《细胞工程》PPT课件.ppt

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1、第 三 章 细 胞 工 程 （ cell engineering） 主 讲 人 ： 黄 循 吟 一 、 概 述 问 题 ： 1、 什 么 是 细 胞 ？ 什 么 是 细 胞 工 程 ？ 2、 发 展 简 史 如 何 ？ 3、 细 胞 工 程 的 基 本 技 术 是 什 么 ？ 1、 什 么 是 细 胞 ？ 什 么 是 细 胞 工 程 ？ 细 胞 ： 是 由 细 胞 质 膜 包 裹 着 的 细 胞 质 和 核 或 核带 组 成 的 ， 能 自 我 繁 殖 的 结 构 物 ， 是 生 物 体 的基 本 结 构 单 位 和 功 能 单 位 ， 是 生 命 孕 育 的 起 点 ，是 生 物 体 的 基

2、 本 组 成 单 位 。 Cell engineering:根 据 生 物 学 和 工 程 学 的 原 理 ，在 细 胞 水 平 上 定 向 改 造 细 胞 的 遗 传 物 质 ， 培 育具 有 新 性 状 的 生 物 个 体 或 细 胞 群 体 ， 并 利 用 它们 为 人 类 生 产 各 类 药 品 和 其 他 产 品 以 及 提 供 服务 的 技 术 体 系 。 2、 发 展 简 史 如 何 ？ 1） 1838（ 最 早 ） 马 勒 ， 在 脊 椎 动 物 的 肿 瘤 细胞 中 观 察 到 多 核 现 象 2） 1849-1858年 科 学 家 们 在 肺 组 织 和 各 种 正常 组

3、织 及 发 尖 和 坏 死 部 位 都 发 现 了 多 核 现 象 。 3） 1859年 ， A.巴 里 解 开 了 这 个 谜 团 ， 他 认 为“ 多 核 现 象 ” 是 由 “ 单 个 细 胞 融 合 ” 而 成 的 。 4） 到 了 1907年 哈 林 发 现 了 细 胞 培 养 的 方 法 。使 人 们 能 应 用 这 种 细 胞 培 养 技 术 。 5） 1965年 哈 里 斯 和 奥 金 斯 在 前 人 的 基 础 上 在细 胞 融 合 中 所 做 的 贡 献 。 6） 直 到 1960年 ， 英 国 诺 丁 汉 大 学 科 金 教 授 创 造 性 地 应用 酶 解 的 方 法

4、， 才 首 次 成 功 地 从 番 茄 幼 苗 的 根 部 制 备到 大 量 的 原 生 原 体 。 在 此 基 础 上 ， 1972年 美 国 的 卡 尔森 等 人 用 NaBO3作 为 融 合 的 诱 导 剂 ， 将 来 自 不 同 种 的两 个 烟 草 原 生 质 体 进 行 融 合 ， 获 得 世 界 上 第 一 个 体 细胞 杂 种 植 株 。 此 后 ， 分 别 以 凯 乐 、 高 国 楠 和 乔 默 尔 曼等 为 首 的 三 个 科 学 家 小 组 ， 从 不 同 方 面 改 良 和 发 展 了植 物 体 细 胞 融 合 技 术 。 目 前 常 用 的 植 物 细 胞 融 合 技

5、 术 ，有 高 国 楠 建 立 的 使 用 化 学 融 合 剂 PEG（ 聚 乙 二 醇 ） 的 融合 技 术 （ 1974） ， 森 达 和 乔 默 尔 曼 创 立 和 发 展 的 电 融合 技 术 ， 以 及 斯 维 格 （ 1978） 将 电 融 合 体 系 培 养 技 术 。近 年 来 ， 在 植 物 细 胞 融 合 研 究 方 面 的 突 出 进 展 是 建 立了 单 对 细 胞 融 合 体 系 培 养 技 术 ， 并 基 本 上 解 决 了 融 合细 胞 的 选 择 问 题 。 现 在 ， 植 物 原 生 质 体 及 其 应 用 的 研究 已 成 为 植 物 细 胞 工 程 中 最

6、 活 跃 的 研 究 领 域 之 一 。 3、 细 胞 工 程 的 基 本 技 术 是 什 么 ？ 细 胞 的 培 养 技 术 ： 是 将 生 物 体 的 某 一 部 分 组 织取 出 一 小 块 ， 在 体 外 进 行 表 面 消 毒 处 理 后 ， 使之 分 散 成 单 个 游 离 的 细 胞 ， 并 放 置 在 人 工 配 制的 培 养 基 中 进 行 培 养 ， 使 之 生 长 分 裂 的 技 术 。 由 于 生 物 体 的 一 种 组 织 ， 往 往 包 含 有 两 种 以 上的 细 胞 ， 如 叶 片 组 织 至 少 年 犯 含 有 叶 肉 细 胞 ，维 菅 束 鞘 细 胞 和 表

7、 皮 细 胞 在 培 养 过 程 中 不 易 分开 ， 所 以 细 胞 培 养 有 时 叫 组 织 培 养 或 统 称 为 细胞 与 组 织 培 养 。 细 胞 的 培 养 技 术 的 意 义 细 胞 的 培 养 技 术 不 仅 是 细 胞 工 程 的 一 项 基 本 技术 ， 也 是 生 物 工 程 的 一 项 基 础 技 术 ， 掌 握 了 细胞 的 培 养 技 术 ， 就 可 以 利 用 细 胞 的 遗 传 稳 定 性和 变 异 性 为 细 胞 生 物 学 的 基 础 理 论 研 究 和 生 物工 程 的 生 产 应 用 提 供 用 力 的 手 段 。 例 ： 1、 研 究 者 可 以

