甲基睾酮对斑马鱼成鱼的影响

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1、甲基睾酮对斑马鱼成鱼的影响姓名XX大学XX学院XX级XX专业 学号XXXXXXXX摘 要：通过对斑马鱼的实验，硏究甲基睾酮对其成鱼生长、成活率和性腺发育的影响，设置3个处 理组:空白对照组、阴性对照组、实验组，各组用配制好的三种饵料（普通饲料、95%乙醇、30pg/g甲 基睾酮）分别饲喂，按时投喂换水,观察鱼的活性。连续处理一周后,记录存活率，随机取10条斑马鱼 称重,5条鱼测量其体长,均求取平均值并记录每条鱼的体重变化和条长变化。对数据进行分析后,对三 组的斑马鱼进行解剖,制作斑马鱼性腺的石蜡切片来对比甲基睾酮对斑马鱼性腺的影响。通过对激素处理 过程中斑马鱼的性腺发育、体长增长和成活率的观察

2、,分析发现,实验组在甲基睾酮的作用下,斑马鱼的 雌性卵巢发育受到抑制,卵巢结构变化明显,还会促进斑马鱼精巢的发育巴关键词：斑马鱼;甲基睾酮;成活率；性腺发育鱼类是较低等的脊椎动物，多数情况下幼鱼的性腺尚未分化，激素可以影响性腺的分化和发育。在鱼 类中，对于已分化的性腺，外源激素可以改变个体的副性征、行为性别以及导致败育或者不孕不育，但一 般不能改变性腺的分化方向。目前，目前人多数学者对于外源激素，如甲基睾酮，对斑马鱼性腺发育的研 究已经很多，一般都集中于斑马鱼的雌性性腺以及性别未分化的斑马鱼的影响，实验中多采用不同浓度 的甲基睾酮处理斑马鱼，观察性腺发育情况。除此之外，作为一种重要的模式生物，

3、应用甲基睾酮对斑马 鱼性逆转的研究也不少，如邹记兴等采用外源混合激素硅胶药条肌肉埋植法诱导巨石斑鱼提早性逆转。本 试验采用不同的饵料饲喂性腺已分化的斑马鱼成鱼，观察斑马鱼的生长情况你的和存活率，并通过组织学 方法观察性腺变化，探讨甲基睾酮对斑马鱼卵巢和精巢的影响。1材料与方法1.1仪器和试剂：1.1.1实验用鱼斑马鱼斑马鱼是一种小型热带观赏鱼。由于其具有个体小、产卵量人、繁殖周期快、体外受精、胚胎透明、 突变表现性明显、易于观察、胚胎发育同步且发育速度快、饲养简便等优点，除了具有经济、观赏价值外, 还以其自身独有的优势被广泛的应用与发育生物学、遗传学等领域的研究，有很高的科研价值和广泛的应 用

4、前景，也因此成为研究最广泛的脊椎动物模式生物之一。1. 1.2仪器设备解剖镜、生物显微镜、电子天平、切片机、渗蜡器、中性树胶、水盘、单面切片、玻璃板、载玻片、 解剖刀、石蜡、盖片1. 1.3实验试剂饲料：30 U g/g甲基睾酮饲料、95%乙醇、普通饲料染料：布温氏固定液、不同浓度的乙醇（30%、50%70%. 85% 95% 100%）、100$乙醇（2）、100% 乙醇（1）、1/2乙醇+1/2二甲苯、二甲苯、1/2甲苯+1/2石蜡、涂贴片剂（蛋清溶液）、二 甲苯（2）、二甲苯（1）、蒸馆水、代氏苏木精、0. l%HCls 0. l%NaOH、0. 5%伊红（含95%乙醇） 1.2实验方法

