重组体的筛选

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1、第 八 章 重 组 体 的 筛 选 检 测 将 目 的 DNA片 段 与 载 体 连 接 形成 重 组 子 ， 然 后 通 过 各 种 方 法 将 重组 子 导 入 宿 主 细 胞 ， 得 到 所 需 要 的带 有 重 组 DNA的 转 化 子 ， 这 是 基 因工 程 的 目 的 所 在 。 转 化 子 ： 导 入 外 源 DNA后 获 得 了 新 的 遗 传 标 志的 细 菌 细 胞 或 其 他 受 体 细 胞 。 重 组 子 的 鉴 定 可 以 从 直 接 和 间 接 两 个 方面 分 析 ， 可 以 从 DNA、 RNA和 蛋 白 质 三 个 不同 水 平 进 行 鉴 定 。 重 组

2、子的 筛 选 直 接筛 选间 接筛 选 DNA鉴 定载 体筛 选翻 译 产 物转 录 产 物其 他 方 法 （ 报 告 基 因 等 ）Northern blottingWestern blotting标 记 补 救 筛 选质 粒 载 体 的 互 补 筛 选 （ 蓝 白 色 斑筛 选 法 ）噬 菌 体 包 装 容 量 的 正 性 筛 选质 粒 载 体 的 抗 性 标 记 筛 选同 源 性 分 析 鉴 定 （ 原 位 杂 交 ）DNA序 列 分 析重 组 子 酶 切 图 谱 鉴 定重 组 子 大 小 鉴 定 一 、 遗 传 学 检 测 法1、 根 据 载 体 表 型 特 征 的 筛 选（ 1） 抗

3、 药 性 标 记 插 入 失 活 筛 选 法第 一 节 核 酸 分 子 的 遗 传 学 与 物 理 检 测 法 克隆Kan 抗性基因 （ 2） -半 乳 糖 苷 酶 显 色 反 应 筛 选 法 筛 选 白 色 菌 落 2、 根 据 插 入 基 因 遗 传 性 状 的 筛 选 重 组 体 DNA分 子 转 化 到 大 肠 杆 菌 受 体 细 胞之 后 ， 如 果 插 入 在 载 体 分 子 上 的 外 源 基 因 能 够实 现 其 功 能 性 的 表 达 ， 而 且 表 达 的 产 物 能 与 大肠 杆 菌 菌 株 的 营 养 缺 陷 突 变 形 成 互 补 ， 那 么 就可 以 利 用 营 养

4、 突 变 株 进 行 筛 选 。 合 成 某 一 aa的 基 因载 体 酶 切 连 接 重 组 缺 少 该 aa合 成酶 基 因 的 菌 株转 化 只 缺 少 该 aa的基 本 培 养 基筛 选重 组 子 生 长 、 获 得 二 、 核 酸 分 子 的 物 理 检 测 法原 理 ： 碱 基 配 对杂 交 双 方 ： 待 测 的 核 酸 序 列 插 入 片 段 基 因 制 备 的 DNA或 RNA探 针 核 酸 杂 交 方 法 ： 菌 落 印 迹 原 位 （ in situ） 杂 交 斑 点 （ dot） 印 迹 杂 交 Southern印 迹 杂 交 都 是 通 过 一 定 的 物 理 方 法

5、 将 菌 落 （ 噬 菌 斑 ）或 突 起 的 DNA从 平 板 或 凝 胶 上 转 移 到 固 体 支 持物 上 ， 然 后 同 液 体 中 的 探 针 进 行 杂 交 。 1、 菌 落 印 迹 原 位 杂 交 将 标 记 的 核 酸 探 针 与 细 胞 或 组 织 中 的 核酸 进 行 杂 交 ， 称 为 原 位 杂 交 。 特 点 能 在 成 分 复 杂 的 组 织 中 进 行 单 一 细 胞 的 研 究 不 需 从 组 织 或 细 胞 中 提 取 核 酸 ， 对 含 量 极 低的 靶 序 列 灵 敏 度 高 能 准 确 反 映 组 织 细 胞 的 相 互 关 系 及 功 能 状 态 实

6、 验 步 骤 Smad2 mRNA在 系 膜 增 生 型 IgA肾 病 肾 小 球 的 表 达 原 位 杂 交 200 肺 腺 癌 -cat mRNA 原 位 杂 交 法 400 2、 斑 点 印 迹 杂 交 斑 点 印 迹 杂 交 与 菌 落 原 位 杂 交 的 原 理 相 同 优 点 ： 简 单 、 快 速 、 可 同 时 检 测 多 个 样 品 常 用 于 病 毒 核 酸 的 定 量 检 测 RNA或 DNA 变 性 NC膜固 定 杂 交 放 射 自 显 影 检 测实 验 原 理 与 步 骤提 取碱 溶 液 点 样 加 热放 射 性 探 针一 定 条 件 X-底 片显 影 、 定 影标

7、记 斑 点 3、 Southern 印 迹 杂 交 1975年 ， 英 国 Southern创 建 DNA与 DNA的 杂 交 ， 即 将 DNA电 泳 、转 印 到 固 相 支 持 物 上 ， 用 探 针 进 行 检 测 的方 法 。 带 有 DNA片 段 的 凝 胶DNA分 子 限 制 片 段限 制 性 酶 切 割 琼 脂 糖 电 泳至 膜 （ 尼 龙 膜 或 硝 酸纤 维 素 滤 膜 ） 上转 膜 杂 交 、 显 影凝 胶滤 膜用 缓 冲 液 转 移 DNA吸 附 有 DNA片 段 的 膜实验步骤 白 瓷 盘 玻璃板滤纸凝 胶 尼 龙 膜 滤 纸吸 水 纸 玻 璃 板 重 物吸 水 纸

