12基因工程的基本操作程序1

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1、专题专题1 1 基因工程基因工程目的基因的获得方法n从基因文库获得从基因文库获得n基因文库基因文库n人工合成人工合成n利用利用PCRPCR技术扩增技术扩增提取、合成提取、合成增加数量增加数量基因文库基因文库: : 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片段片段, ,导入导入受体菌的群体中储存受体菌的群体中储存, ,各个受体菌分别含有这种生物的各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因不同的基因, ,称为基因文库称为基因文库(gene library)(gene library)基因组文库基因组文库: : 基因文库中包含了一种生物所有的基因基因文库中包含了一种生物所有的

2、基因, ,这种基这种基因文库叫做基因组文库因文库叫做基因组文库. .部分基因文库部分基因文库: : 基因文库中包含了一种生物的一部分基因基因文库中包含了一种生物的一部分基因, ,这种基这种基因文库叫做部分基因文库因文库叫做部分基因文库. .n用DNA探针从基因文库中准确提取 目的基因 把DNA分子双链解开，根据所需的基因核苷酸序列制成一段与之互补的核苷酸短链，并用同位素标记，即成探针。用这一探针查基因文库中已经解旋的DNA片段，如果有一片段与探针片段发生互，这一片段就含有所需的的基因。 用用DNADNA重组技术将某种生物的总重组技术将某种生物的总DNADNA用特定的限制性内用特定的限制性内切酶

3、切割成一个个片段，然后将这些片段随机地连接在某些切酶切割成一个个片段，然后将这些片段随机地连接在某些质粒或其他载体上，再将它们转移到适当的宿主细胞中，通质粒或其他载体上，再将它们转移到适当的宿主细胞中，通过细胞的增殖而构成各个片段的无性繁殖系（克隆），当这过细胞的增殖而构成各个片段的无性繁殖系（克隆），当这些克隆多到可以包括某种生物的全部基因时，这一批克隆的些克隆多到可以包括某种生物的全部基因时，这一批克隆的总体就称为该种生物的基因文库。这一定义也适用于线粒体总体就称为该种生物的基因文库。这一定义也适用于线粒体DNADNA和叶绿体和叶绿体DNADNA，分别称为某种生物的线粒体基因文库或叶，分别

4、称为某种生物的线粒体基因文库或叶绿体基因文库。为了有效地保存基因文库，可通过细菌在固绿体基因文库。为了有效地保存基因文库，可通过细菌在固体培养基上繁殖而使包含各个特定体培养基上繁殖而使包含各个特定DNADNA片段的细菌增多。通过片段的细菌增多。通过分子杂交的方法，可以筛选出包含有所需基因的分子杂交的方法，可以筛选出包含有所需基因的DNADNA片段的细片段的细菌（或噬菌体）。经过扩增得到大量这样的细菌（或噬菌菌（或噬菌体）。经过扩增得到大量这样的细菌（或噬菌体），从中便可分离出所需基因的体），从中便可分离出所需基因的DNADNA片段。建立和使用基因片段。建立和使用基因文库是分离高等真核生物基因的

5、有效手段，对于基因定位和文库是分离高等真核生物基因的有效手段，对于基因定位和基因工程的研究都很有用。基因工程的研究都很有用。人工合成人工合成n反转录法：反转录法：已知其已知其mRNA 的序列的序列 单链单链DNA 双链双链DNAn化学合成法：化学合成法：已知其翻译产物的氨基酸序列已知其翻译产物的氨基酸序列推测推测 推测推测 mRNA的核苷酸序列的核苷酸序列 结构基因的核结构基因的核苷酸序列苷酸序列 目的基因目的基因PCR聚合酶链式反应 扩增过程：加热DNA变性解旋 引物与单链互补结合 在DNA聚合酶作用下进行延伸 （指数形式扩增。）n基因表达载体的构建 目的基因目的基因 启动子启动子 位置：基

6、因的首端 功能：RNA聚合酶识别和结合的组成组成 部位，驱动基因转录mRNA 终止子终止子 位置：基因的尾端 功能：终止转录 标记基因标记基因 ： 鉴别受体细胞是否有目的基因直接导入法有电击、显微注射、直接吸收、基因枪等直接导入法有电击、显微注射、直接吸收、基因枪等方法。方法。（1 1）电击法：借助电击仪高压脉冲把目的基因打入宿主细胞。）电击法：借助电击仪高压脉冲把目的基因打入宿主细胞。（2 2）显微注射法：利用微量注射器在显微镜下直接把目的基因注）显微注射法：利用微量注射器在显微镜下直接把目的基因注入宿主细胞。入宿主细胞。（3 3）直接吸收法：把目的基因和宿主细胞混在一起，让其吸收。）直接吸

