30次循环，酶的催化次循环，酶的催化反应趋于饱和反应趋于饱和-平台效应平台效应(Plateau)n“平台效应平台效应”出现的迟早还取决于出现的迟早还取决于酶的性能酶的性能、模板模板DNA的的拷贝数、拷贝数、dNTP浓度浓度等多种因素。等多种因素。理论上，理论上，n个循环后，产量为个循环后，产量为2n拷贝。拷贝。实际上，实际上，PCR的扩增倍数为的扩增倍数为（1+X）n，X为扩增效率，平均为为扩增效率，平均为75%PCR反应体系与反应条件反应体系与反应条件 成分 加量（ul）灭菌双蒸水灭菌双蒸水 X10PCR 缓冲液缓冲液 5.0MgCl 2 2-8.0dNTPs 1-2.0引物引物A 1-2.0引物引物B 1-2.0Taq酶酶 0.25模板模板血液血液陈旧血痕陈旧血痕组织块或石蜡包埋组织组织块或石蜡包埋组织绒毛绒毛毛发毛发羊水脱落细胞羊水脱落细胞尿尿咽拭子咽拭子DNARNA mRNA cDNAprimer引 物 长 度：引 物 长 度：1 5-3 0 b p，常 用 为，常 用 为 2 0 b p2 0 b p 左 右。左 右。2.2.保证引物中保证引物中G-CG-C比例为比例为50%15%，ATGC最好随机分最好随机分布。布。避免两条引物间或引物内部互补，特别是避免两条引物间或引物内部互补，特别是33端的互补。端的互补。4.4.length20bp Ta=62.3 C+0.41 C*(%GC)-5 C 保证每个引物的保证每个引物的TmTm值相匹配，且在值相匹配，且在70-75 70-75 C 范围内。范围内。5.5.检测目的检测目的DNADNA序列看是否有错配区域，计算机程序分析可以序列看是否有错配区域，计算机程序分析可以帮助避免使用设计不合理的引物对。帮助避免使用设计不合理的引物对。引物的引物的3端端:必须严格互补必须严格互补引物的引物的5端端:可以不严格互补可以不严格互补,可以加酶切位点，可以加酶切位点，加标记物加标记物,引入突变位点等引入突变位点等5-ggttacttccctcgatttgg gcggggattcccttccatttt tttcttcccttttctcccaagatccagcttcttggggg cactcacgggtgcccgttgcgttctgctccgtcg gcccc/ggagctgcatggccaactcccaccag gggccgctcctcccctaccccccacccccggg ctccctctttaagtctctagctcaaggtaccc gcct ctccaaagggctcgtccc-3(229bp)ggttacttccctcgatttgggaggtttcccgagcaggg-5DNA polymerase催化一典型的催化一典型的PCR反应约需酶量反应约需酶量2.5U(指总反应体积为指总反应体积为100ul时时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。则合成产物量减少。(dNTPs)ndNTP是是dATP、dCTP、dGTP和和dTTP的总的总称，是靶称，是靶DNA 序列扩增的原料。序列扩增的原料。ndNTP浓度根据靶序列的长度和组成而定，浓度根据靶序列的长度和组成而定，一般使用浓度在一般使用浓度在50-200umol/L之间之间 buffer/Mg2+n常用的缓冲液体系为常用的缓冲液体系为10-50mmol/LTris-10-50mmol/LTris-HClHCl（pH8.3-8.8,20pH8.3-8.8,20）nTaqDNATaqDNA聚合酶需要聚合酶需要游离游离MgMg2+2+。PCR反应条件反应条件变性变性 95 5min变性变性 95 1min退火退火 55 1min延伸延伸 72 1min延伸延伸72 1min35 cycles变性变性95 延伸延伸72 退火退火Tm-5Analysis of PCR productsGel analysis(琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳/聚丙烯酰胺凝胶电聚丙烯酰胺凝胶电泳泳):PCR 产物电泳，产物电泳，EB（溴乙锭）染色，（溴乙锭）染色，紫紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。外仪下观察，初步判断产物的特异性。Restriction-endonuclease digestion analysis：酶切、电泳分离。酶切、电泳分离。产物的鉴定，基因分型，研究变异性。产物的鉴定，基因分型，研究变异性。Hybridization：(Southern blot/dot blot )Sequence analysis：是检测是检测PCR产物特异性的产物特异性的 最可靠方法。最可靠方法。DNA测序测序1.Sanger法（双脱氧末端终止法）法（双脱氧末端终止法）用用4种种2,3 双脱氧核苷酸（双脱氧核苷酸（ddNTP）代）代替部分脱氧核苷酸（替部分脱氧核苷酸（dNTP）作为底物进行）作为底物进行DNA合成反应，从而获得在不同部位终止反应合成反应，从而获得在不同部位终止反应的大小不同的的大小不同的DNA链，经高分辨率变性聚丙烯链，经高分辨率变性聚丙烯凝胶电泳分离，就可以对凝胶电泳分离，就可以对DNA序列进行分析序列进行分析Sanger法测定法测定DNA序列序列2.DNA自动化测序自动化测序方法要点方法要点DNA自动测序结果举例自动测序结果举例PCR METHODS STANDARD PCR HOT START PCR RT PCR IN SITU PCR PCR-ELISA REAL TIME QUANTITATIVE PCR HOT START PCRIn hot-start PCR，at least one reaction component,which can include the polymerase,salt(KCl or MgCl2)or dNTP(s),is withheld from the reaction until the system reaches a particular temperature.RT-PCR(Reverse transcription-PCR)n1.RNA preparation n2.Reverse transcriptionn3.PCRn4.Result Analysis:Quantification or cDNA cloneSemi-Quantify RT-PCRn1.RNA preparetion n2.Reverse transcriptionn3.PCR:a.Target Gene Specified primer b.GAPDH or-actin primern4.QuantificationTarget GeneGAPDH or-actin在相对定量检测中在相对定量检测中,为了比较不同为了比较不同样本样本mRNA 表达量水平表达量水平,要求不同要求不同的样本之间的样本之间起始细胞数目相同起始细胞数目相同,RNA 提取效率相同提取效率相同,且且目的基因的目的基因的扩增效率相同扩增效率相同,-不可能同时满足。