5、：1.2.1甲基睾酮饲料的配制乙醇喷雾法：按照30 n g/g剂量称取甲基睾酮溶于95%乙醇中，充分溶解后喷洒在饵料中，放入40C 烘箱中烤干。1.2.2组别设计与处理方法本实验设置四个组：实验一组，实验二组，空白对照组、阴性对照组。每组有30尾斑马鱼。实验组用配置好的30 u g/g甲基睾酮饲料饲喂，空白对照组用普通饲料饲喂，阴性对照组用95%乙醇 饲喂，并且要定时适量的饲喂，看情况及时换水，处理一周，各组员按上午、下午各一次，观察鱼的活性， 记录存活率，随机捞取10条斑马鱼称重，测量4条鱼的体长，均求取平均值记录一条鱼的体重和体长变 化。1.2.3制作斑马鱼性腺石蜡切片（11E染色）（1）

6、随机取本组的斑马鱼若干，置于冰袋上，降低其活性，过一段时间后，对斑马鱼进行解剖，并选 取起性腺，包扌舌雌鱼的卵巢和雄鱼的精巢，然后用布温氏固定液24h,用70$的乙醇换洗三次，每次20min, 然后用70%的乙醇在04C中保存。（2）脱水：在不同浓度的乙醇中逐渐脱水，80%的乙醇中2030min,然后到95%乙醇中2030min, 之后到100%乙醇中2030min中脱水两次。（3）置换：1/2乙醇+1/2二甲苯中20min-*二甲苯中2030min（4）渗蜡：1/2 甲苯+1/2 石蜡中 2030min, 60C-*石蜡中 4060min, 60C（5）包埋：折出包埋纸盒，包埋前接蜡液，后置

7、渗蜡器加热板上，将渗蜡后的样品，轻轻提起纸盒， 置于水盆中，使纸盒底部浸入水中，顶部露出，吹气助顶部蜡凝固后，全部按入水中35min松手，然后 继续在水中冷却1015min取出，放回纸盒中。（6）修块：用单面切片，在玻璃板上修块，要求一蜡块一材料，蜡块或正方形或长方形，材料位于中 央，各面平直，材料边缘与蜡块边缘约3mm。（7）固着：将修好的蜡块用烧热的解剖刀固着在样品台上。（8）切片：将样品固定在切片机样品壁上，调整位置，切面垂直，调节刀角、刀距，紧锁，刀角15 20 :厚度跳到最人进行粗切，顺时针摇动切片机切片至切到样品；厚度调至6lOUm进行细切，直到 切到完整切片，并连续成带（9）贴片

8、：清洁载片，涂贴片剂，放切片35片，光面向卞，加水于切片下；然后进行展片，将载 玻片放于50摄氏度温台上加热至切片完全展开；之后烤干，吸掉多余的水分，继续烤干至完全干燥；贴 临时标签，铅笔表明信息（10）HE染色封片 脱蜡：二甲苯（2）中35 -*二甲苯（1）中15 复水：1/2乙醇+1/2二甲苯中2 100%乙醇（2）中2 100%乙醇（1）中2 95$乙醇中285%乙醇2 70%乙醇2 50$乙醇2 30%乙醇2蒸馆水2 初染：代氏苏木精中15 分化：0. 1%HC1脱色至变红15 0. l%NaOH至变蓝520 脱水：蒸饰水35 -30%乙醇2整理装片一50%乙醇2 -70%乙醇2 -8

9、5%乙醇2 复染：0.5%伊红（含95%乙醇）1015 脱水透明：95%乙醇中23 -*100%乙醇（1）中2-*100%乙醇（2）中3-*1/2乙醇+1/2二甲苯中3 -*二甲苯（1）中3-二甲苯（2）中$3 整理封片：将材料周闱擦干净（用干纱布擦，勿引入水，过程中二甲苯不能干，可以随时补加）， 加12滴胶，加干净干燥的标签，盖片，贴标签，注明HE染色及部位。（11）用生物显微镜观察，并拍照，处理照片。2结果本组为空白对照组，用普通饲料对斑马鱼进行饲喂。2.1甲基睾酮对斑马鱼生长及存活率影响的实验结果对斑马鱼进行饲喂的过程中斑马鱼的生长情况见表一。表一 一周内斑马鱼的生长情况（空白对照组）时

