医学生物化学实验指导-第一章hido

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1、第一章 实实验基本本操作一、要求求1熟悉悉实验室室规则及及常用生生化仪器器2清点点洗刷实实验用具具。3掌握握各种仪仪器的正正规操作作及维护护二、常用用生化仪仪器 烧杯试管刻度吸量量管离心管滴管搅棒枪式移液液器及其其配适吸吸头混匀器恒温水浴浴箱离心机分光光度度计，电泳仪点收仪器器；根据仪器器清单，逐逐项查点点是否完完好(如如有缺损损向教师师声明及及时补充充更换)。本套仪器器由本人人使用保保管至全全部实验验课程结结束。三、基本本操作1玻璃璃仪器的的洗涤(1)洗洗涤液：洗洁精精，肥皂皂水，洗洗衣粉。玻璃仪仪器专用用洗涤液液：主要要成份为为中性稀稀氯氧化化剂，上上海日化化研究所所出品(2)洗洗涤的要要

2、求与步步骤：要求：洁洁净的玻玻璃器皿皿表面应应不挂任任何水滴滴。步骤： 不净净的器皿皿洗衣粉或或肥皂水水刷洗自来水冲冲净达到要求求？ 是是 浸浸入洗液液(数小小时至过过夜) 自来来水冲净净 蒸馏水水涮洗223次(其目的的是去除除自来水水中的杂杂质，故故应少量量多次，全全面充分分)烤干或晾晾干、备备用 对使用用过的仪仪器应养养成及时时清洗的的习惯，特特别是血血液分析析时用以以吸取血血液样本本的吸管管，用过过后应当当立即用用水将所所沾的血血液冲去去，否则则放置过过久，血血液干燥燥硬结，就就很不容容易清除除。 (3)玻璃仪仪器的干干燥 一般般的玻璃璃仪器均均可洗净净后倒置置架上，让让其水分分蒸发自自

3、然干燥燥，如需需迅速干干燥者应应按仪器器的不同同类型按按下述不不同方法法处理： 试管、离离心管、烧烧杯、烧烧瓶等普普通玻璃璃器皿可可置烤箱箱中10001055烘烤少量仪仪器如需需急用也也可在电电炉上或或酒精灯灯上烘烤烤。烘烤烤时应将将器皿时时时转动动，务使使受热缓缓慢且均均匀，并并将管口口(或杯杯口)倾倾斜向下下，以便便水蒸气气冷凝成成水滴，顺顺口流出出，不致致使水滴滴接触烘烘热了的的器壁而而使仪器器爆裂。使用电电吹风干干燥一般般玻璃仪仪器也很很便利常常用。下列玻玻璃仪器器应避免免烘烤：吸管：容易造造成器壁壁变形而而致容量量不准。比色杯杯：易在在烘烤时时发生破破裂。2移液液操作(1)吸吸量管的

4、的使用吸量管管的选择择：在一次完完成转移移的前提提下，应应选用容容量较小小的吸量量管。对于同同一次实实验中同同一种试试剂的移移取，应应选用同同一支吸吸量管操作(见图111) 用洗耳耳球将液液体吸至至超过标标线移开洗洗耳球，迅迅速用食食指压紧紧管口必要时时将管尖尖端外围围拭净调液面面至标线线放开食食指，使使液体流流入容器器将最后后液滴沿沿器壁而而下或吹吹出读数(见图112)吸量管管保持垂垂直视线与与液面应应水平管中液液面与刻刻度线应应呈切线线注：对于于刻度由由上至下下的吸量量管应尽尽量使用用上端刻刻度管尖尖残液是是否需吹吹出，看看清标记记。弯(2)枪枪式移液液器的使使用抢式移移液器的的结构(见图

5、33) 1. 液液体吸放放钮2体积积选取钮钮3. 体体积、显显示4枪头头排放钮钮5. 枪枪头排放放器6枪头头接嘴其内部柱柱塞分22段行程程，第11档为吸吸液，第第2档为为放液，手手感十分分清楚。操作(见图114)调体积积选取钮钮至所需需值套上枪枪头，旋旋紧垂直持持握枪式式移液器器外壳，按按下大拇拇指至第第1档将枪头头插入溶溶液，徐徐徐松开开大拇指指，使其其复原排放时时，重新新将大拇拇指按下下，至第第1档后后，继续续按至第第2档以以排空注：移取取过程中中应控制制速度，力力度如需移取取另一样样品，按按枪头排排放钮，更更换枪头头3混匀匀(1)旋旋转法：手持容容器，使使溶液作作离心旋旋转(2)指指弹法

6、：一手执执试管上上端，另另一手轻轻弹试管管下部，：使其中中液体作作涡旋运运动。(3)搅搅动法：使用玻玻璃棒搅搅边；多多用于溶溶解烧杯杯中的固固体。(4)混混匀器法法：将试试管置于于混匀器器的振动动盘上，逐逐渐用力力下压，使使内容物物旋转。(5)倒倒转混匀匀：适用用于具塞塞的容器器，如容容量瓶、具具塞量筒筒及具塞塞离心管管等。操操作时，将将容器反反复倒转转。试管管内的液液量太多多，也可可利用倒倒转混匀匀法，外外面包以以玻璃纸纸塞住管管口，然然后用手手指按住住橡皮塞塞将试管管反复倒倒转，溶溶液即可可充分混混匀。(6)吸吸管混匀匀法：用用吸管将将溶液反反复吸吹吹数次，以以达到混混匀的目目的。4加热热

7、与保温温(1)加加热(2)保保温使用恒恒温水浴浴箱，调调节温度度设定钮钮至需要要的温度度。水浴箱箱中水要要足量。实验过过程中应应随时监监测温度度，并及及时调节节。5离心心(1)离离心沉淀淀法：当颗粒小小而不均均一，沉沉淀粘稠稠或容积积小又需需精确定定量时，往往往采用用离心沉沉降法。(2)离离心前检检查：取出所所有套管管，起动动空载的的离心机机，看是是否转动动平稳。检查套套管有无无软垫，是是否完好好，内部部有无异异物。离心管管与套管管是否匹匹配。 (3)平平衡： 将一对对离心管管放入套套管，置置于天平平两侧，用用滴管较较轻一侧侧的离心心管与套套管之间间加水至至两侧平平衡(离离心管及及其内溶溶液量

