大规模表达序列标签测定及分析

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1、中 山 大 学 生 科 院 主 要 内 容 ESTs的 来 源 上 世 纪 80年 代 ， 对 cDNA序 列 进 行 大 规 模 测 序 的 想 法 就 曾 提 出 ， 但 对 此一 直 存 在 争 论 ， 有 人 认 为 这 种 方 法 能 发 现 成 千 上 万 的 新 基 因 ； 而 反 对 者 则 认为 cDNA序 列 缺 少 重 要 的 基 因 调 控 区 域 的 信 息 。 90年 代 初 Graig Venter 提 出了 EST的 概 念 ， 并 测 定 了 609条 人 脑 组 织 的 EST， 宣 布 了 cDNA大 规 模 测 序 的 时代 的 开 始 (Adams e

2、t al., 1991)。 93年 前 ESTs数 据 收 录 于 GenBank， EBI和 DDBJ。 1993年 NCBI(National Center of Biotechnology Information)建 立 了一 个 专 门 的 EST数 据 库 dbEST来 保 存 和 收 集 所 有 的 EST数 据 。02468101214161820总EST条目 （million） 1993 1995 1997 1999 2001时 间 （ 年 ）dbEST中 数 据 量 的 增 长 什 么 是 ESTs ？ESTs（ Expressed Sequence tags ） 是 从 已

3、 建 好 的 cDNA库 中 随 机 取 出 一 个克 隆 ， 从 5末 端 或 3末 端 对 插 入 的 cDNA片 段 进 行 一 轮 单 向 自 动 测 序 ， 所获 得 的 约 60-500bp的 一 段 cDNA序 列 。 ESTs与 基 因 识 别 ESTs已 经 被 广 泛 的 应 用 于 基 因 识 别 ， 因 为 ESTs的 数 目 比 GenBank中 其 它 的 核 苷 酸 序 列 多 ， 研 究 人 员 更 容 易 在 EST库 中 搜 寻 到 新 的 基 因(Boguski et al., 1994). 在 同 一 物 种 中 搜 寻 基 因 家 族 的 新 成 员

4、(paralogs)。 在 不 同 物 种 间 搜 寻 功 能 相 同 的 基 因 (orthologs)。 已 知 基 因 的 不 同 剪 切 模 式 的 搜 寻 。 【 注 ： 不 过 很 难 确 定 一 个 新的 序 列 是 由 于 交 替 剪 切 产 生 的 或 是 由 于 cDNA文 库 中 污 染 了 基 因 组DNA序 列 (Wolfsberg et al., 1997)】 ESTs与 基 因 图 谱 的 绘 制 EST可 以 借 助 于 序 列 标 签 位 点 (sequence-tagged sites)用 于 基 因 图 谱 的构 建 . STS本 身 是 从 人 类 基

5、因 组 中 随 机 选 择 出 来 的 长 度 在 200-300bp左 右 的经 PCR检 测 的 基 因 组 中 唯 一 的 一 段 序 列 。 来 自 mRNA的 3非 翻 译 区 的 ESTs更适 合 做 为 STSs， 用 于 基 因 图 谱 的 绘 制 。 其 优 点 主 要 包 括 ： 由 于 没 有 内 含 子 的 存 在 ， 因 此 在 cDNA及 基 因 组 模 板 中 其 PCR产 物 的大 小 相 同 ； 与 编 码 区 具 有 很 强 的 保 守 性 不 同 ， 3UTRs序 列 的 保 守 性 较 差 ， 因 此很 容 易 将 单 个 基 因 与 编 码 序 列 关

6、 系 非 常 紧 密 的 相 似 基 因 家 族 成 员 分 开 。 （ James Sikela等 ， 1991年 ）GeneMap 96 定 位 了 16,000个 基 于 基 因 的 STS(Schuler et al., 1996)；GeneMap 98 定 位 了 30,000个 基 于 基 因 的 STS(Deloukas et al., 1998)， 而且 基 因 图 谱 随 着 STS的 定 位 正 在 不 断 的 更 新 中 。 ESTs与 基 因 预 测 由 于 EST来 源 于 cDNA， 因 此 每 一 条 EST均 代 表 了 文 库 建 立 时 所 采 样品 特 定