10、间体重/g体长/cn死亡数/尾成活率初0.3122.20100%末0. 3822.7196. 7%差值+0. 07+05-1-3. 3%注：“ + ”表示增长，“-”表示减少或者降低，以下表格省略该说明。2. 2甲基睾酮对斑马鱼性腺发育的影响的实验结果本组以雌性的卵巢和雄性的精巢的HE染色的石蜡切片为观察对象，并用生物显微镜对其进行显微摄 影，并经过处理。通过附图一，可以观察到卵巢各时期的形态特征：第【时相卵母细胞，主要见于未成熟鱼的卵巢，体 积最小，直径为1222 um,有明显的细胞核，核内染色质呈细丝状，本实验中很难见到：第II时相卵母 细胞，初级卵母细胞小生长期，细胞呈多角形，直径为90

11、300 um,细胞质较多，嗜碱性，被染成深紫 红色，核仁增多，染色较浅，靠近核膜内侧分布，外有一层滤泡细胞；第III时相卵母细胞，大生长期的初 级卵母细胞，直径为250500 u m，染色较I【时相卵母细胞浅，有两层滤泡膜，出现辐射带，细胞质为弱 嗜碱性，出现少量卵黄颗粒，晚期空泡内充满卵黄颗粒；第IV时相卵母细胞，晚期的初级卵母细胞，体积 增大，直径为8001580 um左右，辐射带增厚，染成浅紫红色，卵黄颗粒几乎充满核内空间，细胞质嗜 碱性，细胞核极化。第V时相卵母细胞，次级卵母细胞，明显的极化现象，充满粗人的卵黄颗粒，并逐渐 融合成块状，晚期核膜溶解，细胞调到卵巢腔中或者排出。通过附图二

12、，可以粗略的看到部分不同形态的生殖细胞（未标出）：精原细胞，呈圆形，直径为9.0 15.0 Um,细胞质为弱嗜碱性；初级精母细胞，呈圆形或椭圆形，直径比精原细胞小，4.05. 5 Um,核染 色质丰富，染色比精原细胞深；次级精母细胞，呈圆形，较小，直径为3. 54.0 Um,细胞质很少，核的 嗜碱性增加，存在的时间短暂：精子细胞小，直径为2. 5 Um,无明显的细胞质，只含有强嗜碱性的细胞核; 精子，精巢中最小的一种细胞，有特殊的形态，多数有头颈尾三部分组成。附图一空白组对照组斑马鱼的卵巢结构II.第I【时相卵母细胞；III.第III时相卵母细胞；IV.第IV时相卵母细胞：V.第V时相卵母细胞

13、;YG.卵黄颗粒；RB.辐射带附图二空白组对照组斑马鱼的精巢结构Sg精原细胞；Scl.初级精母细胞；Sc I【次级精母细胞；St.精子细胞；SC间质细胞3讨论3.1阴性对照组结果阴性对照组用95%乙醇对斑马鱼进行饲喂，结果见表二，附图三、附图四。表二 一周内斑马鱼的生长惜况（阴性对照组）时间体重/g体长/cm死亡数/尾成活率初0. 2802. 280100%末0. 3823. 320100%差值+0.102+1. 0400附图三阴性对照组斑马鱼的卵巢结构附图四阴性对照组斑马鱼的精巢结构3. 2实验组结果实验组一组和二组都用30 Ug/g甲基睾酮进行饲喂，结果见表三、表四，附图五、附图六。表三

14、一周内斑马鱼的生长悄况（实验一组）时间体重/g体长/cm死亡数/尾成活率初0. 3412.50100%末0. 4792.80100%差值+0.138+0.300表四 一周内斑马鱼的生长情况（实验二组）时间体重/g体长/cm死亡数/尾成活率初0.3122. 360100%末0. 3822.480100%差值+0 07+0. 1200附图五 实验组斑马鱼的卵巢结构人多数为I【IV时相的卵母细胞，第V时相卵母细胞明显减少。Ab凋亡小体3. 3三组实验结果对比讨论3. 3.1甲基睾酮对斑马鱼生长及存活率影响本试验是通过对甲基睾酮激素的使用和对比，来确定其对斑马鱼生长和存活率的影响。理论上，实验 组的体