8、不不能差别别过大) (4)离心： 将等重重的两管管置于离离心机中中的对称称位置，调调转速调调节钮，逐逐渐增加加转速至至所需值值，计时时，离心心结束后后，将套套管中的的水倒净净，所有有套管放放回离心心机中。 四、血血液样品品的制备备： 1采采取血液液样品的的注意事事项： (1)空腹采采血： 血液中中不少化化学成份份可受饮饮食影响响，一般般需在早早晨空腹腹或禁食食6小时时以上采采取血液液。 (2)防止酶酶的分解解作用： 血液内内若干化化学成份份在离体体后继续续分解。如如血糖被被红细胞胞糖酵解解酶系统统分解而而降低；为防止止酶分解解作用可可用氟化化钠、碘碘乙酸等等保存剂剂，或将将血液立立即制成成无蛋

9、白白血滤液液。(3)防防止溶血血：红细胞与与血浆中中成分与与含量皆皆有显著著的差别别，因此此溶血可可影响一一些血清清或血浆浆生化检检验的结结果。为为防止溶溶血，抽抽血用具具必须干干燥清洁洁，避免免剧烈振振摇，防防止污染染。 2抗凝凝剂：根据所测测定血液液成份不不同，标标本可应应用血清清、血浆浆或全血血。若需需血浆或或全血应应加抗凝凝剂。 (1)草草酸钾 为最最常用的的抗凝剂剂，02m88可使11nd血血液不凝凝固。它它与血液液内钙离离子形成成草酸钙钙使血液液不再凝凝固，但但不能用用于钾、钙钙测定。(2)草草酸钾一一草酸铵铵混合剂剂(3：2) 铵盐盐使红细细胞膨胀胀，钾盐盐使之皱皱缩，故故两者混

10、混合能保保持红细细胞体积积不变。(3)柠柠檬酸盐盐 与与钙离子子混合成成可溶性性钠络合合物，从从而防止止血液凝凝固。比比草酸钾钾较少产产生溶血血，故用用于红细细胞沉降降率测定定及输血血。但抗抗凝能力力较弱，一一般不作作生化检检验抗凝凝剂用。(4)氟氟化钠 有弱弱抗凝作作用，但但能抑制制糖酵解解和一些些水解酶酶类。草草酸钾-氟化化钠(33：1)、氟化化钠-麝香草草酚(110：11)是测测定血糖糖、尿酸酸、肌酐酐、无机机磷等的的良好抗抗凝剂。(5)肝肝素 能抑制制凝血酶酶原转化化为凝血血酶而抗抗凝血。抗抗凝能力力强，001022mg或或20单单位可使使1m11血液不不凝固，且且较少产产生溶血血。五

11、、实验验预习，实实验记录录，实验验报告1实验验预习实验前应应认真预预习，弄弄清实验验目的、原原理、操操作概要要、各步步操作的的意义及及注意事事项。2实验验记录准备一个个记录本本，在实实验时记记录实验验现象、实实验结果果和实验验数据。3. 实实验报告告每个同学学均应准准备一个个练习本本，以备备实验结结束后及及时整理理和总结结实验结结果，写写出实验验报告：实验报报告应包包括以下下项目：(1)实实验名称称(2)目目的和要要求(3)原原理(简简述实验验的基本本原理)(4)操操作(可可以采用用流程图图的方式式或以表表格方式式表示)(5)结结果与讨讨论 描述实实验出现现的现象象和结果果，分析析它们所所说明

12、的的问题，探探讨实验验成败的的关键。阐阐述对实实验设计计的改进进意见等等。对于于定量实实验列出出算式进进行计算算并对实实验结果果进行必必要的说说明和分分析。(6)思思考题(徐 洪)第二章 生物物化学实实验常用用方法第一节分分光光度度法 光线的的本质是是一种电电磁波，有有与电磁磁波和XX线类同同的性质质。光线线有不同同的波长长，肉眼眼可见彩彩色光称称之可见见光，波波长范围围在40007500nm，小小于4000nmm的光线线称为紫紫外线，大大于7550nmm的光线线称之红红外线。如如图所示示(表221)当光线通通过透明明溶液介介质时，其其幅射能能量有部部分被溶溶液吸收收，一部部分透过过，所以以光

13、线射射出溶液液介质之之后光能能被减少少。对溶溶液来说说，溶液液呈现不不同的颜颜色，是是由于溶溶液中的的质点(分子或或离子)选择性性地吸收收某种颜颜色的光光所引起起的。如如果各种种颜色的的透过程程度相同同，这种种物质就就是无色色透明的的，若只只让一部部分波长长的光透透过，其其它波长长的光被被吸收，则则溶液就就呈现出出透过光光的颜色色，并与与被吸收收的光的的颜色完完全互补补。任何何一种溶溶液，对对不同波波长的光光的吸收收程度是是不相等等的，一一些有色色物质可可以选择择性地吸吸收一部部分可见见光区的的光的能能量而呈呈现不同同颜色，一一些物质质却能特特征性地地选择吸吸收紫外外线的能能量。物物质吸收收由

14、光源源发出的的某些波波长的光光可形成成特定的的吸收光光谱。由由于物质质的吸收收光谱与与物质的的分子结结构有关关，而且且在一定定条件下下其吸收收程度与与该物质质的浓度度成正比比，所以以可利用用物质的的特定吸吸收光谱谱对其进进行定性性和定量量分析。分分光光度度法是利利用各种种物质所所具有的的这种吸吸收特征征所建立立起来的的分析方方法。 一、分分光光度度分析法法的基本本定律 劳伯比尔定定律(LLambbertt-Beeerllaw)是讨论论吸收光光能与溶溶液浓度度和溶质质层厚度度之间关关系的基基本定律律，是分分光分析析的理论论基础。 劳伯比尔定定律适用用于可见见光、紫紫外光、红红外光和和均匀非非散射

15、的的液体 (一) Laambeert氏氏定律 一束束单色光光通过透透明溶液液介质时时，光能能被吸收收一部分分，被吸吸收光能能的量与与溶液介介质厚度度有一定定比例关关系(见见图21)。表达式为为 这里里I0为入射射光强度度 I为为通过溶溶液介质质后的光光强度 L为为溶液介介质的径径长(ppathh leengtth) k为为吸光系系数(aabsoorpttionn cooeffficiientt)(ggcm-11) (二二)Beeer氏氏定律 以溶溶液介质质浓度变变化代替替溶液介介质厚度度的改变变，光能能的吸收收与浓度度改变有有类同的的关系，即即一束单单色光通通过溶液液介质时时，光能能被溶液液介