8、根 据 不 同 的 研 究 内 容 和 目的 ， 十 分 方 便 地 在 细 胞 培 养 基 中 添 加 或 减 少 某些 特 殊 的 物 质 ， 如 激 素 或 生 长 因 子 等 ， 这 样 就可 以 确 切 了 解 这 些 因 子 对 细 胞 生 长 发 育 的 效 应及 其 生 理 生 化 本 质 ； 细 胞 的 培 养 技 术 的 意 义 2、 可 以 获 得 比 较 均 一 的 细 胞 群 体 ， 为 基 因 工程 和 细 胞 工 程 提 供 遗 传 的 对 象 和 受 体 获 得 变 异细 胞 株 ， 以 应 用 于 遗 传 学 和 遗 传 工 程 研 究 、 代谢 与 发 育

9、过 程 及 其 调 节 的 研 究 ， 获 得 有 用 价 值的 或 具 有 新 型 生 物 或 细 胞 系 ； 3、 建 立 种 质 资 源 库 ， 保 存 具 有 重 要 价 值 的 或濒 临 灭 绝 的 生 物 种 类 ； 4、 生 产 各 种 有 用 的 化 合 物 （ 药 物 ） ； 5、 进 行 无 性 系 快 速 繁 殖 等 。 细 胞 融 合 技 术 （ 也 称 细 胞 杂 交 技 术 ） ： 细 胞 融合 技 术 是 60年 代 创 立 的 。 它 是 在 一 定 条 件 下 ，使 不 同 来 源 的 两 个 或 多 个 细 胞 合 为 一 个 细 胞 并增 殖 或 形 成

10、新 的 生 物 体 的 技 术 。 动 物 细 胞 无 细 胞 壁 ， 可 直 接 诱 导 融 合 ； 植 物 细 胞 进 行 融 合 时 ， 必 须 先 除 去 细 胞 壁 。 意 义 ： 动 物 细 胞 融 合 技 术 的 成 功 ， 导 致 了 淋 巴细 胞 杂 交 瘤 技 术 的 出 现 ， 植 物 融 合 技 术 的 成 功不 仅 打 破 了 杂 交 育 种 的 亲 和 性 障 碍 ， 而 且 为 实现 “ 超 远 缘 杂 交 ” 提 供 了 可 能 ， 因 此 在 植 物 育种 上 有 重 大 工 的 意 义 。 二 、 动 物 细 胞 工 程 问 题 ： 1、 什 么 是 动 物

11、 细 胞 工 程 ？ 研 究 的内 容 是 什 么 ？ 2、 动 物 细 胞 工 程 技 层 次 如 何 ？ 3、 动 物 细 胞 工 程 有 何 理 论 与 实 践意 义 ？ 4、 动 物 细 胞 培 养 有 何 特 征 ？ 1、 什 么 是 动 物 细 胞 工 程 ？ 研 究的 内 容 是 什 么 ？ 动 物 细 胞 工 程 ： 是 根 据 细 胞 生 物 学 及 工程 学 的 原 理 ， 利 用 生 物 技 术 对 动 物 细 胞进 行 遗 传 操 作 ， 定 向 改 造 动 物 的 遗 传 性 ，创 造 新 的 物 种 ， 以 及 从 动 物 组 织 中 分 离有 特 定 的 功 能

12、的 细 胞 并 通 过 工 程 化 在 体外 条 件 下 使 之 快 速 繁 殖 ， 产 生 特 定 生 物产 品 的 工 艺 。 内 容 ： 人 工 受 精 （ 体 外 受 精 ） 胚 胎 移 植 核 移 植 哺 乳 动 物 孤 雌 生 殖 双 胞 及 嵌 合 体 性 别 选 择 胚 胎 分 割 及 保 存 细 胞 融 合 细 胞 大 规 模 培 养 动 物 细 胞 大 规 模 培 养 动 物 细 胞 反 应 动 力 学 动 物 细 胞 反 应 器 主 要 研 究 内 容 。 2、 动 物 细 胞 工 程 技 层 次 如 何 ？ 遗 传 操 作 可 在 不 同 层 次 上 进 行 ： 1）

13、、 在 整 体 细 胞 水 平 上 ， 利 用 细 胞 培 养的 各 种 工 艺 对 细 胞 进 行 改 造 或 用 细 胞 融合 的 方 法 制 备 各 种 杂 种 细 胞 ； 2） 、 在 细 胞 器 水 平 上 ， 可 以 进 行 核 移 植 ，染 色 体 注 射 或 将 微 核 人 工 细 胞 等 进 行 融合 以 制 备 各 种 细 胞 质 体 ， 或 改 变 染 色 体的 组 成 倍 性 ； 3） 、 在 基 因 水 平 上 ， 有 采 用 外 源 基 因 导入 的 方 法 ， 赋 予 细 胞 以 新 的 特 征 和 新 的功 能 。 4） 、 通 过 制 备 全 能 性 的 胚

