第一章2各种光学显微镜技术

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1、第二节各种光学显微镜技术2.1 明视野显微镜(bright field microscope )2 2暗视野显微镜( (dark field microscope)2.3相差显微镜(Phase contrast)2.4微分干涉显微镜( (Differential interference contrast DIC)2. 5荧光显微镜2. 6偏光显微镜2. 7倒置显微镜2. 8体视显微镜(Fluorescence) (Polarizing microscope ) (Inverted microscope) (Stereo microscope)2.1明视野显微镜明视野显微镜是以标本的颜色及其透

2、射率 为基础的显微镜。标本应经过染色处理，才能达到应有的效 果。在各种显微镜的观察方法中，明视野显微 镜观察是最常规的一种，在生物学研究中 被广泛应用。明视野显微镜观察效果Unstained and Stained Specimens in Brightfield Illumination薮枝媳Specimens for Brightfield Microscopytooth enamel formationfleapine staminate conecephalopodSpecimens for Brightfield MicroscopyHuman Tissues in Brightfi

3、eld Illuminationhuman fathuman corpus luteum 2.2暗视野显微镜暗视野实际是暗场照明法。不直接观察到 照明的光线，而观察到的是被检物体反射 或衍射的光线。因此，视场成为黑暗的背 景，而被检物体则呈现明亮的象。2.2.1暗视野显微镜特点可以观察在普通明视场中看不见的标本。可以观察细菌等微小标本。观察效果如同星空。适用范围：生物样品：微小水生生物、硅藻、小昆虫、 骨骼、纤维、毛发、细菌、酵母、原生生物等非生物样品：矿石、化学晶体、胶体颗粒 2.2.2暗视野显微镜原理根据光学上的丁道尔现象，微尘在强光直射通过 的情况下，人眼不能观察，这是因为强光绕射造 成

4、的。若把光线斜射它，由于光的反射，微粒似 乎增大了体积，为人眼可见暗视野的特殊附件：暗视野聚光镜它的特点是不让光束由下至上的通过被检物体， 而是将光线改变途径，使其斜射向被检物体，使 照明光线不直接进入物镜，利用被检物体表面反 射或衍射光形成的明亮图象。LightDa rk-field stop暗视野观察的分辨率远高于明视野观察，最高达0020.004mmoDarkfield Illumination with Low Contrast Specimenshuman whipworm (Trichuris trichiura).Darkfield Illumination with Low C

5、ontrast Specimensthe crab megalops developmental stageOpaque Specimens in Darkfield IlluminationLycra spandex fibersOpaque Specimens in Darkfield IlluminationButterfly wingStained Specimens in Darkfield Illumination同何 Figure 5starfishbryozoa nCapsella embryoStained Specimens in Darkfield Illuminatio

6、n/ 2.3相差显微镜由PZernike于1932年发明,并因此获1953 年诺贝尔物理奖。这种显微镜最大的特点是可 以观察未经染色的标本和活细胞。(e) ParamecrumMicronucleusMacro Duel” 2.3.1相差显微镜的原理人眼只能区分光波的波长（颜色）和振幅（亮 度），对于无色通明的生物标本，当光线通过时, 遞长和振幅变化不大，在明场观察时很难观察到 标本。相差显微镜利用相差物镜和聚光镜，把透过标本 的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种 结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。Dark ima-ge with bright background results

7、Image plarteAmplitude conrtrast is produced by light rays that aie in reverse pha&.Dtrect lightraysadvanced 1/4 wavelengih as they 闻驭 tn rough the phase ring.Phase ringV4 wavolength afterpassing thfCHigh objcB.Most dfffraclcd rays of llghl pass Ihrouglli phae plate unchanged bseause thay miss the 卩h

8、asenng.DWfracked rap are retardeoCondanwr 2.3.2相差显微镜的特殊部件环形光阑亠(annular diaphragm) 位 于光源与聚光器之间，作 用是使透过聚光器的光线 形成空心光锥，焦聚到标 *上。相位板 (annular phaseplate)在物镜中加了 涂有氟化镁的相位板，可 W i M光或衍直寸光占勺相位 推迟1/4入。Phase Contrast Light PathwaysDonected LightObj&ctivoSpecimenPhase -RingCondenserLightFrom SourceAnnular -RingFi

9、gure 1PhaseplateRay deviated by specimen is 1/4 wavelength out of phase.Deviated ray is 1/2 wavelength out of phase.Deviated and undeviated rays cancel each other out.Condenser Top Lens Lens Swing ArmPhase Contrast Optical ComponentsFigure 1Condenser Annulusunkeirsal Swina-Lens ConaenserUniversal7-P

10、ositiion TurretPhaseTelescopePhase Contrast ObjectivesPhase Contrast ObjectivePhase RingF rent LensFigure 1RearFocal PlaneObjective Barrelphase contrast brightfield管轮虫Mytilinabrightfield phase contrastCiliatebrightfield phase contrast 2.4微分干涉相差显微镜 1952年，Nomarski在相差显微镜原理的基础上发 明了微分干涉相差显微镜。DIC显微镜又称 Nom