16、质吸吸收一部部分，吸吸收多少少与溶液液介质浓浓度有一一定的比比例关系系。得出下式式： 这里C(Conncenntraatioon)为为溶液介介质的浓浓度(ggL-1)将Lammbennt氏定定律和BBeerr氏定律律合并，即即(1)和(22)合并并为式中A(Abssorbbancce)为为吸光度度 T(TTrannsmiittaancee)为透透光度(4)式式也可表表达为 A=Cb.(55)式中(epssiloon)称称之摩尔尔吸光率率(Moolarr abbsorrptiivitty)(mollL-1cmm-1) C(cconccenttrattionn)浓度度(moolLL) b(ppat

17、hh leengtth)溶溶液样品品的长度度cm(或比色色皿内径径长cmm) (5)式为llambberttBeeer定律律的物理理表示式式，其含含义为一一束单色色光通过过溶液介介质后，光光能被吸吸收一部部分，吸吸收多少少与溶液液的浓度度和厚度度成正比比。此式式为分光光分析法法的基本本计算式式。 如果实实验中溶溶液厚度度b=llcm则则A=C图222表明，在在溶液介介质厚度度一定的的情况下下，吸光光度(AA)、透透光度(T)和和溶液介介质浓度度(C)之间的的关系。摩尔吸光光率()实际际上是物物质在单单位浓变变和单位位厚度下下对入射射光的吸吸光度，在在一定波波长下，越大表示物质对光的吸收越强。二

18、、定量量的分光光光度法法分析许多对光光有吸收收的物质质可以直直接用分分光光度度法进行行定量分分析：一一些对光光，包括括紫外、可可见或近近红外都都无吸收收的物质质亦可通通过和某某些化学学试剂作作用而呈呈色，在在一定的的反应条条件下和和一定的的浓度范范围内，溶溶液颜色色的深浅浅(对光光吸收的的程度)和该溶溶液中显显色物质质的浓度度呈正比比。(一)测测定波长长的选择择使用分光光法测定定溶液中中物质的的含量，首首先要选选择最适适单色波波长，因因为只有有以能被被溶液吸吸收的光光束作为为入射光光才能符符合LaambeertBeeer定律律。测定定有色物物质时，不不同颜色色的待测测溶液，则则应选择择不同波波

19、长的单单色光束束。在分分光光度度计上，单单色光波波长的选选择原则则一般是是使被测测溶液的的单位浓浓度的吸吸光度变变化最大大，同时时还要具具有最小小的空白白及干扰扰读数，借借以获得得最高的的灵敏度度和正确确性。最最理想的的办法是是对每种种物质的的测定都都应先傲傲它的光光谱吸收收曲线及及有关干干扰物的的吸收曲曲线，根根据这些些光谱吸吸收曲线线来选择择最佳测测定波长长。表222可供供波长选选择的参参考。(二)利利用标准准管计算算测定物物含量最适波长长选定以以后可进进行溶液液物质含含量的测测定。通通常都采采用对比比测定法法，即以以巳知精精确含量量的待测测物质的的溶液作作为参考考标准物物(Css)和未未

20、知待测测样品(Cx)用同一一方法，在在同一条条件下、同同时进行行测定，读读取标准准物质的的吸光度度(Ass)和未未知含量量的样品品吸光度度(Axx)，由由于标准准物质和和未知物物质是同同一物质质，其摩摩尔吸光光率(巨巨)相同同和进行行测定用用的比色色皿内径径长(bb)相同同即bss=bxx，根据据A=Cb式式，可得得到 As=Cs 换算成成下式 Ax=Cx 式中CCs是标标准管中中物质的的实际含含量，是是标准液液的浓度度与实际际用量的的乘积；Cx是是测定管管中物质质的实际际含量。还还应换写写到法定定单位mmmollL、mmgmm1。(三)利利用标准准曲线进进行换算算配制一系系列不同同浓度的的标

21、准的的溶液(至少五五个)按按测定管管同样方方法处理理显色，在在选定的的波长分分别测定定各管的的吸光度度(A)，以吸吸光度为为纵坐标标，标准准溶液的的浓度(C)为为横坐标标，在方方格坐标标纸上作作图，制制作标准准曲线。以以后在同同样条件件下进行行测定时时，测定定被测溶溶液的吸吸光度，从从标准曲曲线上可可找出相相应的浓浓度。根据LaambeertBeeer定律律，标准准液的浓浓度在一一定范围围内与吸吸光度呈呈直线关关系，标标准曲线线是这种种直线关关系的描描述，一一般认为为，标准准曲线范范围在测测定物浓浓度的一一半到二二倍之间间，并使使吸光度度在005100范围内内为宜。 还须注意意：曲线线制作与与

22、测定管管的测定定应在同同一仪器器上进行行，由于于曲线的的建立与与实验室室当时的的条件如如温度，湿湿度和气气压及电电压稳定定性等有有关，因因此标准准曲线常常因各种种变化而而需校正正或重做做。(四)摩摩尔吸光光率求取测测定物浓浓度当浓度为为1ML时，溶溶液厚度度为1ccm，吸吸光率用用表示，在在已知测测定物的的，则可可根据下下式求得得测定物物的物质质浓度。此计算法法常用于于紫外吸吸收，如如核苷酸酸溶液含含量测定定，如UUTP在在2622nm具具有最大大吸收峰峰，利用用已知UUTP在在2622nm时时的摩尔尔吸光率率，读取取待测UUTP溶溶液吸光光度A，即即可求出出该UTTP浓度度。二种以上上被测物

23、物的混合合液，也也可利用用不同进行定定量测定定。例如如a，bb两种物物质在波波长1时，摩摩尔吸光光率分别别为a1和和b1：，在波波长2时摩摩尔吸光光率分别别为a2和和b2，aa和b混混合的溶溶液在1时吸吸光度为为Al，在在2时的的吸光度度为A22(图223)，各各自浓度度分别为为Ca和和Cb，则则 如有三三种以上上成分的的混合液液，也可可通过三三种不同同波长情情况下的的吸光度度，以各各自特有有的值，依依据三元元一次方方程，同同样可求求出未分分离的三三种混合合物的各各自浓度度-三、物质质的定性性分析以不同波波长的单单色光作作为入射射光，测测定某一一溶液的的吸光度度，然后后以入射射光的不不同波长长