7、收法：把目的基因和宿主细胞混在一起，让其吸收。（4 4）基因枪法：在金属微粒上涂一层目的基因，然后发射到宿主）基因枪法：在金属微粒上涂一层目的基因，然后发射到宿主细胞中。细胞中。间接导入法常用的载体是质粒、间接导入法常用的载体是质粒、 噬菌体、科斯质粒。噬菌体、科斯质粒。（1 1）质粒是细菌染色体）质粒是细菌染色体DNADNA以外的环状双链以外的环状双链DNADNA分子，它能自分子，它能自我复制，也可整合到细胞染色体我复制，也可整合到细胞染色体DNADNA中与其一起表达。质粒通常中与其一起表达。质粒通常还含有标记基因，这可以从细胞的表型特征来识别。还含有标记基因，这可以从细胞的表型特征来识别。

8、（2 2） 噬菌体是一种细菌病毒，其环状双链噬菌体是一种细菌病毒，其环状双链DNADNA可以作为目的基可以作为目的基因的载体。因的载体。（3 3）科斯质粒是一种杂种质粒，含有质粒和）科斯质粒是一种杂种质粒，含有质粒和 噬菌体的部分顺序，噬菌体的部分顺序，很适合用作真核生物基因的载体。很适合用作真核生物基因的载体。1.1.将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞其他方法：基因枪法，花粉管通道法其他方法：基因枪法，花粉管通道法2.2.将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞显微注射法显微注射法3.3.将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞 大肠杆菌细胞最常用的转化方法是大肠杆菌细

9、胞最常用的转化方法是: : 首先用首先用CaCa2+ 2+ 处理细胞处理细胞, ,使细胞处于一种能吸收周围环境中使细胞处于一种能吸收周围环境中DNADNA分子的生理状态分子的生理状态, ,这种细胞称为感受态细胞这种细胞称为感受态细胞. . 第二步是将重组表达载体第二步是将重组表达载体DNADNA分子溶于缓分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合冲液中与感受态细胞混合, ,在一定的温度下促进感在一定的温度下促进感受态细胞吸收受态细胞吸收DNADNA分子分子, ,完成转化过程完成转化过程. . 第三步第三步四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定1、检测与鉴定的目的、检测与鉴定的目的目的基因进入受

10、体细胞后，是否可以稳定维持目的基因进入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性和表达其遗传特性检测目的基因是否插入了转基因生物的染色体检测目的基因是否插入了转基因生物的染色体DNA上上2、检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质另外：个体生物学水平的鉴定另外：个体生物学水平的鉴定思考思考：检测：检测mRNA 是否合成，可以用分子杂交的方法吗？是否合成，可以用分子杂交的方法吗？#检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗原抗原抗体杂交抗体杂交#个体生物学水平的鉴定个体生物学水平的鉴定前三步的处理十分繁锁，

11、为保证目的基因得到有前三步的处理十分繁锁，为保证目的基因得到有效利用，通常用大量的受体细胞来接受不多的目的基效利用，通常用大量的受体细胞来接受不多的目的基因。这样，处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的因。这样，处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。很少，必须将它从中检测出来。无表达产物无表达产物无表达产物无表达产物有表达产物有表达产物无表达产物无表达产物细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培

12、养、研究。物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应变化的个体进一步培养、研究。变化的个体进一步培养、研究。例：用棉铃饲喂棉例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基目的基因或摄入目的基因未表达。

13、如虫吃后中因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。抗虫基因并得到表达。寻根问底（1）为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？提取不行吗？提示：提示：构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的方式从含有该基因的生物的DNA中，中，直接获得，也可以通过反转录，用直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从方式从m

14、RNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。就需要构建基因文库。寻

15、根问底：寻根问底：将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？果这么做，结果会怎样？提示：提示：有人采用总有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因了受体植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基

16、因工程。工程。1.1.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大于真核细胞中，大肠杆菌不存在这

17、两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。2.-2.-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白，珠蛋白，想一想，应如何进行设计？想一想，应如何进行设计？寻根问底：寻根问底：（1）从小鼠中克隆出）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。）。（2）将）将cDNA前接上在大