14、胎 干 细 胞 ， 经 过 遗传 操 作 进 而 把 它 种 植 到 假 孕 动 物 的 子 宫 里 孕 育成 动 物 以 培 育 出 新 品 种 。 理 论 与 实 践 意 义 ： 哺 乳 动 物 细 胞 是 生 产 许 多 有着 重 要 经 济 价 值 的 医 药 产 品 的 理 想 场 所 ： 它 具有 促 进 蛋 白 质 精 确 表 达 与 形 成 三 维 结 构 的 内 环境 ， 能 进 行 乙 基 化 、 二 硫 键 等 ； 它 所 产 生 的 蛋白 质 能 分 泌 到 细 胞 外 ， 具 有 完 全 正 常 的 蛋 白 质的 结 构 。 因 此 用 动 物 细 胞 工 程 生 产

15、 的 产 品 ， 其分 离 纯 化 的 程 序 比 工 程 菌 生 产 的 产 品 要 简 单 得多 ， 而 且 功 能 也 可 靠 得 多 ； 另 外 通 过 动 物 细 胞工 程 ， 还 可 以 研 究 诸 如 细 胞 衰 老 调 亡 ， 基 因 定位 遗 传 病 因 等 基 础 理 论 问 题 。 4、 动 物 细 胞 培 养 有 何 特 征 ？ 4、 动 物 细 胞 培 养 特 征 。 根 据 这 些 特 点 ， 我 们 在 培 养 动 物 细 胞 时 必 须 注 意什 么 问 题 呢 ？ 1） 、 培 养 时 要 用 抗 生 素 ； （ 细 胞 生 长 缓 慢 ， 易染 菌 ） ；

16、2） 、 不 能 也 不 需 要 进 行 强 力 通 风 或 搅 拌 （ 无 细胞 壁 ， 很 脆 弱 ， 需 氧 量 少 ） ； 3） 、 有 的 细 胞 不 能 用 悬 浮 培 养 法 （ 有 锚 地 依 赖性 ） ； 4） 、 在 进 行 单 细 胞 培 养 时 ， 往 往 需 要 使 用 条 件培 养 基 （ 有 群 体 效 应 ） ； 5） 、 一 般 不 用 于 生 产 价 格 低 廉 的 产 品（ 培 养 成 本 较 高 ） ； 6） 、 大 规 模 培 养 时 不 能 全 用 微 生 物 反 应的 经 验 （ 生 长 曲 线 不 一 样 ， 反 应 动 力 学也 不 同 ， 有

17、 的 需 贴 壁 生 长 ） ； 7） 、 经 过 一 段 时 间 的 培 养 后 ， 就 必 须 进行 传 代 （ 随 着 细 胞 生 长 ， 营 养 物 质 消 耗 ，必 然 产 生 乳 酸 等 代 谢 产 物 的 积 累 ， 引 起细 胞 衰 亡 ， 但 一 般 繁 殖 50代 即 退 化 死 亡 ，肿 瘤 细 胞 除 外 ） 。 5、 动 物 细 胞 的 营 养 需 求 及 培 养 基 动 物 细 胞 所 需 的 营 养 要 求 更 高 ， 更 复 杂 。主 要 表 现 在 ： 1） 、 C源 不 能 用 无 机 盐 ， 而 大 多 数 为 葡萄 糖 ； 2） 、 N源 不 能 用 无

18、 机 物 （ 如 氨 、 硝 酸 盐等 ） ， 而 主 要 是 各 种 氨 基 酸 ； 3） 、 要 添 加 百 分 之 520的 小 牛 血 清 或动 物 胚 胎 浸 出 物 。 用 于 培 养 动 物 细 胞 的 培 养 基 分 为 ： 维 持 液 和 生 长 液 。 相 同 点 ： 都 含 有 氨 基 酸 、 葡 萄 糖 、 核 酸类 物 质 、 维 生 素 、 辅 酶 、 激 素 、 生 长 因子 、 微 量 元 素 、 缓 冲 系 统 。 不 同 点 ： 一 是 血 清 含 量 不 同 。 维 持 液 含量 低 或 者 不 含 血 清 ， 生 长 液 含 百 分 之 520血 清 。

19、 二 是 用 途 不 同 。 维 持 液 主 要 用来 保 存 细 胞 ， 而 生 长 液 用 于 培 养 、 增 殖细 胞 。 6、 动 物 细 胞 培 养 技 术 问 题 ： 什 么 是 动 物 细 胞 培 养 技 术 ？ 动 物 细 胞 培 养 技 术 的 材 料 来 源 如何 ？ 动 物 细 胞 培 养 方 式 如 何 ？ 动 物 细 胞 培 养 方 法 如 何 ？ 动 物 细 胞 培 养 技 术 ： 在 一 定 条 件 下 ， 通 过 人 工供 给 营 养 物 质 及 生 长 因 子 使 离 体 动 物 细 胞 或 组织 生 长 繁 殖 的 方 法 。 如 果 是 培 养 的 材 料

20、 是 组 织 块 ， 则 称 为 组 织 培 养 。 材 料 ： 一 是 胚 胎 。 如 10日 12日 龄 的 鸡 胚 胎 ，实 验 动 物 胚 胎 及 人 工 流 产 胎 儿 。 优 点 是 胞 间 的 粘 连 作 用 较 弱 ， 易 于 消 化 与 分 散 ，细 胞 生 命 力 强 ， 易 于 培 养 与 繁 殖 。 二 是 成 体 组 织 和 器 官 。 如 动 物 的 肝 脏 、 肾 脏 、脾 脏 及 白 血 球 等 。 优 缺 点 是 与 胚 胎 相 反 。 但 肿瘤 细 胞 增 殖 力 强 ， 可 在 体 外 长 期 培 养 和 繁 殖 ，并 可 用 微 生 物 培 养 方 式