24、为横轴轴，各相相应的吸吸光度为为纵轴作作图，可可得到溶溶液的吸吸收光谱谱曲线。吸吸收光谱谱曲线是是物质的的特征性性曲线，它它和分子子结构有有严格的的对应关关系故可可作为定定性分析析的依据据。不同同的物质质，分子子结构不不同，其其吸收光光谱曲线线也有其其特殊形形状(图图24)。在吸收光光谱中，往往往可以以找到一一个或几几个吸收收最大值值，该处处的波长长称为最最大吸收收波长(入maax)。物物质不同同，它们们的波长长(nmm)最大大吸收波波长也往往往不同同，图114为维维生素BB12溶溶液的吸吸收光谱谱曲线。物质用分分光分析析定性主主要依据据吸收光光谱存在在的特征征吸收。1比较较吸收光光谱曲线线，

25、在相相同情况况下，吸吸收光谱谱曲线不不同，表表明物质质的化学学结构不不同，因因为不同同的物质质有各自自的特征征性曲线线。如AATP和和GTPP都属于于核苷酸酸，它们们的溶液液在紫外外光区均均有吸收收，但由由于化学学结构不不很一样样，它们们的吸收收光谱就就有差别别。需要要注意的的是在不不同条件件(如选选择不同同溶剂)下，即即使是同同一物质质也可呈呈现不同同的吸收收光谱。2比较较最大的的吸收波波长。不不同的物物质可有有不同的的最大吸吸收波长长(kmmax)。如AATP、GGTP、CCTP和和UTPP的maxx分别为为2599nm、2253nnm、2271nnm和2262nnm。LLnlaax可作作

26、为物质质定量测测定的最最适波长长，此时时测定灵灵敏度最最高。有有些物质质化学结结构相近近，可产产生相同同的maxx，伹它它们的吸吸收系数数都不一一致，可可据此鉴鉴别之。 3比较较吸光度度比值。可可根据物物质两个个或几个个不同波波长的吸吸光度比比值来鉴鉴别不同同的物质质，同时时也可检检查物质质的纯度度。如DDNA溶溶液kmmax为为2600nm。在在2600nm的的吸收度度和在2280nnm的吸吸收度比比值为118。但但溶液中中混进了了蛋白质质，则比比值会降降低(蛋蛋白质在在2800nm处处有最大大吸收)。四、常用用分光光光度计及及使用介介绍(一)7721型分分光光度度计 该机光光谱范围围在36

27、608000nm(可见光光区)，该该机灵敏敏度较高高，而且且结构简简单，操操作方便便，可用用于有色色物质溶溶液的测测定。17221型分分光光度度计光路路图和外外形图2使用用方法； (1)开开启电源源，指示示灯亮，选选择开关关置于“T”，波长长调置测测试用波波长。仪仪器预热热20分分钟。(2)打打开试样样室盖(光门自自动关闭闭)。调调节“0”旋钮，使使数字显显示为“000”盖上试试样室盖盖，将比比色皿架架处于蒸蒸馏水校校正位置置，使光光电管受受光，调调节透光光率“1000”旋钮，使使数字显显示为“1000.0”。 (3)将将选择开开关置于于“A”。调节节消光零零旋钮，使使得数字字显示为为“000

28、0”，然后后将被测测样品移移入光路路，显示示值即为为被测样样品的吸吸光度的的值。(4)如如果大幅幅度改变变测试波波长时，在在调整“0”和“1000”后稍等等片刻，(因光能能量变化化急剧，光光电管受受光后响响应缓慢慢，需一一段光响响应平衡衡时间)，当稳稳定后，重重新调整整“0”和1000即即可工作作。(5)每每台仪器器所配套套的比色色皿，不不能与其其它仪器器上的比比色皿单单个调换换。(6)换换一波长长测试时时，应将将选择开开关置“T”，重复复(2)和(33)操作作。(7)测测试完毕毕，关闭闭开关，电电源，将将比色皿皿冲洗干干净。 (三)UUV754型紫紫外分光光光度计计1. UUV7544紫外分

29、分光光度度计光路路图：由光源发发出的连连续辐射射光线，经经滤光片片和球面面反射镜镜至单色色器入射射狭缝处处聚焦成成像，光光束通过过入射狭狭缝，经经平面反反射镜到到准直镜镜，产生生平行光光射至光光栅。在在光栅上上色散后后，又经经准直镜镜聚焦在在出射狭狭缝上成成一连续续光谱，由由出射狭狭缝射出出定波波长的单单色光，通通过标准准溶液再再照射到到光电管管上。光源切换换与波长长移动相相对应 200nnm-2900nm需需点亮氘氘灯290nnm一3360nnm需同同时点亮亮氘灯和和钨灯360nnm-8500nm需需点亮钨钨灯单色器采采用自准准式系统统，衍射射光栅使使用该厂厂自制112000条nnm的复复制

30、闪跃跃光栅2测试试准备(1)打打开电源源开关之之前，检检查一下下测试样样品室。(2)试试样槽置置“参考”位置。(3)打打开电源源开关。如果波长长工作在在2000nm一一3000nm时时需按氘氘灯触发发按钮。(4)显显示器显显示7754”后，数数显为“10000”，则表表明仪器器已通过过自检程程序。此此时按AAC键键，仪器器自动进进入“00000吸光值值状态，测测试“连续”及“自动”打印状状态；(5)仪仪器预热热三十分分钟。3测试试(1)数数显“00000稳定后后，即可可把试样样槽置于于“样品”位置进进行测试试(即拉拉一下样样品室滑滑杆)。待待第一个个数据自自动打印印完毕后后，再可可将试样样槽置

31、于于第二个个“样品”位置测测试(即即再拉一一下样品品室滑杆杆)。(2)每每当需要要调换波波长时，必必须把试试样槽置置于“参考”位置，重重新调零零，现将将测试操操作顺序序如下：注意：样样品号超超过999号，打打印数复复位至000继续续计数下下去。(四)分分光光度度计和紫紫外分光光光度计计使用注注意事项项1光度度计的光光电管或或光电池池对不同同浓度的的光敏度度不一样样，应注注意每换换一次波波长，即即应将空空白溶液液的吸光光度调整整到0。2溶液液定量测测定，应应注意吸吸光度在在0005100范围，浓浓度太大大时应该该适当稀稀释。3一般般灵敏度度旋钮调调置“1”档，因因其放大大倍率最最小，较较稳定。(

32、五)双双波长分分光光度度计为了消除除背景吸吸收的影影响，提提高测定定的精确确度，可可采用双双波长分分光光度度法，仪仪器图示示如下：由图25可见见，从光光源发出出的光分分成两束束，分别别经过各各自的单单色器后后，分出出具有任任意波长长l和2的两两束单色色光，由由切光器器(斩波波器或称称扇面镜镜)调制制l和2，以以一定间间隔交替替照射装装有供试试品溶液液的比色色皿，然然后测量量和记录录它们之之间吸收收度的差差值。双波长分分光光度度法是通通过选择择二个适适当的波波长经过过斩波器器或扇面面镜，使使两个波波长分别别交替在在照射于于同一供供试品液液，测量量二个波波长处的的吸收度度之差A(A=AA2A1)，