不可能同时满足。为了避免不同标本在为了避免不同标本在RNA 的产量、的产量、质量及逆转录效率上可能存在的质量及逆转录效率上可能存在的差别差别,获得目标基因特异性表达的获得目标基因特异性表达的真正差异真正差异-选择一定的内参基因选择一定的内参基因进行校正和标准化进行校正和标准化甘油醛甘油醛-3-磷酸脱氢酶磷酸脱氢酶根据实验，选择内参基因根据实验，选择内参基因REAL TIME QUANTITATIVE PCR 原理：原理：根据荧光染料形成根据荧光染料形成 特异性荧光信号的特异性荧光信号的 强度，计算出模板强度，计算出模板 DNADNA或或mRNAmRNA的含量的含量 用途：用途：定量分析定量分析mRNAmRNA或或DNADNA优点：优点：可进行自动化定量可进行自动化定量 分析、降低假阳性分析、降低假阳性实时实时PCR的基本过程的基本过程基因克隆基因克隆医学检测医学检测 (基因诊断基因诊断)WHAT CAN PCR DO FOR US?一、基因克隆一、基因克隆:PCR PCR 应用应用PCR ProductPCR ProductdigestmixDNA ligaseplasmid Gene cloning:PCR product+vector PCR法法设计引物设计引物分段分段PCR基因改造基因改造再次再次PCR获得突变基因获得突变基因(一一).基因突变的检测基因突变的检测 1、基因缺失或插入、基因缺失或插入 基因检测基因检测点突变点突变 位于酶切位点上的点突变：位于酶切位点上的点突变：限制性酶切片段分析法限制性酶切片段分析法 不在酶切位点上的点突变：不在酶切位点上的点突变：单链构象多态性分析法单链构象多态性分析法(PCR-SSCP)致病基因上的未知点突变：致病基因上的未知点突变：PCR-SSCP（单核苷酸多态性，（单核苷酸多态性，SNP）PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)限制性限制性 片段长度多态性片段长度多态性n1.分析已知突变分析已知突变。n2.突变碱基涉及酶切位点的变化。突变碱基涉及酶切位点的变化。nPCR-酶切酶切-电泳电泳PCR-RFLP5 CCACGG 33 GGTGCC 5*5 CCATGG 33 GGTACC 5*Resistance to NcoI DigestionSusceptible to NcoI DigestionHomozygous Homozygous MutantMutantHomozygous Homozygous Wild-typeWild-typeHeterozygoteHeterozygoteDirection of ElectrophoresisPCR-RFLP单链构象多态性单链构象多态性(Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)的原理及特点的原理及特点n单链单链DNA片段片段 复杂的复杂的空间折叠构象空间折叠构象(主要是由主要是由 其内部碱基配对等分子内相互作用其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的力来维持的)一个碱基一个碱基发生改变发生改变 影响影响 其空间构其空间构象象,在聚丙烯酰在聚丙烯酰 胺凝胶中受排阻大小不同胺凝胶中受排阻大小不同.n非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离构象上有差异的分子分离构象上有差异的分子.PCR-SSCPSSCPPCRPCRATCGWildWildAmplify region of interestedDenature samples in Formamide or HeatATCGMutantMutantDenature samples in Formamide and HeatATCGATCGDNA molecules conformation depends on their sequenceRun on a Non-denaturing gel and look for mobility differencesWildWildMutanMutantSSCP（二）基因异常表达的检测（二）基因异常表达的检测 即检测致病基因的即检测致病基因的mRNA，在表达水平提供基因功能，在表达水平提供基因功能是否正常的直接证据。可采用是否正常的直接证据。可采用RT-PCR，灵敏度更高。，灵敏度更高。（三）外源基因的检测（三）外源基因的检测 适用于细菌、病毒、寄生虫等感染性疾病。适用于细菌、病毒、寄生虫等感染性疾病。（四）法医鉴定（四）法医鉴定（DNA指纹法）指纹法）个体识别和亲子鉴定个体识别和亲子鉴定法医学个体认定nDNA指纹技术建于指纹技术建于1985年年n英国的遗传学家英国的遗传学家Jeffreys采用小卫星采用小卫星(20-70bp的寡核苷酸的寡核苷酸串联重复序列串联重复序列)作探针进行人基因组作探针进行人基因组DNA的的Southern blot分析，在一个家系中获得了一张具有高度多态性的分析，在一个家系中获得了一张具有高度多态性的DNA图图谱，图谱的每一个成员都有各自独特的谱，图谱的每一个成员都有各自独特的DNA电泳谱带。电泳谱带。父父 长子、长女长子、长女 次子次子 次女次女 三女三女 母母随机引物随机引物PCRIndividual Identification?Mum child fa1 fa2 Nothing would be more specific and reliable than DNA for individual identification.Individual IdentificationMum child fa1 fa2