核酸的提取与纯化

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1、核酸的提取与纯化DNA的提取与纯化()实验目的与主要原理DNA 存在于细胞核中。通过裂解组织与细胞，使细胞膜破碎， 暴露出DNA与蛋白质的混合物。此时，通过蛋白酶的消化，使DNA 与蛋白质进行分离，而后利用硅胶柱或者酚：氯仿法，去 除蛋白质，从而提取高纯度DNA。(二) 实验材料蛋白质 K ( 20mg/ml ) ,裂解液( 100mmol/l Tris(pH8.0),500mmol/L EDTA(pH 8.0),20mmol/l NaCl,10% SDS)，硅 胶柱，TE(10mmol/l Tris-HCl,lmmol/L EDTA(pH 8.0),0.5*TAE (20mmol/l Tri

2、s-乙酸，0.5mmol/l EDTA,pH 8.0),10*Loading buffer(50mmol/l EDTA,60%甘油，0.25%溴酚蓝，pH 7.0)。(三) 实验方法DNA提取的方法目前主要有两种，一种是利用酚：氯仿抽提 的方法，另种是利用硅胶柱吸附的方法。其中酚：氯仿抽提法由于 试剂具有较强的腐蚀性和毒性，且对环境污染较大,目前使用者较少。 而硅胶柱的方法操作比较简单，且毒性很低，对环境的影响较少，故 而被广大实验者所使用。目前硅胶柱的生产厂家较多，以沉淀方法较 为多见，主要步骤如下。1 样本前处理哺乳动物细胞：提前准备55U冰浴。1) 对于贴壁细胞，用胰蛋白酶或其他方法收集

3、细胞，对于悬 浮细胞，直接收集细胞。用PBS洗3次。2) 加入 3 倍体积的裂解液，加入蛋白液 K 终浓度达到500ug/ml, 37C孵育 46 小时。动物组织：提前准备55U, 70U水浴。(1) 将25mg动物组织切碎，置于一无菌的1.5ml离心管中(注 意，尽量越碎越好)。(2) 加入150200ul的裂解液(含500ug/ml的蛋白酶K),55C 孵育直至完全裂解，(因组织不同而异，鼠尾68h,可以 过夜裂解，每小时颠倒23次)。(3) 如果需要去除RNA，可以加入适量RnaseA于样品中，室 温孵育加in。(4) 12000r离心5min，转移上清于一无菌的离心管。2 DNA提取过

4、程(1) 利用2倍体积无水乙醇和1/10体积的3mmol/L醋酸钠沉 淀DNA (注意沉淀为DNA，不能弃去)(2) 将上述混合物加入硅胶柱中,12000r离心1min,后用75% 的乙醇清洗杂质，洗23次。3) 将硅胶吸附柱置于干净的离心管中，在柱的中央加入200ul预热TE (60U),或去离子水(pH) 7.0),室温静 置1min, 12000r离心1min，洗脱DNA。洗脱出的DN A置于-2 0C保存。3琼脂糖凝胶电泳（1）1%琼脂糖的配制：例如：0.15g琼脂糖+15ml 0.5*TAE 微波炉加热至沸腾，待降低至70U加入Gold view 染料（5ug/100ml）,倒入小型

5、胶槽中（其他规模胶槽 按此比例配制）。室温静置40min。（2）取50100ng DNA，用去离子水补充体积至10ul，加入 1ul 10*DNA loading Buffer，进行电泳。电泳 120V 2030 min （电泳液 5*TAE）（四）注意事项1 裂解液与样品的比例要适当，过少的裂解液可能导致样 本裂解不完全，而过多的裂解液也会影响提取效果。2 尽量切碎组织，以免影响裂解效果；完全裂解后可以呈 粘稠状。3组织标本一般要保存在-80C冰箱或液氮中，且避免反复 冻融；使用无菌离心管和枪头，避免DNA酶污染。RNA的提取与纯化（一）实验目的与实验原理RNA的提取方法有很多种，其中Tri

6、zol试剂提取RNA是目前常用 的方法之一Trizol是由苯酚和异硫氰酸胍配制而成，在匀浆和 裂解过程中，Trizol可以裂解细胞、降解细胞其他成分，但同时 保护RNA，抑制RNA酶活性。在氯仿抽提后，RNA存留在水相中， 用异丙醇可以将其沉淀，最后得到RNA。二）实验材料Trizol,氯仿，DEPC 水，DEPC 水配制 75%乙醇，10*MOPS缓冲液（ 0.2mol/L MOPS,80mmol/l NaAc,10mmol/l EDTANa）,l*M0PS 电泳缓冲液（10*MOPS 150ml,37%甲醛 80ml, 2加水至1500ml）,10*RNA上样缓冲液（50%甘油，lmmol

7、/l EDTA,0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青）。三）实验步骤1 RNA的提取（1）25cm*25cm培养瓶细胞+1mlTrizol （吹打使之充分裂 解）；100ml组织+1mlTrizol （超声破碎仪破碎细胞使之充 分裂解），注：6孔板：加0.5mlTrizol。（2）收集后转入0. 5mlEP管，加200ml氯仿。（3）颠倒混匀至氯仿完全混匀，室温23min （发现液面分为两层，上层为清亮，下层为红色）。（4）离心：4C, 12000r,10min.（5）转上层水相到 1.5EP 管，尽量避免吸取中层蛋白质 层。注：上层为RNA;中层为蛋白；下层为DNA。（6）等体积异丙醇（40

8、0500ul）,充分混匀，冰浴10min。注：如果组织很少，为了增加RNA提取的量，可以将异丙 醇-20U预冷。（7）离心：4U, 12000r,15min.（8）弃上清，管底可见白色沉淀，即为RNA。(9) 加lml75%乙醇(DEPC水配制)，离心：4C, 12000r,5min。(10) 弃上清，加lml 75%乙醇(可根据实验要求省略)。(11) 离心：4U, 12000r,5min,弃上清。(12 )短暂离心1min，吸出残留乙醇，室温晾干5min (2025U)o(13)加入3040ul DEPC水，立即用于逆转录或置于75% 乙醇中保存于-80C冰箱。2 RNA甲醛变性琼脂糖凝胶

9、电泳(1)配置1.2%甲醛变性琼脂糖凝胶(20ml)琼脂糖0.24g无Rnase水17.4ml10*MOPS2.0ml37%甲醛0.6ml将琼脂糖加热融化后，加入10*MOPS,待胶冷却至60U 左右，加入甲醛倒入胶板。65r 5min,冰上骤冷，加入 0.51.0ul的溴化乙锭(1.0mg/ml),将配好的1.2%甲醛 变性胶先在1*甲醛变性胶电泳缓冲液中预电泳15mino RNA样品在510V/cm的电压电泳30min四) 注意事项1动物组织需在-80C或液氮保存，且在实验过程中避免冻 融。2 加液体的每一步都必须充分混匀，使试剂发挥作用。3 实验过程中需要戴手套和帽子操作，所有试剂和耗材都应该是进行无RNA酶处理，操作过程中避免RNA酶污染。