21、进 行 悬 浮 培 养 。 培 养 方 式 ： 一 是 非 贴 壁 培 养 。 这 种 方 法一 般 用 于 血 液 、 淋 巴 细 胞 、 肿 瘤 细 胞（ 杂 交 瘤 细 胞 ） 和 一 些 转 化 细 胞 的 培 养 ，可 采 用 悬 浮 培 养 法 。 二 是 贴 壁 培 养 。 在 多 数 的 动 物 细 胞 ， 包括 非 淋 巴 组 织 的 细 胞 ， 多 采 用 附 着 于 带适 量 正 电 荷 的 固 体 或 半 固 体 表 面 进 行 培养 。 培 养 方 法 ： 1） 、 组 织 块 培 养 法 ： 将 动 物 组 织 切 成12立 方 毫 米 小 块 进 行 培 养 的

22、方 法 。 2） 、 细 胞 单 层 培 养 法 ： 问 题 ： 什 么 是 原 代 培 养 ？ 什 么 是 原 代 细胞 ？ 什 么 叫 传 代 培 养 （ 继 代 培 养 ） ？ 什 么 是 细 胞 系 ？ 什 么 是 细 胞 株 ？ 两 者 之间 的 关 系 如 何 ？ 细 胞 单 层 培 养 法 ： 动 物 组 织 块 经 消 化 分 散 成 单个 细 胞 或 细 胞 团 块 后 ， 粘 附 于 培 养 容 器 表 面 培养 成 新 生 细 胞 单 层 的 培 养 方 法 。 细 胞 分 散 ： 实 现 细 胞 单 层 培 养 及 克 隆 培 养 ， 需将 组 织 中 粘 连 在 一

23、块 的 细 胞 分 散 成 单 个 细 胞 。有 酶 消 化 法 、 物 理 分 散 法 和 酶 消 化 与 物 理 分 散结 合 法 。 细 胞 培 养 ： 细 胞 悬 浮 液 经 计 数 与 稀 释 后 ， 接 种于 无 菌 培 养 容 器 中 ， 加 生 长 液 ， 细 胞 就 粘 附 于瓶 底 内 壁 在 37。 C下 培 养 ， 细 胞 就 开 始 生 长 并 形成 单 层 。 这 一 培 养 过 程 称 为 原 代 培 养 。 原 代 培 养 获 得 的 细 胞 称 为 原 代 细 胞 。 原 代 细 胞 经 过 一 段 时 间 的 培 养 后 ， 需 要 将 培养 瓶 中 的 细

24、 胞 （ 单 层 ） 用 胰 蛋 白 酶 消 化 ， 制 成细 胞 悬 浮 液 ， 再 分 装 到 两 个 或 两 个 以 上 的 培 养瓶 中 培 养 。 这 个 过 程 就 称 传 代 培 养 （ 继 代 培 养也 细 胞 传 代 ） 。 原 代 细 胞 经 过 第 一 次 传 代 所 得 到 的 细 胞 群称 为 细 胞 系 。 从 原 代 细 胞 或 细 胞 系 中 获 得 的 能 连 续 传 代 、有 特 殊 性 质 或 特 殊 标 记 的 细 胞 称 为 细 胞 株 。 两 者 的 关 系 ： 细 胞 系 是 由 来 自 原 代 培 养 的 许 多细 胞 世 代 所 组 成 的 ，

25、 而 细 胞 株 则 需 具 有 特 殊 性质 或 标 记 ， 并 能 在 培 养 传 代 中 长 期 保 存 （ 能 稳定 遗 传 ） ， 一 旦 失 去 为 些 特 殊 性 质 或 标 记 ， 细胞 株 又 回 到 细 胞 系 。 3） 、 单 细 胞 分 离 培 养 法 ： 也 称 细 胞 克 隆 培 养 、是 将 动 物 组 织 分 散 后 ， 使 其 单 个 细 胞 培 养 成 纯系 集 体 的 技 术 。 由 于 动 物 细 胞 具 有 群 体 效 应 ， 因 此 要 想 将 单个 细 胞 培 养 成 一 个 克 隆 相 当 难 ， 即 使 在 最 优 良的 培 养 基 中 单 个

26、 细 胞 也 很 难 生 长 ， 那 怎 么 办 呢 ？常 用 两 种 方 法 ： 一 是 采 用 条 件 培 养 基 。 即 生 长 过 悬 浮 细胞 的 培 养 液 ， 其 中 含 有 能 促 进 细 胞 正 常生 长 和 分 裂 的 内 源 代 谢 物 ； 二 是 在 培 养 基 中 加 饲 养 细 胞 ， 如 小 鼠 胸腺 细 胞 或 腹 腔 细 胞 。 为 了 满 足 这 些 条 件 要 求 ， 通 常 采 用 有 限稀 释 法 和 微 板 克 隆 技 术 。 所 谓 有 限 稀 释 ： 就 是 细 胞 悬 浮 液 经 过 计数 后 ， 根 据 需 要 稀 释 到 一 定 的 细 胞