18、肠杆菌中可以适用的启动子，另外加前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白基因已进入其中。珠蛋白基因已进入其中。（4）培养进入了）培养进入了

19、-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取从中提取-珠蛋白。珠蛋白。思考：思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？成任务吗？为什么？不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身生物之间进行基因交流，只有使用

20、受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2） 通过通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；编码序列导入受体生物中无法转录；（3） 目的基因是否导入受体生物中需要有目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；筛选标记；（4） 为了增强目的基因的表达水平，往往为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；还要增加一些其他调控元件，如增强子等；（5） 有时需要确定目的基因表达的产物存有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识在于细

21、胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。3.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导若将一个抗病基因导入小麦中入小麦中,理论上讲你应该怎样做理论上讲你应该怎样做?要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；菌菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的

22、物质，一般为乙酰丁香酮等，要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体转移并插入到染色体DNA上。上。1为了培育节水高产品种，科学家将大麦中与抗旱为了培育节水高产品种，科学家将大麦中与抗旱节水有关的基因导入小麦，得到转基因小麦，其节水有关的基因导入小麦，得到转基因小麦，其水分利用率提高了水分利用率提高了20%。这项技术的遗传学原理。这项技术的遗传学原理是是 A基因重组基因重组 B基因突变基因突变 C基

23、因复制基因复制 D基因分离基因分离巩固练习巩固练习A3水母发光蛋白由水母发光蛋白由236个氨基酸构成，其中天冬氨个氨基酸构成，其中天冬氨酸、甘氨酸和丝氨酸构成发光环，现已将这种蛋酸、甘氨酸和丝氨酸构成发光环，现已将这种蛋白质的基因作为生物转基因的标记，在转基因技白质的基因作为生物转基因的标记，在转基因技术中，这种蛋白质的作用是术中，这种蛋白质的作用是( )A促使目的基因导入受体细胞促使目的基因导入受体细胞 B促使目的基因在受体细胞内复制促使目的基因在受体细胞内复制C使目的基因容易被检测出来使目的基因容易被检测出来 D使目的基因容易成功表达使目的基因容易成功表达巩固练习巩固练习C4 4根据根据m

24、RNAmRNA的信息推出获取目的基因的方法是的信息推出获取目的基因的方法是（ ）A A、用、用DNADNA探针测出目的基因探针测出目的基因B B、用、用mRNAmRNA探针测出目的基因探针测出目的基因C C、用、用mRNAmRNA反转录形成目的基因反转录形成目的基因D D、用、用PCRPCR技术扩增技术扩增mRNAmRNA巩固练习巩固练习C5 PCR5 PCR技术扩增技术扩增DNA,DNA,需要的条件是需要的条件是( )( )目的基因目的基因引物引物四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸DNADNA聚合酶聚合酶等等mRNAmRNA核糖体核糖体A A、B B、C C、D D、 巩固练习巩固练习A6 6 获

25、取目的基因的方法有多种，下列不属于目的获取目的基因的方法有多种，下列不属于目的基因获取方法的是（基因获取方法的是（ ）A A、从基因组文库中获取、从基因组文库中获取B B、从、从cDNAcDNA文库中获取文库中获取 C C、从含目的基因生物细胞中获取、从含目的基因生物细胞中获取D D、利用、利用PCRPCR技术获取技术获取巩固练习巩固练习C 科学家将控制某药物蛋白合成的基因转移到白色来科学家将控制某药物蛋白合成的基因转移到白色来亨鸡胚胎细胞的亨鸡胚胎细胞的DNADNA中中, ,发育后的雌鸡就能产出含该发育后的雌鸡就能产出含该药物蛋白的鸡蛋药物蛋白的鸡蛋, ,在每一只鸡蛋的蛋清中都含有大量在每一只鸡蛋的蛋清中都含有大量的药物蛋白的药物蛋白; ;而且这些验收孵出的鸡而且这些验收孵出的鸡, ,仍能产出含该仍能产出含该药物蛋白的鸡蛋药物蛋白的鸡蛋. .据此分析据此分析( )( )A.A.这些鸡是转基因工程的产物这些鸡是转基因工程的产物 B.B.这种变异属于可遗传的变异这种变异属于可遗传的变异C.C.该过程运用了胚胎移植技术该过程运用了胚胎移植技术 D. D. 该种变异属于定向变异该种变异属于定向变异巩固练习巩固练习D