33、来来消除不不相关吸吸收的方方法。双波长分分光光度度法由于于采用一一个比色色皿和两两道不同同波长的的光束进进行测量量，因而而不用参参比比色色皿，而而只用一一个比色色皿进行行测量，所所以能避避免由于于比色皿皿及样品品溶液和和参比溶溶液之间间的差别别等因素素所引起起的误差差，从而而可提高高测定的的精确度度。(六)荧荧光分光光光度计计 1荧光光分光光光度计种种类很多多，一般般均由激激发光源源、激发发单色器器、样品品皿和检检测器四四部分组组成。(1)光光源 主要用用于激发发荧光物物质产生生激发光光，通常常有汞灯灯和氙弧弧灯。对对光源的的要求是是能够产产生高强强度的，不不随波长长变化的的连续的的光谱。汞汞

34、灯提供供线性光光谱，由由于光强强度随波波长有很很大的变变化，作作为激发发光源有有一定的的局限性性，仅适适用于滤滤光片的的荧光计计的光源源，氙弧弧灯内有有氢气，通通电后氙氙气电离离，同时时产生很很强的光光源，并并提供22506000nm的的连续光光谱，最最高峰值值在4770nmm，适用用于记录录光谱图图。(2)单单色器 采用用滤色片片作单色色器的光光电荧光光计通常常有两个个滤光片片。处于于光源和和样品池池之间的的单色器器叫激发发单色器器；用于于选定不不同的激激发波长长，满足足不同溶溶液的需需要。处处于样品品池与检检测器之之间的单单色器叫叫发射滤滤光片，用用于滤去去样品池池里物质质受激发发后所产产

35、生的不不同波长长的可见见光。若用滤光光片代替替两个单单色器，这这样的仪仪器称为为荧光光光度计或或光电荧荧光计，这这类仪器器虽然结结构简单单，价格格低廉，但但是灵敏敏度低特特异性差差。若采采用棱镜镜或光栅栅作单色色器，这这类仪器器称为荧荧光分光光光度计计，但是是光栅色色散后谱谱线的波波长读数数是线性性的，并并且分辨辨率相同同时，光光栅色散散后得到到谱线强强度高于于棱镜，灵灵敏度高高。(3)样样品皿 大多多由石英英制成，某某些仪器器为了测测定低温温荧光，在在石英皿皿的外周周套上一一个装有有液氮的的透明石石英真空空瓶以降降低温度度。(4)检检测器 大多多数荧光光分光光光度计采采用光电电倍增管管作检测

36、测器。以以后的信信号处理理和显示示部件与与一般的的可见分分光计类类同。2荧光光分析的的应用分子荧光光光谱具具有灵敏敏度高、选选择好、操操作快速速等优点点。可适适用于生生物体内内微量的的有机物物和体内内代谢产产物的监监测与定定量。无机物很很少能发发出荧光光，无机机物的荧荧光分析析依赖于于待测元元素与有有机物形形成配合合物，具具有荧光光的配合合物可用用于荧光光分析，能能进行荧荧光分析析的元素素现已达达几十种种。此外荧光光光谱法法还有测测定葡萄萄糖、胆胆红素、叶叶胆原、胆胆汁酸和和某些激激素，甚甚至还可可借助于于酶的人人工底物物产生的的荧光测测定酶的的活性。(程枫)第二节电电泳法带电粒子子在电场场中

37、向与与自身带带相反电电荷的电电极移动动的现象象称为电电泳(EElecctroophooressis)，电泳泳技术是是生物化化学与分分于生物物学中的的重要研研究方法法之一。利利用电泳泳技术可可分离许许多生物物物质，包包括氨基基酸、多多肽、蛋蛋白质、脂脂类、核核苷、核核苷酸及及核酸等等，并可可用于分分析物质质的纯度度和分子子量的测测定等。电泳按介介质状想想来分，有有自由电电泳和区区带电泳泳两大类类。前者者以溶液液为介质质，在溶溶液中将将蛋白质质分离开开来。两两者相比比较，自自由电泳泳过程中中扩散严严重，分分辨率有有限，而而且设备备昂贵，操操作繁琐琐，现在在已基本本上被区区带电泳泳法所取取代。所所谓

38、区带带电泳法法，就是是在固体体支持物物上所进进行的电电泳。550年代代以来，常常用的固固体支持持物有滤滤纸、醋醋酸纤维维薄膜、淀淀粉凝胶胶、琼脂脂糖凝胶胶和聚丙丙烯酰胺胺凝胶等等等。区区带电泳泳法分辨辨率很高高，而且且设备简简单，操操作方便便，已经经是生物物化学及及分子生生物学领领域中极极为有用用的技术术。 一、电泳泳法的基基本原理理在酸性溶溶液中，蛋蛋白质分分子带正正电，而而在碱性性溶液中中，蛋白白质分子子带负电电。伹是是这并不不是实际际的电动动单位，从从物理化化学的原原理来分分析，带带电分子子的周围围由相反反电荷的的离子形形成扩散散双电层层，它由由紧密层层和扩散散层两部部分构成成。紧密密层

39、中相相反电荷荷的离子子被束缚缚在大分分子周围围，它在在电场中中是随大大分于一一起泳动动的，而而扩散层层中相反反电荷的的离子虽虽然也受受到大分分子的静静电引力力，但在在电场中中却会向向另一极极移动。紧紧密层表表面相对对于溶液液本体的的电位差差称之为为电动电电位即(Zeeta)电位，由由它决定定了蛋白白质分子子在电场场中的运运动速度度。蛋白质泳泳动分子子在电场场中受到到电动力力F的驱驱动，其其大小等等于净电电荷Q和和电场强强度E的的乘积： F=QQE如果假设设泳动分分于为球球体，它它在电场场中泳动动时也受受到一定定的阻力力F，按SStokke定律律，其大大小与球球体半径径r，介介质粒度度刁以及及泳