27、 浓 度 。 微 板 克 隆 技 术 ： 是 利 用 微 量 板 进 行 克 隆 培 养 的技 术 。 微 量 板 是 指 孔 径 为 6mm， 容 量 为 0.3ml的 多 孔 培养 板 。 通 常 有 96孔 、 55孔 、 和 24孔 三 种 规 格 。 培 养 方 法 ： 优 点 ： 是 分 离 混 杂 细 胞 的 优 良 方 法 。 在 传 代 过程 中 ， 由 于 不 容 易 产 生 交 叉 混 杂 ， 故 单 细 胞 培养 的 可 靠 性 与 重 复 性 良 好 。 用 途 ： 1） 、 建 立 纯 细 胞 系 ； 2） 、 检 查 细 胞 遗 传 一 致 性 ； 3） 、 分

28、离 细 胞 变 种 （ 细 胞 株 ） ； 4） 、 评 价 药 物 及 毒 物 对 细 胞 生 长 的 影 响 ； 5） 、 筛 选 淋 巴 细 胞 杂 交 瘤 及 基 因 工 程 细胞 ； 6） 、 制 备 单 克 隆 抗 体 并 用 于 病 毒 学 研 究 。 7、 动 物 细 胞 大 规 模 培 养 问 题 ： 1） 、 动 物 细 胞 大 规 模 培 养 指 的 是什 么 ？ 2） 、 为 什 么 要 进 行 动 物 细 胞 大 规 模 培养 ？ 3） 、 动 物 细 胞 大 规 模 培 养 首 先 要 解 决的 难 题 是 什 么 ？ 为 什 么 ？ 动 物 细 胞 大 规 模 培

29、 养 指 的 是 工 业 大 规 模 。 在 规 模 培 养 技 术 ： 是 指 在 人 工 控 制 的 条件 下 ， 高 密 度 大 量 培 养 有 用 的 动 物 细 胞来 生 产 生 物 制 品 的 技 术 。 这 种 技 术 是 目 前 生 物 工 业 中 大 量 增 殖基 因 工 程 、 细 胞 融 合 或 株 化 所 形 成 的 新型 有 用 细 胞 不 可 缺 少 的 技 术 。 要 解 决 动 物 细 胞 大 规 模 培 养 ， 首 先 要解 决 的 一 个 难 题 是 培 养 基 。 原 因 ： 一 是 血 清 来 源 难 而 昂 ， 大 量 使 用必 然 增 加 产 品 成

30、 本 ； 二 是 血 清 产 地 、 批 号 及 动 物 个 体 不 同 ，其 质 量 差 异 很 大 ， 加 上 血 清 的 组 成 还 没有 完 全 搞 清 楚 ， 因 而 细 胞 培 养 过 程 难 以检 测 控 制 ， 难 以 保 证 结 果 的 可 重 性 ； 三 是 血 清 中 含 有 多 种 （ 大 量 ） 的 蛋 白 质 ，从 而 给 产 品 分 离 纯 化 带 来 许 多 困 难 ， 容易 混 进 污 染 物 包 括 病 毒 和 细 菌 。 对 于 这 种 情 况 ， 人 们 自 然 提 出 这 样 的问 题 ， 能 不 能 不 用 血 清 或 者 能 不 能 用 别的 东

31、西 来 代 替 血 清 ？ 要 回 答 这 个 问 题 ， 首 先 必 须 搞 清 楚 血 清 在 动 物细 胞 培 养 中 起 到 什 么 样 的 作 用 ？ 研 究 表 明 ： 在 合 成 动 物 培 养 基 中 加 入 胎 牛 血 清或 小 牛 血 清 ， 主 要 是 利 用 其 中 含 有 的 血 清 蛋 白及 a-球 蛋 白 两 种 成 分 。 血 清 蛋 白 能 刺 激 细 胞 生 长 ； a-球 蛋 白 能 促 进 细 胞 贴 壁 伸 展 及 拮 抗 胰 蛋 白 酶的 活 力 ， 保 证 经 胰 蛋 白 酶 消 化 后 的 细 胞 能 正 常生 长 。 搞 清 了 这 个 问 题

32、 后 ， 我 们 才 有 可 能 来 开 发 无 血清 培 养 基 。 目 前 这 项 工 作 已 经 成 为 动 物 细 胞 工程 的 重 要 内 容 之 一 。 无 血 清 培 养 基 分 为 ： 基 本 培 养 基 ： 是 已 知 成 分 的 培 养 基 ， 大多 数 以 DME培 养 基 与 HamF12培 养 基 等 量混 合 。 基 本 合 成 培 养 基 +生 长 因 子 （ 激 素 和 维 生素 等 约 有 30多 种 有 机 物 和 无 机 微 量 物 质 ，包 括 哺 乳 动 物 绝 大 多 数 内 分 泌 激 素 ） 。 基 本 合 成 培 养 基 +组 织 抽 提 液

33、（ 如 乳 蛋 白水 解 液 、 酪 蛋 白 水 解 物 和 胚 胎 浸 出 液 ） 。 现 在 用 的 最 多 的 是 第 二 种 ， 也 称 为 添加 生 长 因 子 培 养 基 ， 它 的 特 点 是 ： 组 成物 质 的 种 类 与 数 量 均 为 已 知 ， 并 可 按 需要 调 节 。 优 点 ： 一 是 可 用 于 培 养 不 同 种 类 的 细 胞 及在 不 含 血 清 培 养 基 中 不 能 生 长 的 细 胞 ； 二 是 可 用 于 杂 种 细 胞 、 基 因 工 程 细胞 及 突 变 体 细 胞 的 培 养 ， 生 产 有 用 物 质 ； 三 是 大 大 简 化 细 胞