11、arsk相差显微镜，其优点是能显示结构的三 维立体投影影像。与相差显微镜相比，其标本可略 厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。Analyzer 特点与相差显微镜类似，可以观察到在普通显微镜 下看不见的无色透明标本。可以对活细胞进行观察。观察的影象呈立体浮雕状，观察效果较相差显 微镜更具艺术感。原理是利用偏光干涉原理的一种 显微镜。从偏振器出来的偏振光通过渥拉斯顿棱镜后， 分成两束偏振光。两束光分 别在距离很近的两点上通过 被检物体，两束光在相位上 略有差别。两路光通过物镜 后，经第二组渥拉斯顿棱镜 汇合。在经过检偏镜后使它 们震动方向一致而发生干涉。 ObjectiveSpecimen

12、CondenserPolarizerFirst Wollaston prismSecond Wollaston prismField diaphragmAnalyzer从而形成较连续的明暗反差, 构成具浮雕感的图象。特殊部件偏振器(polarizer):直接装在聚光系统的前面, 使光线发生线性偏振。渥拉斯顿棱镜( (Wollaston prism) 2块：第一 块安装在聚光器中，将一束光分解成偏振方向不 同的两束光；第二块安装在物镜的后焦面处，扌巴 两束光波合并成一束，而两束光的偏振面依然不 同。检偏器(analyzer):将两束垂直的光波组合成 具有相同偏振面的两束光，从而使二者发生干涉。N

13、orth-South-Condenser Nomarski Prism Polarizer!Differential Interference Contrast Microscope Config u rationEast-WestFigure 1-Analyzer-PrismShear AxisObjective -Nomarskii PrismOlympusDigital BX61 Motorized Fluorescence and DIC Microscope 使用DIC显微镜使细胞的结构，特别是一些较大的细胞器,如核、线粒体等，立体感特别强，适合于显微操作。目前像基因注入、核移植、转

14、基因等的显微操作常在这种显微镜下进行。灵敏度高，制片表面不能有污物和灰尘。ctenoid fish scale ncylostomacaninums.Optical Staining in Differential! Interference Contrast MicroscopyFigure 10Moth wing scale（a）（可（e）口 Figure Human erythrocytesHeLa cells海拉细胞Zygnema 双星藻壬2.5荧光显微镜(Fluorescence)细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光

15、抗体染色后，经紫外线照射亦可 发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定 量研究的工具之一。 优点: 检出能力咼对细胞的刺激小能进行多重染色用途：物体构造的观察A荧光的有无、色调比较进行物质判别发荧光量的测定对物质定性、定量分析荧光的特性“为了能发射出荧光，一种物质必须能吸收进一种 光线。“通常荧光波长是长于吸收光的波长。/每一种物质都有他特定的荧光光谱。“通常荧光强度总是远低于激发光。/与激发光的方向无关，荧光向空间各个方向发射。“荧光有衰退的特性。光源荧光标本荧光显微镜的原理二红外紫外A激励滤光镜光源荧光标本阻挡滤光镜观察未吸收兰荧光（黄） 阻挡滤光镜观察光 荧光（黄） 荧光（兰）光源：

16、光源辐射出各种波长的光。a siH 光显微镜的光源强度必须很高，即使在近紫外区, 也必须有足够的强度。为了满足这些要求，通常 米用咼压汞灯，但有时为了特殊需要，也米用卤 素灯。光学暗视场通常荧光的强度和激发光相比，是极微弱的， 如果荧光和激发光相叠加，反差就会极度减弱。 因此，必须把激发光和荧光彻底地分离出来。唔透射荧光显微镜：卤素灯。聚光镜：使用暗场 聚光镜，使激发光 和荧光分离出来。物镜：可用任何种 类的物镜。标本：因为是透射 观察，薄的标本比 较适合。1 Mercury vapor arc Umpd Carrier filerRemoves any remarwog excrtr wav

17、tenigtM g 洛 about SOO nm) withoutIo nger w/9relengrftisol 1lu( (xeacing objects5. Specimen Gained with Ouorochrome Emits fluorWGfmcfl ntiw activaled by Axeili% w4w6tofSth df liQM4.D3rk-tleld conwleaserProvide dark backg round for tluofecenoe障礙過濾器.ObjcGthre I砂9丿Mltw7 LPX Exciter fiItor_F I /Al-owsort