40、动速速度成正正比： F=6rv当恒速泳泳动时，电电动力FF与阻力力F相等，即即QE=6rv 带电粒子子在单位位电场强强度下的的泳动速速度，称称为迁移移率(mmobiilitty)或或泳动度度，以表示，即：所以可见，一一个带电电粒子的的迁移率率不仅取取决于其其本身所所带的电电荷，还还与带电电粒子的的大小、介介质的粘粘度等多多种因素素有关。在在具体实实验中，式中：vv为粒子子的泳动动速度(厘米秒或分分)，EE为电场场强度或或电势梯梯度(伏伏厘米米)，dd为粒子子移动距距离(厘厘米)，ll为支持持物的有有效长度度(厘米米)，uu为加在在支持物物两端的的实际电电压(伏伏)，11为通电电时间(秒或分分)

41、。故故迁移率率(或泳泳动度)的单位位为厘米米2秒-1伏特-11。假设物质质1和物物质2在在同一电电场中移移动距离离分别为为：经过时间间t之后后，两物物质(带带电粒于于)移动动的距离离之差力力：这就是说说，物质质1和22能否分分离开来来，取决决于两者者的迁移移率。若若它们的的迁移率率相同则则不能分分离，有有差别才才能分离离，差别别越大，分分离越好好。当然然，也与与其它实实验条件件有关。二、影响响电泳的的因素电泳结果果可受到到多种因因素的影影响，但但通常认认为以下下4个方方面更为为重要。(一)电电泳介质质的pHH当氨基酸酸为被分分离物质质时，各各种氨基基酸有不不同的等等电点，当当介质的的pH等等于

42、某氨氨基酸的的等电点点时，则则该氨基基酸处于于等电状状态，即即不向正正极或负负极移动动，当介介质pHH小于等等电点时时，氨基基酸呈阳阳离子状状态、向向负极移移动，反反之当介介质pHH大于等等电点时时，氨基基酸呈阴阴离子状状态，向向正极移移动。当当20种种氨基酸酸的混合合物置于于pH555左左右的介介质中电电泳时，可可以将它它们分离离为三组组。蛋白白质由氨氨基酸组组成，也也具有两两性电离离性质，所所以介质质的pHH值也影影响蛋白白质的电电离情况况，即决决定蛋白白质的带带电量(Q)。为为了保持持介质ppH的稳稳定性，常常用一定定pH的的缓冲液液，如分分离血清清蛋白质质常用ppH86的巴巴比妥缓缓冲

43、液或或三羟甲甲基氨基基甲烷(Triis)缓缓冲液。(二)缓缓冲液的的离子强强度离子强度度如果过过低缓冲冲液的缓缓冲容量量小，不不易维持持pH恒恒定；离离子强度度过高，则则降低蛋蛋白质的的带电量量(压缩缩双电层层降低ZZetaa电势)，使电电泳速度度减慢，所所以常用用离子强强度为00022022之间。溶溶液中离离子强度度的计算算方法如如下： Ci=离子的的摩尔浓浓度 Zi=离子的的价数例1，两两个单价价离子化化合物(如NaaCl)的离子子强度等等于它的的摩尔浓浓度，如如01154mmolL NNaCII溶液的的离子强强度例2，两两个两介介离子化化合物(如ZnnSO44)的离离子强度度等于它它的摩

44、尔尔浓度的的4倍，如如011mollL ZnSSO4溶溶液的离离子强度度由上述例例子中可可以看出出多价离离子会使使离子强强度增高高，所以以电泳缓缓冲液常常用单价价离子的的化合物物配制。(三)电电场强度度实验所用用电场强强度对移移动距离离起正比比作用。电电场强度度以每一一厘米的的电势差差计算，也也称电势势梯度。以以滤纸电电泳为例例，滤纸纸长155厘米，西西端电势势差为1150伏伏特，则则电场强强度为110伏特特厘米米。电场场强度愈愈高，则则带电粒粒子的移移动愈快快。伹电电压愈高高，电流流也随之之增高，产产生的热热量也增增加。所所以在高高压电泳泳(电场场强度大大于500伏特厘米)常需加加用冷却却装

45、置，否否则热量量可引起起蛋白质质等物质质的变性性而不能能分离，还还因发热热引起缓缓冲液中中水分蒸蒸发过多多，使支支持物(滤纸、薄薄膜或凝凝胶等)上离于于强度增增加，以以及引起起虹吸现现象(电电泳缸内内液体被被吸到支支持物上上)等，都都会影响响物质的的分离。(四)电电渗在电场中中，液体体对于固固体的固固定相的的相对移移动，称称为电渗渗（图22-6）。如如滤纸中中含有羟羟基而带带负电荷荷，与纸纸相接触触的水溶溶液带正正电荷，液液体便向向负极移移动。由由于电渗渗现象往往往与电电泳同时时存在，所所以带电电粒子的的移动距距离也受受电渗影影响，如如电泳方方向与电电渗相反反，则实实际电泳泳的距离离等于电电泳

46、距离离减去电电渗的距距离。如如方向相相同，则则实际电电泳距离离等于电电泳距离离加上电电渗的距距离。琼琼脂中含含有琼脂脂果胶(agaaroppetiin)，其其中含有有较多的的硫酸根根，所以以在琼脂脂电泳时时电渗现现象很明明显，许许多球蛋蛋白均向向负极移移动。除除去了琼琼脂果胶胶后的琼琼脂糖用用作凝胶胶电泳时时，电渗渗大为减减弱。电电渗所造造成的移移动距离离可用不不带电的的有色染染料或有有色葡聚聚糖点在在支持物物的中心心，以观观察电渗渗的方向向和距离离。三、区带带电泳的的分类区带电泳泳的形式式繁多，分分类比较较困难，仅仅按某一一特点分分类似乎乎都不全全面。这这里基于于支持物物的物理理性状、装装置

47、形式式、pHH值的连连续性等等不同，可可分为：(一)按按支持物物的物理理性状不不同，区区带电泳泳可分为为1滤纸纸及其他他纤维(如醋酸酸纤维纱纱、玻璃璃纤维、聚聚氯乙烯烯纤维)薄膜电电泳。2粉末末电泳，如如纤维素素粉、淀淀粉、玻玻璃粉电电泳。3凝胶胶电泳，如如琼脂、琼琼脂糖、硅硅胶、淀淀粉胶、聚聚丙烯酰酰胺凝胶胶电泳。4丝线线电泳，如如尼龙丝丝、人造造丝电泳泳。(二)按按支持物物的装置置形式不不同，区区带电泳泳可分为为1平板板式电泳泳，支持持物水平平放置，是是最常用用的电泳泳方式。2垂直直板式电电泳，板板状支持持物，在在电泳时时，按垂垂直方向向进行，聚聚丙烯酰酰胺凝胶胶常做成成垂直板板式电泳泳。