34、培 养 产 物 分 离 纯化 的 操 作 程 序 。 能 起 血 清 作 用 的 激 素 和 生 长 因 子 主 要 有 ： 铁 传 递 蛋 白 、 乙 醇 胺 、 胰 岛 素 、 促 胃 激 素 、 维生 素 C、 氢 化 考 的 松 和 硒 等 。 培 养 技 术 与 其 条 件 控 制 ： 动 物 细 胞 培 养 方 法 很 多 ， 但 可 概 括 为 两大 类 即 悬 浮 培 养 法 和 固 定 化 培 养 法 。 微 载 体 培养 法 是 两 者 结 合 而 衍 生 出 来 的 。 下 面 简 单 介 绍 悬 浮 培 养 法 ： 定 义 ： 即 让 细 胞 在 培 养 液 中 呈 现

35、 悬 浮 状 态 下 生长 繁 殖 。 其 培 养 方 式 又 有 批 量 法 、 半 连 续 法 及 连 续 法 。 适 用 范 围 ： 杂 交 瘤 细 胞 、 肿 瘤 细 胞 、 血液 细 胞 和 淋 巴 细 胞 的 大 规 模 培 养 。 主 要用 于 生 产 疫 苗 、 r-干 扰 素 、 白 介 素 及 单 克隆 抗 体 等 生 物 药 品 或 制 品 。 优 点 ： 可 连 续 收 集 部 分 细 胞 进 行 移 植 继代 培 养 ， 传 代 培 养 时 无 需 消 化 分 散 ， 免受 酶 类 、 EDTA及 机 械 损 害 ； 细 胞 必 集 率高 ， 并 可 连 续 测 定

36、细 胞 浓 度 ， 还 可 能 实现 大 规 模 直 接 克 隆 培 养 。 但 此 法 不 适 用 于 正 常 组 织 细 胞 的 培 养 。 动 物 细 胞 大 规 模 培 养 的 工 艺 流 程 ： 8、 胚 胎 干 细 胞 系 的 建 立 及 其 利用 技 术 概 述 ： 问 题 ： 什 么 是 胚 胎 干 细 胞 ？ 胚 胎 细 胞 有 何 特 征 ？ 胚 胎 干 细 胞 如 何 获 得 ？ 如 何 培 养 ？ 胚 胎 干 细 胞 如 何 发 育 成 个 体 ？ 胚 胎 干 细 胞 （ Embryonic Stem Cell 简 称ES） ： 是 从 早 期 胚 胎 的 内 细 胞

37、团 分 离 出来 的 ， 能 在 体 外 培 养 的 一 种 高 度 末 分 化的 细 胞 。 胚 胎 细 胞 的 特 征 ： 一 是 具 有 正 常 二 倍 染 色 体 ； 二 是 具 有 发 育 的 全 能 性 （ 一 个 细 胞 ， 都包 含 有 某 个 体 的 全 部 遗 传 信 息 ， 在 离 体培 养 条 件 下 能 生 长 为 完 整 的 个 体 ） 广 泛地 分 化 成 各 种 组 织 ； 三 是 能 在 体 外 扩 增 ， 可 进 行 遗 传 操 作 ，选 择 、 克 隆 和 冻 存 。 胚 胎 干 细 胞 获 得 有 两 条 途 径 ： 一 是 从 早 期 胚 胎 中 获

38、得 ； 二 是 结 合 克 隆 技 术 获 得 。 胚 胎 干 细 胞 的 培 养 ： 由 于 大 多 数 胚 胎 干 细 胞 必 须 生 长 在滋 养 层 细 胞 上 ， 体 外 培 养 时 ， 培 养 皿 需要 百 分 之 0.1明 胶 铺 底 ， 常 用 STO细 胞 为滋 养 细 胞 （ 即 小 鼠 胚 胎 成 纤 维 细 胞 ） 。 STO的 特 征 ： 具 有 接 触 抑 制 ， 它 能 分 泌一 些 促 使 细 胞 生 长 和 抑 制 细 胞 分 化 的 因子 或 某 些 细 胞 外 基 质 ， 使 胚 胎 内 细 胞 团能 在 比 较 稳 定 的 环 境 中 生 长 并 保 持

39、 末 分化 状 态 。 胚 胎 干 细 胞 是 否 培 养 成 功 在 于 ： 一 是 胚 胎 发 育 的 精 细 阶 段 ； 二 是 要 从 单 个 胚 胎 中 获 得 足 够 量 的 具 有多 能 干 细 胞 的 前 体 细 胞 ； 三 是 培 养 条 件 和 培 养 方 式 。 目 前 ， ES技 术 实 用 化 还 需 要 解 决 的 技术 难 题 还 用 很 多 ， 主 要 表 现 在 ： 一 是 胚 胎 干 细 胞 极 易 分 化 为 其 它 细 胞 ，如 何 维 持 体 外 扩 增 时 不 发 生 分 化 ？ 二 是 如 何 定 向 诱 导 干 细 胞 分 化 ？ 三 是 由 E