18、ly short wavGlongth 激駆;咼器p f z /light (about 400 nm J throughCb JL-J / C D优点：/由于用了暗场聚光镜，激发光不能进入物镜，因.此容易形成暗的背景，得到良好的反差。/由于上述同样的原因，任何物镜都可用于观察。/用低倍物镜时，比反射荧光显微镜更亮。缺点：/必须正确调整聚光镜中心和高度，否则不能获得 明亮的荧光像。/由于暗视场聚光镜焦距限制，不能使用厚的载玻 片。/视场照明区不能过大，否则容易使荧光标本荧光 色衰褪。/厚的或不透明的标本不适用。反射荧光显微镜:光源：高压汞灯或卤素 灯。聚光镜：因为物镜作 为聚光镜，所以不需要

19、聚光镜。歸镜：所用的物镜必须 能透过足够的紫外光，而且本身不产生荧光,对数值孔径没有限制。 标本：厚的标本或不透 明的标本都能观察。3 second bArfridr fillferltuU Out unwamiod llworosxont signals., passino th specific green flucwscoin omission tolwcon 520 ond 5&0 nm2 boam spliltino mirror: reflects liflhv below 510 nm but transmits light above 510 nmobjoctive Ions_

20、 一 obj-oct i 1优点:/由于物镜兼作聚光镜，不需要很多调节。/物镜数值孔径不受限制，在高放大被率时，也可 以获得高分辨率的像。/厚的或不透明的标本也能观察，厚的盖玻片也能 便用。/其它观察法也能与反射荧光结合使用，特别和相 差法和透射微分干涉差法相结合。/可以避免不必要的荧光色衰褪现象。缺点：/在用低倍率物镜时，像比较暗，因此必须用大数 值孔径的物镜。/滤光镜系统必须有效地分离开激发光和荧光。*使用注意1.激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和 淬灭现象，因此尽可能缩短观察时间，暂时 不观察时，应用挡板遮盖激发光。2.作油镜观察时，应用“无荧光油”。3.荧光几乎都较弱，应在较暗的室

21、内进行。4.电源最好装稳压器，否则电压不稳不仅会降 低汞灯的寿命，也会影响镜检的效果。微管呈绿色.核蓝色微星藻Micras荧光V It 视 田卑微分干涉 2.6偏光显微镜偏光显微镜是鉴定物质细微结构光学性质的一 种显微镜。将普通光改变为偏光进行镜检，凡 具有双折射的物质，在偏光显微镜下就能分辨 的清楚。因此用来鉴别某一物质是单折射（各 向同行）或双折射性（各向异性）。双折射性是晶体的基本特性。因此，偏光显微镜被广泛地应用在矿物，化学等领域。在生物 学和植物学也有应用。Olympus CX3VP Microscope 特殊部件1-偏振器2.检偏器旋转载物台Figure 2Polarizer Or

22、ientation ControlcondenserHousingControl； ArtureP如詁鏑需SnOlympus CX31-P Condenser ConfigurationExternal ViewEyepieceBertrand LensAnalyzerOn/Off SwitchLampIntensit ControlRetardation PlateObservation TubesStrain-Free 左= Objective AH Rotating Stage CondenserPolarizerCo II ecto r5- LensTungsten 匚HalogenL

23、ampIntermediate TubeFrameFocus KnobsFigure 1水晶陨石颗粒 2.7倒置显微镜适应生物学、医学等领域片的组頤培养、细胞 勰羈、。浮游生物、环境保护、食品检验等被检物体均放置在培养皿（或培养瓶）中，这 样就要求倒置晁微镜的物镜和聚光镜的工作距 罔很长，能直接菇館罪血.申右勺發紐物乐进行显 微观察和研究。因此，物镜、聚光镜和光源的 位置都颠倒过来，故称为“倒置显微镜”。多用于无色透明的活体观察。倒置显微镜物镜的最大放大率为60X o躱鶉蘇嬲錢来完成相差、微分干涉、I nverted m icroscope image of a ciliate倒置相差显微镜观

24、察调节光轴图7-2聚光镜光轴中心的调正II 合轴调节ABCD图7-3相差显微镜的合轴调节A.相板;B.环状光阑;C.合轴和照明正常;D.已合轴但光轴对环状光阑照射不均匀；E.亮环大于相 板圆环;F.亮环小于相板圆环;G.亮环与相板圆环不合轴.确保所观察、研究的细胞准确无误。A明反差体视显微镜又称“实体显微 镜”或“解剖镜”，具有正 象立体感，被广泛地应用于 生物学、医学、农林、工业 及海洋生物各部门。 2.8体视显微镜特点1.双目镜筒中的左右两光束不是平行，而是具 有一定的夹角体视角（一般为12g15 度），因此成象具有三维立体感；2.在目镜下方的棱镜把象倒转过来，象是直立 的，便于操作和解剖；3.放大率不如常规显微镜；4.焦深大，便于观察被检物体的全层；视场直径大。 光学结构1.共用一个初级物镜；2.物体成像后的两光束被两组中间物镜变焦 镜分开，并成一体视角再经各自的目镜成像；3.倍率变化是由改变中间镜组的距离而获得。British spider