48、3连续续液动电电泳，首首先应用用于纸电电泳，将将滤纸垂垂直竖立立，两边边各放一一电极，溶溶液自顶顶端向下下流，与与电泳方方向垂直直，以后后有用淀淀粉、纤纤维素粉粉、玻璃璃粉等代代替滤纸纸分离血血清蛋白白质，分分离量较较大。4圆盘盘电泳(dissc eelecctroophooressis)。电泳泳支持物物灌制在在两通的的玻璃管管中，被被分离的的物质在在其中泳泳动后，区区带呈圆圆盘状。如果用石石英玻璃璃制成内内径为225或550umm、长5501000cm的的管状，则则成为目目前认为为比较先先进的毛毛细管电电泳技术术，若管管中注入入聚丙烯烯酰胺凝凝胶(特特殊技术术)，也也是区带带电泳的的一种。它

49、它集电泳泳与分析析检测系系统于一一身。因因管细、散散热快，电电压可达达2-33万伏，故故具有量量微、快快速、重重复性好好、分辨辨率高及及可自动动化等优优点，但但价格很很高。(三)按按pH的的连续性性不同，区区带电泳泳可分为为1连续续pH电电泳，即即整个电电泳过程程中pHH保持不不变，常常用的纸纸电泳，醋醋酸纤维维薄膜电电泳等属属于此类类。2. 非非连续ppH电泳泳，缓冲冲液和电电泳支持持物间有有不同的的pH，如如聚丙烯烯酰胺凝凝胶盘状状电泳分分离血清清蛋白质质时常用用这种形形式，它它的优点点易在不不同pHH区之间间形成高高的电位位梯度区区，使蛋蛋白质移移动加速速压缩为为一极狭狭的区带带而达到到

50、浓缩的的作用。但但聚丙烯烯酰胺凝凝胶电泳泳分离核核酸则采采取连续续pH装装置。 近年来发发明的等等电聚焦焦电泳(Eleectrrofoocussingg)可称称为非连连续pHH电泳，它它利用人人工合成成的两性性电解质质(商品品名ammphoolinn，一类类脂肪族族多胺基基多羧基基化合物物)在通通电后形形成一定定的pHH梯度。被被分离的的蛋白质质停留在在各自的的等电点点而形成成分离的的区带，电电极两端端，一端端是酸，另另一端是是碱。等速电泳泳Isootacchopphorresiis)也也是属于于非连续续pH电电泳，它它的原理理是将分分离物质质夹在先先行离子子和随后后离子之之间，通通电后被被分

51、主物物质的电电泳速度度相同，所所以叫等等速电泳泳。近年年发明的的塑料细细管等速速电泳仪仪，可以以进行毫毫微克量量物质的的分离，该该仪器采采用数千千伏的高高电压，几几分钟内内即完成成分离，用用自动记记录仪进进行检测测，它的的出现是是电泳技技术的革革新。四、电泳泳技术的的应用电泳技术术主要用用于分离离各种有有机物(如氨基基酸、多多肽、蛋蛋白质、酶酶、脂类类、核苷苷、核苷苷酸、核核酸等)和无机机盐。也也可用于于分析某某种物质质纯度，还还可用于于分子量量的测定定。电泳泳技术与与其他分分离技术术(如层层析法)结合，可可用于蛋蛋白质结结构的分分析，“指纹法法”就是电电泳法与与层析法法的结合合产物。用用免疫

52、原原理测试试电泳结结果。提提高了对对蛋白质质的鉴别别能力。电电泳与酶酶学技术术结合发发现了同同功酶，对对于酶的的催化和和调节功功能有了了更深入入的了解解，所以以电泳技技术是医医学科学学中的重重要研究究技术。下面介绍绍几个在在生化实实验工作作中常用用的电泳泳技术。(一)纸纸电泳：是以滤滤纸为支支持物来来进行电电泳，它它常与其其它层析析方法配配合使用用，以提提高分析析效果，纸纸电泳一一般用于于物质分分离分析析、测定定等电点点、鉴别别颗粒电电荷的符符号和判判断样品品的纯度度等方面面。由于纸电电泳具有有设备简简单，化化费少以以及操作作方便等等优点，所所以目前前仍为实实验室常常用电泳泳技术之之一。然然而

53、，纸纸电泳所所用滤纸纸有较大大的吸附附力和电电渗作用用，使样样品颗粒粒泳动易易受影响响，所以以不适用用于进行行测定迁迁移率。(二)醋醋酸纤维维素膜电电泳。醋醋酸纤维维素是KKohnn(19975)首先用用于区带带电泳，它它是由高高纯度的的醋酸纤纤维素制制成的一一种细密密而又薄薄的微孔孔膜。醋醋酸纤维维素膜电电泳的原原理基本本上和纸纸电泳原原理相同同，但由由于作为为支持物物的醋酸酸纤维素素膜对样样品的吸吸附性较较滤纸小小得多，因因此，少少量的样样品，甚甚至大分分子物质质都能得得以较高高的分辨辨率。又又由于醋醋酸纤维维素亲水水性较小小，故而而电渗作作用较纸纸小，并并且它所所容纳的的缓冲液液也较少少

54、，因此此电泳的的大部分分由样品品传导，可可以加速速样品分分离，大大大节约约电泳时时间。 虽然醋醋酸纤维维素膜电电泳的分分辨能力力比聚丙丙烯酰胺胺凝胶电电泳和淀淀粉胶电电泳等要要低，但但它具有有简单、快快速、定定量容易易等优点点，尤其其较纸电电泳分辨辨力强、区区带清晰晰、灵敏敏度高和和便于保保存、照照相等，所所以醋酸酸纤维素素膜电泳泳已取代代纸电泳泳而被广广泛应用用于科学学实验、生生化产品品分析和和临床化化验，如如血清蛋蛋白、血血红蛋白白、脂蛋蛋白、同工工酶等的的分离分分析，也也用于免免疫电泳泳层析技技术上。 (三)琼脂糖糖电泳 琼脂脂糖电泳泳是一种种以琼脂脂糖凝胶胶为支持持物的凝凝胶电泳泳，其

55、分分析原理理与其它它支持物物电泳的的最主要要区别是是：它兼兼有“分子筛筛”和“电泳”的双重重作用。琼琼脂糖凝凝胶具有有网络结结构，直直接参与与带电颗颗粒的分分离过程程，在电电泳中，物物质分子子通过空空隙时会会受到阻阻力，大大分子物物质在泳泳动时受受到的阻阻力比小小分子大大，因此此在凝胶胶电泳中中，带电电颗粒的的分离不不仅依赖赖于净电电荷的性性质和数数量，而而且还取取决于分分子大小小，这就就大大地地提高了了分辨能能力。 琼脂糖糖凝胶通通常制成成板状，凝凝胶浓度度以081为为宜，因因为此浓浓度制成成的凝胶胶富有弹弹性，坚坚固而不不脆，但但是在制制备过程程中应避避免长时时间加热热。 电泳缓缓冲液的的