40、S在 体 外 发 育 成 一 完 整 的 器 官 特别 是 像 心 、 肝 、 肾 、 肺 等 大 型 精 细 复 杂的 器 官 这 一 目 标 ， 还 需 要 技 术 上 的 突 破 ； 四 是 如 何 克 服 移 植 排 拆 反 应 。 （ 二 ） 、 动 物 细 胞 融 合 技 术 及其 应 用 1、 动 物 细 胞 融 合 技 术 ： 定 义 ： 在 外 力 作 用 下 ， 使 两 个 或 两 个 以上 的 异 源 细 胞 合 并 为 一 个 多 核 细 胞 的 过程 。 操 作 过 程 ： 意 义 ： 是 用 人 工 的 方 法 打 破 了 生 物 界 物 种 间 的 屏障 ， 使

41、人 们 能 够 按 照 自 己 的 意 愿 把 各 种 动 物 的 、植 物 的 、 动 植 物 的 不 同 组 织 类 型 的 细 胞 融 合 在一 起 ； 还 可 以 把 不 同 细 胞 的 不 同 组 分 ， 胞 核 和胞 质 体 ， 单 个 染 色 体 或 少 数 染 色 体 ， 不 同 胞 浆成 分 ， 通 过 微 核 、 人 工 细 胞 、 类 脂 小 泡 等 彼 此融 合 ， 而 制 备 各 种 类 型 的 重 组 细 胞 。 用 来 融 合 的 体 细 胞 一 般 都 是 已 分 化 的 二 倍体 细 胞 。 融 合 形 成 四 倍 体 细 胞 。 这 种 细 胞 是 人类 强

42、 制 自 然 的 结 果 ， 因 此 产 生 了 很 少 发 生 的 杂种 细 胞 。 2、 促 融 因 素 及 其 诱 导 融 合 作 用 1） 、 病 毒 诱 导 融 合 ： 2） 、 PEG诱 导 融 合 ： 3） 、 电 场 诱 导 融 合 ： 3、 细 胞 融 合 的 方 式 1） 、 完 整 细 胞 之 间 的 融 合 ： 2） 、 核 体 、 胞 质 体 与 完 整 细 胞 的 融 合 ： 3） 、 微 细 胞 与 完 整 细 胞 的 融 合 ： 4） 、 脂 质 体 介 导 的 细 胞 融 合 ： 这 四 种 融 合 方 式 ， 共 同 点 均 有 一 方 为 完 整细 胞 ，

43、 这 个 完 整 细 胞 可 用 于 检 测 另 一 种 细 胞 、细 胞 器 及 生 物 大 分 子 对 其 遗 传 性 及 表 达 的 影 响 。所 以 这 个 完 整 细 胞 相 当 于 一 个 活 试 管 或 微 型 反应 器 。 4、 杂 种 细 胞 的 筛 选 原 理 及 筛 选系 统 筛 选 杂 种 细 胞 是 细 胞 融 合 过 程 中 最 重 要环 节 之 一 。 杂 种 细 胞 在 总 体 细 胞 中 为 数较 少 ， 因 此 在 进 行 细 胞 融 合 之 前 就 必 须先 设 计 如 何 把 杂 交 细 胞 从 众 多 的 细 胞 群体 中 筛 选 出 来 ， 筛 选

44、的 目 的 是 获 得 性 能优 良 的 杂 种 细 胞 。 筛 选 的 原 理 ： 将 融 合 混 合 物 接 种 于 选 择性 培 养 基 上 ， 终 止 同 核 多 型 、 异 核 多 型及 末 融 合 的 亲 本 细 胞 的 繁 殖 ， 而 仅 允 许异 型 双 核 细 胞 繁 殖 。 在 动 物 细 胞 的 融 合 过 程 中 ， 需 要 根 据筛 选 系 统 来 选 择 适 当 的 亲 本 细 胞 或 依 据细 胞 的 生 理 生 化 特 性 来 设 计 特 定 的 筛 选系 统 ， 以 便 于 获 得 具 有 活 力 的 有 益 杂 种细 胞 。 筛 选 的 方 法 ： HAT选

45、 择 系 统 ： 含 一 定 浓 度 的 次 黄 嘌 呤（ H） 、 氨 基 喋 呤 （ A） 及 胸 腺 嘧 啶 核 苷（ T） 的 一 种 选 择 性 培 养 基 。 它 们 与 细 胞DNA合 成 有 关 。 抗 药 性 选 择 系 统 ： 利 用 生 物 细 胞 对 药 物敏 感 性 的 差 异 来 筛 选 杂 种 细 胞 。 细 胞 不同 ， 其 生 理 生 化 特 征 不 一 样 ， 对 同 一 种药 物 的 敏 感 性 差 异 很 大 。 互 补 选 择 法 ： 利 用 两 种 亲 本 营 养 缺 陷 型互 补 原 理 来 筛 选 杂 种 细 胞 的 方 法 。 原 位 杂 交

46、法 和 基 因 探 针 选 择 法 前 面 已 介绍 过 。 5、 细 胞 融 合 技 术 的 应 用 理 论 上 ： 基 因 定 位 及 绘 制 人 类 基 因 图 ， 基 因 互 补 分 析 ； 应 用 上 ： 主 要 是 生 产 活 性 物 质 。 （ 三 ） 、 单 克 隆 抗 体 技 术 1、 概 述 ： 2、 基 本 原 理 ： 3、 经 典 的 方 法 获 取 抗 体 存 在 以 下 缺 点 ： 一 是 这 些 抗 体 不 是 均 匀 的 ， 而 是 多 种 抗 体 的 混合 物 。 特 异 性 差 、 检 测 灵 敏 度 低 、 使 用 效 果 不好 ； 二 是 由 于 动 物