15、重和体长跟对照组相比应该有一定程度的增长，而空白对照组与阴性对照组没有显著的差异，由此 实验组中斑马鱼的生长情况受到的抑制作用可以排除乙醇的影响，出现这种情况的原因应该在于雄激素对 动物体有着刺激仅欲，促进蛋白质合成的作用。但是从表一、二、三、四中对比可以看出，HT处理后斑马鱼的生长情况，在本次实验中有很大的误差, 两个实验组的实验结果相差很人，空白对照组与阴性对照组的实验结果也有很人的差距。不过，能反映出， 甲基睾酮在一定程度上促进了斑马鱼的生长。激素对成活率的影响跟多种因素有关，其中处理时间和处理强度是最重要的两个因素。而存活率各 组的实验结果几乎没有明显变化。因为本实验持续喂养斑马鱼的时

16、间较短，而且实验组较为单一，只有30 Pg/g的甲基睾酮处理的情况, 所以对实验结果的精确程度造成一定的的局限性。所以，甲基睾酮对成鱼成活率的影响还不能定论，本实 验表明30 U g/g的甲基睾酮对斑马鱼成活率有一定的影响，但影响不大。3. 3.2甲基睾酮对斑马鱼性腺发育的影响卓孝磊报道过MT町以促进雌性黄鳍卵母细胞退化，并可以促进雌雄间体早起的黄鳞的雄性生殖细胞 的发育。在鱼类的性转换实验中，国内外的学者都曾指出剧】，甲基睾酮的投喂量有一适宜的剂量范I韦I， 如杲雄激素的剂量过大，其结果是生殖腺萎缩，甚至是雌鱼出现反常的雄性化，也曾提到过30 U屛名的甲 基睾酮诱导的效果最佳，而本次实验的甲

17、基睾酮浓度正好为最明显的实验结果。通过对三组石蜡切片的对比观察，实验组的斑马鱼的卵巢有一定的萎缩，第V时相卵母细胞明显减 少，卵原细胞出现退化，卵巢犬小受到明显的抑制，出现凋亡小体，有向精巢发育的趋势，而精巢本身受 到了促进发育的作用。3. 4实验结论通过此次实验，可以得出结论：甲基睾酮对斑马鱼的生长发育会产生一定的影响，而且导致斑马鱼的 性发育受到影响，在一定程度上会影响成活率。对于斑马鱼性腺的影响具体为：甲基睾酮外源激素的使用， 使卵巢发育受到一定程度的抑制，以至于使卵巢的结构变化明显，促进精巢的发育。参考文献1 赵春刚，范鹏，刘奕，等.甲基睾酮对雌性斑马鱼性腺发育的抑制作用.东北农业大学

18、学报,2010, 41(12):70742 范鹏.甲基睾醐对雌性未性分化斑马鱼的影响.2009张立涛，等.外源激索对半滑舌暢早期性腺发育及生长的影响.河北渔业,2010 (2)3 Westerfield M. The rebrufish book M, OR; Univ of Pregon Preus, Eugene, 19934 张立涛.斑马鱼早期性腺发育及甲基睾酮对其性分化的影响.20105 卓孝磊，邹记兴，崔科，等.外源性甲基睾酮对雌性和间性黄鱗性腺发育的影响J.水生生物学报,2008, 32(6) ;8618676 陈木德.甲基冬酮诱导鲫鱼雌核发育子代性转化的研究J.水产学报,1982,6(2); 1471527 李广丽，刘晓春，林浩然.17 a甲基睾酮对赤点石斑鱼性逆转的影响J水产学报，2006, 30(2); 145150