56、pH多多在6-9之间间，离子子强度最最适为00022-005。离离子强度度过高时时，将有有大量电电流通过过凝胶，使使凝胶中中水份大大量蒸发发，甚至至造成凝凝胶干裂裂，电泳泳中应加加以避免免。 由于琼琼脂糖电电泳具有有较高分分辨率、重重复性好好，区带带易染色色、洗脱脱和定量量以及干干膜可以以长期保保存等优优点，所所以常用用于大分分于物质质如蛋白白费等的的分离分分析；与与免疫化化学反应应相结合合发展成成为免疫疫电泳技技术，用用于分离离和检测测抗原。若若对目前前常用的的琼脂糖糖进行某某些修饰饰，如引引入化学学基团羟羟乙基，则则可使琼琼脂糖在在65112左右右便能熔熔化，被被称为低低熔点琼琼脂糖。该该

57、温度低低于DNNA的熔熔点，而而且凝胶胶强度又又无明显显改变。以以此为支支持物进进行电泳泳，称为为低熔点点琼脂糖糖凝胶电电泳，主主要用于于DNAA研究。如如在分子子生物学学实验中中，用来来回收或或制备DDNA。(四)聚聚丙烯酰酰胺凝胶胶电泳(pollyaccryllamiideggelddecttropphorresiis，PPAGEE) 聚丙烯烯酰胺凝凝胶是一一种人工工合成的的凝胶，具具有机械械强度好好、弹性性大、透透明、化化学稳定定性高、无无电渗作作用、设设备简单单、样品品量小(11000微克)、分辨辨率高等等优点，并并可通过过控制单单体浓度度或单体体与交联联剂的比比例聚合合成不同同大小孔

58、孔径的凝凝胶，可可用于蛋蛋白质，核核酸等分分子大小小不同的的物质的的分离、定定性和定定量分析析。还可可结合解解离剂十十二烷基基硫酸钠钠(SDDS)，以以测定蛋蛋白质亚亚基分子子量。 聚丙烯烯酰胺凝凝胶电泳泳的原理理1丙烯烯酰胺的的聚合 聚丙丙烯酰胺胺凝胶是是由丙烯烯酰胺(Actt)与交交联剂甲甲撑双烯烯酰胺(Biss)在催催化剂作作用下，经经过聚合合交联形形成含有有亲水性性酰胺基基侧链的的脂肪族族长链，相相邻的西西个链通通过甲撑撑桥交链链起来的的三维网网状结构构的凝胶胶。2聚丙丙烯酰胺胺凝胶孔孔径的大大小 决定凝凝胶孔径径的大小小主要是是凝胶的的浓度，例例如75的的凝胶孔孔径平均均为500A，

59、330的的为200A左右右。但交交联剂对对电泳泳泳动率亦亦有影响响，交联联剂重量量对总单单体重量量的百分分比愈大大，则电电泳泳动动率愈小小。不管管交联剂剂是以何何种方式式影响电电泳时的的泳动率率，总之之它是影影响凝胶胶孔径很很重要的的一个参参数，为为了使试试验的重重复性较较高，在在制备凝凝胶时对对交联剂剂的浓度度、交联联剂与丙丙烯酰胺胺的比例例、催化化剂的浓浓度、聚聚胶所需需时间这这些影响响泳动率率的因子子都应尽尽可能保保持恒定定。要想将一一个蛋白白质或核核酸之类类的大分分子混合合物很好好地分开开，并在在胶柱上上形成明明显的带带，选择择一定孔孔径的凝凝胶是很很关键的的。实用用中，常常按样品品的

60、分子子量大小小来选择择适宜的的凝胶孔孔径。 3缓缓冲系统统 目目前常用用的分离离胶缓冲冲系统有有三大类类：高ppH(ppH9左左右)、低低pH(pH44左右)和中性性。选择择的pHH应使蛋蛋白质分分子处于于最大电电荷状态态，使样样品中各各种蛋白白质分子子表现出出泳动率率的差别别最大。酸酸性蛋白白质在高高pH条条件下，碱碱性蛋白白质在低低pH条条件下常常得到较较好的解解离，电电泳分离离效果较较好。假假若蛋白白质样品品经电泳泳后还希希望保留留生物活活性，则则pH值值不应过过大或过过小大大于9或或小于44)。 在考虑虑离子种种类和离离子强度度时，原原则上只只要有导导电离子子存在的的任何溶溶剂就能能用

61、于电电泳，但但要避免免因离子子种类和和离子强强度选择择不当使使样品中中各蛋白白质分于于之间相相互作用用而造成成人为假假象。常常选用00011011mollL低低离子强强度的缓缓冲液。离离子强度度低，从从而电导导低，低低电导能能产生高高电压梯梯度，电电泳分离离过程短短，产生生热量较较小，分分离效果果好。 4聚聚丙烯酰酰胺凝胶胶盘状电电泳 这里主主要简单单介绍不不连续盘盘状电泳泳的基本本原理。不连续盘盘状电泳泳有较高高的分辨辨力，这这里因力力有三种种效应：浓缩效效应，在在样品胶胶和浓缩缩胶中进进行(如如不用样样品胶，则则在浓缩缩胶中进进行)；电荷效效应和分分子筛效效应在分分离胶中中进行。(1)浓浓

62、缩效应应：管中中置三种种不同的的凝胶层层，即上上层为样样品胶，第第二层为为浓缩胶胶，这两两层均为为大孔胶胶、TrrisHCll缓冲液液、pHH值67，第第三层为为分离胶胶，该层层为小孔孔胶、TTrissHCll缓冲液液、pHH值89。在在上下两两电泳槽槽中充以以Triis甘氨酸酸缓冲液液，pHH值83。这这样造成成凝胶孔孔径、ppH值、缓缓冲液的的不连续续性。在在此条件件下，HHCl几几乎全部部电离为为C1-，甘氨氨酸有极极少部分分的分子子解离成成NH22CH22COOO-，一一般酸性性蛋白质质也能解解离带负负电荷。当当电泳系系统通电电后这这三种离离子都向向正极移移动，根根据有效效泳动率率的大小小，最快快的称为