47、 个 体 差 异 而 导 致 各 批 血 清 内 抗 体的 种 类 与 含 量 不 一 ， 无 法 标 准 化 ； 三 是 由 于 分 泌 抗 体 的 B细 胞 寿 命 很 短 ， 一 般 只能 存 活 几 天 ， 因 此 抗 体 的 产 生 是 有 限 的 ， 无 法大 量 生 产 。 4、 杂 交 瘤 技 术 ： 将 骨 髓 瘤 细 胞 与 免 疫 细胞 融 合 制 备 杂 交 细 胞 的 过 程 。 通 过 这 样 的 技 术 得 到 的 杂 交 瘤 细 胞 具有 了 两 组 亲 本 细 胞 的 遗 传 特 征 。 能 在 体外 长 期 培 养 ， 快 速 无 限 繁 殖 的 能 力 ，

48、 又有 免 疫 反 应 和 分 泌 抗 体 的 能 力 。 单 克 隆 抗 体 ： 由 一 个 杂 交 瘤 细 胞 克 隆 产生 的 抗 体 。 5、 单 克 隆 抗 体 的 制 备 过 程 ： 6、 单 克 隆 抗 体 的 基 本 特 性 ： 1） 、 为 高 纯 度 单 一 抗 体 ， 特 异 性 强 ， 检测 灵 敏 度 高 ； 2） 、 大 规 模 培 养 ， 可 标 准 化 ； 3） 、 用 液 氮 深 冻 法 可 长 期 保 存 ； 4） 、 可 在 分 子 水 平 上 解 析 存 在 于 病 毒 表面 的 抗 原 或 抗 体 ； 5） 、 可 用 不 纯 的 抗 原 制 备 纯

49、的 抗 体 ； 6） 、 难 以 检 测 出 微 生 物 突 变 株 （ 因 为 特异 性 太 强 ） ； 7） 、 有 时 不 能 产 生 与 抗 原 交 联 的 功 能 ，易 受 PH值 、 温 度 及 盐 浓 度 的 影 响 ； 8） 、 有 时 亲 和 力 较 低 ， 半 衰 期 短 ， 又 需长 期 持 之 以 恒 的 工 作 。 （ 四 ） 、 动 物 细 胞 克 隆 的 原 理与 途 径 1、 概 述 ： 克 隆 动 物 的 难 点 ： 第 一 ， 选 择 什 么 样 的 体 细 胞 作 为 供 核 细胞 ； 第 二 ， 对 细 胞 核 怎 么 样 处 理 ， 才 能 使 它在

50、去 核 卵 母 细 胞 的 细 胞 质 环 境 中 重 新 恢复 到 末 分 化 状 态 或 回 到 受 精 卵 的 合 子 状态 。 2、 Clone的 定 义 和 途 径 ： 1） 、 Clone的 定 义 ： 是 指 通 过 无 性 形 式由 单 个 细 胞 产 生 的 和 亲 代 非 常 相 像 的 单个 动 物 后 代 。 这 个 定 义 简 单 扼 要 ， 也 符 合 克 隆 技 术的 历 史 和 现 实 情 况 。 从 克 隆 技 术 的 实 践和 习 惯 上 看 。 这 里 所 说 的 单 细 胞 可 以 是体 细 胞 ， 也 可 以 是 ES。 从 年 龄 上 看 ， 既可

51、以 是 成 年 细 胞 ， 也 可 以 是 胎 儿 细 胞 。 2） 、 动 物 克 隆 两 条 途 径 ： 一 是 应 用 胚 胎 分 割 技 术 。 这 种 技 术 产 生的 后 代 数 量 有 限 ， 方 法 较 为 简 便 ， 采 用较 为 简 单 的 酶 处 理 和 机 械 分 离 法 分 割 胚胎 ， 可 有 效 地 获 得 同 卵 孪 生 胚 和 后 代 。 对 于 无 呈 微 操 作 仪 的 实 验 室 ， 这 是 一条 获 得 大 量 同 卵 孪 生 实 验 动 物 的 有 效 途径 。 优 良 家 畜 品 种 的 繁 殖 也 可 采 取 这 一方 式 。 二 是 通 过 细

52、 胞 核 移 植 构 建 。 通 过 体 细 胞核 移 植 进 行 动 物 克 隆 是 以 不 同 来 源 和 不同 阶 级 的 早 期 胚 胎 或 体 细 胞 的 含 有 少 部分 细 胞 质 的 细 胞 核 （ 核 质 体 ） 作 供 体 ，移 入 去 核 的 受 体 卵 母 细 胞 中 ， 使 供 体 核在 受 体 细 胞 中 重 新 编 程 ， 从 而 开 始 新 的重 构 或 重 建 胚 胎 发 育 的 过 程 。 3、 克 隆 的 方 法 和 步 骤 ： 1） 、 供 体 细 胞 的 准 备 ； 2） 、 受 体 细 胞 的 准 备 ； 3） 、 核 移 植 操 作 ； 4） 、 重 构 胚 的 培 养 与 移 植 。