8、转 膜 用 于 分 析 混 合 DNA样 品 中 是 否 存在 能 与 特 定 探 针 杂 交 的 序 列 。 Southern杂 交 由 于 滤 膜 是 从 凝 胶上 原 位 印 迹 而 来 ， 因 而 能 够 显 示 出 与探 针 杂 交 的 DNA片 段 的 大 小 。用 途 Southern杂 交 定 位 kan抗 性 基 因 4、 直 接 凝 胶 电 泳 检 测 法利 用 有 插 入 片 段 的 重 组 载 体 的 分 子 量 比野 生 型 载 体 分 子 量 大 。从 转 化 后 的 菌 体 克 隆中 分 离 质 粒 ， 电 泳 、比 较 其 分 子 量 。 分 子 量 Marke

9、r 载 体重组克隆 实验步骤 bp1534 994 695 515 377 237 A B C M 原 理根 据 已 知 的 外 源 DNA序 列 的 限 制 性 酶 切图 谱 ， 选 择 一 两 种 内 切 酶 切 割 质 粒 ， 电泳 后 比 较 电 泳 结 果 （ DNA带 数 和 长 度 ）用 合 适 的 内 切 酶 切 下 插 入 片 断 ， 再 用 其它 酶 切 这 个 片 断 ， 电 泳 后 比 较 结 果 。 A BA或 B 第 二 节 免 疫 化 学 与 核 酸 分 析 法利 用 抗 体 作 为 “ 探 针 ” 来 检 测 转 入 受 体菌 并 且 表 达 出 相 应 的 蛋

10、 白 质 的 外 源 基 因 。根 据 第 一 抗 体 （ 一 抗 ） 和 第 二 抗 体 （ 二 抗 ）的 性 质 可 分 为 几 种 作 用 方 式 ：1. 抗 体 与 产 物 的 结 合 方 式对 表 达 产 物 的 检 测 。 蛋 白 蛋 白 “ 杂 交 ” 待 测 基 因 产 物 蛋 白一 抗 二 抗 125I 标 记 的 二 抗 结 合 蛋 白固 相 支持 滤 膜 待 测 基 因 产 物 蛋 白一 抗 125I标 记 的 二 抗固 相 支持 滤 膜 待 测 基 因 产 物 蛋 白 一 抗固 相 支持 滤 膜固 相 支持 滤 膜 待 测 基 因 产 物 蛋 白 一 抗 二 抗 125

11、I 标 记 的 二 抗 结 合 蛋 白125I标 记 的 二 抗 把 非 放 射 性 抗 体 加 到 平 板 培 养 基 中 ，当 插 入 基 因 的 表 达 产 物 被 细 菌 分 泌 到菌 落 周 围 时 ， 就 会 与 抗 体 反 应 形 成“ 沉 淀 圈 ” 。1. 原 理抗 原 抗 体 凝 集 反 应 。检 测 分 泌 型 产 物 。2. 方 法 对 于 不 能 被 分 泌 到 菌 体 外 的 蛋 白 质 可 先 进 行原 位 溶 菌 处 理 （ 溶 菌 酶 、 原 噬 菌 体 诱 发 ） 。 Enzyme-linked immunosorbant assay1. 原 理 ：一 抗

12、（ primary antibody） : 与 目 标 分 子 的 特 异 结 合 。 二 抗 （ secondary antibody） ： 与 一 抗 的 特 异 性 结 合 。 酶 连 （ enzyme-linke） ： 二 抗 上 携 带 一 种 酶 能 催 化 一 种 反 应 将 无色 的 底 物 转 变 为 有 色 的 物 质 （ 或 发 光 ） ， 再通 过 比 色 测 定 有 色 物 质 的 含 量 （ 或 光 强 度 ） ，从 而 推 测 目 标 分 子 的 含 量 。 待 测 基 因 产 物 蛋 白 一 抗 二 抗酶 待 测 基 因 产 物 蛋 白 一 抗 二 抗无 色 的

13、 底 物 有 色 的 产 物比 色 观 察 酶 有 效 ， 但 准 确 性 稍 差 （ 主 要 取 决 于 一 抗的 特 异 性 ） 。 必 须 与 其 他 方 法 一 起 综 合 考 虑 。最 好 用 单 克 隆 抗 体 （ monoclonal antibody） 电 泳 胶 里 的 蛋 白 质 带 可 以 用 电 转 的 方 法 ，转 到 膜 上 （ 硝 酸 纤 维 素 膜 、 PVDF膜 、中 性 尼 龙 膜 等 ） 。 Western（ 转 膜 ）胶 里 的 蛋 白 质 带 在 电场 的 作 用 下 横 向 转 移到 正 极 一 侧 的 膜 上 。 膜胶蛋 白 原 理 与 ELISA

14、相 同 。待 测 蛋 白硝 酸 纤 维 素 膜 一 抗 二 抗辣 根 过 氧 化 物 酶底 物 产 物 ， 并 发 出 光PAGE胶 待 测 蛋 白 底 片 曝 光辣 根 过 氧 化 物 酶 ： HRPO 1） 先 用 一 抗 （ 待 测 蛋 白 的 单 克 隆 抗 体 ） 与 膜 上 的 蛋 白 结 合 。2） 洗 去 未 结 合 的 一 抗 。3） 用 二 抗 与 一 抗 结 合 （ 二 抗 上 带 有 HRPO） 。4） 清 洗 掉 未 结 合 的 二 抗 。5） 用 HRPO的 底 物 浸 泡 膜 。6） 暗 室 里 曝 光 ， 冲 洗 胶 片 。 多 克 隆 抗 体Blotting的结 果单 抗 blotting结 果 足 迹 实 验 （ footprinting assay）