7、 发 育 时 期 和 生 理 状 态 下 的 一 个 基 因 的 部 分 序 列 。 使 用 合 适 的 比 对参 数 ， 大 于 90 的 已 经 注 释 的 基 因 都 能 在 EST库 中 检 测 到 (Bailey et al., 1998)。 ESTs可 以 做 为 其 它 基 因 预 测 算 法 的 补 充 ， 因 为 它 们 对 预 测 基 因的 交 替 剪 切 和 3 非 翻 译 区 很 有 效 。 ESTs与 SNPs 来 自 不 同 个 体 的 冗 余 的 ESTs可 用 于 发 现 基 因 组 中 转 录 区 域 存 在 的 SNPs。最 近 的 许 多 研 究 都 证

8、明 对 ESTs数 据 的 分 析 可 以 发 现 基 因 相 关 的 SNPs (Buetow et al., 1999;Garg et al., 1999; Marth et al., 1999; Picoult-Newberg et al., 1999) 。 应 注 意 区 别 真 正 的 SNPs和 由 于 测 序 错 误 ( ESTs为 单 向 测 序 得 来 ， 错 误 率可 达 2 )而 引 起 的 本 身 不 存 在 的 SNPs。 解 决 这 一 问 题 可 以 通 过 ： 提 高 ESTs分 析 的 准 确 性 。 对 所 发 现 的 SNPs进 行 实 验 验 证 。 利

9、 用 ESTs大 规 模 分 析 基 因 表 达 水 平 因 为 EST序 列 是 从 某 以 特 定 的 组 织 的 cDNA文 库 中 随 机 测 序 而 得 到 ， 所 以 可 以 用 利 用 未 经 标 准 化和 差 减 杂 交 的 cDNA文 库 EST分 析 特 定 组 织 的 基 因 表 达 谱 。 标 准 化 的 cDNA文 库 和 经 过 差 减 杂 交 的cDNA文 库 则 不 能 反 应 基 因 表 达 的 水 平 。 CGAP 为 研 究 癌 症 的 分 子 机 理 ， 美 国 国 家 癌 症 研 究 所 NCI的 癌 症 基 因 组 解 析 计 划 (Cancer G

10、enome Anatomy Project , CGAP)构 建 了 很 多 正 常 的 或 是 癌 症 前 期 的 和 癌 症 后 期 的 组 织 的 cDNA文 库 ， 并 进 行了 大 规 模 的 EST测 序 ， 其 中 大 部 分 的 文 库 未 经 标 准 化 或 差 减 杂 交 处 理 。CGAP网 站 提 供 了 多 种 工 具 用 以 分 析 不 同 文 库 间 基 因 表 达 的 差 异 , 如 ： Digital Gene Expression Displayer (DGED) cDNA xProfiler 基 因 表 达 系 列 分 析 (Serial Analysis

11、 of G ene Expression, SAGE) 基 因 表 达 系 列 分 析 是 一 种 用 于 定 量 ， 高 通 量 基 因 表 达 分 析 的 实 验 方 法 (Velculescu et al., 1995)。SAGE的 原 理 就 是 分 离 每 个 转 录 本 的 特 定 位 置 的 较 短 的 单 一 的 序 列 标 签 （ 约 9-14个 碱 基 对 ） ， 这 些 短的 序 列 被 连 接 、 克 隆 和 测 序 ， 特 定 的 序 列 标 签 的 出 现 次 数 就 反 应 了 对 应 的 基 因 的 表 达 丰 度 。 DNA微 阵 列 或 基 因 芯 片 的

12、研 究 高 密 度 寡 核 苷 酸 cDNA 芯 片 或 cDNA微 阵 列 是 一 种 新 的 大 规 模 检 测 基 因 表 达 的 技 术 ， 具 有 高 通 量分 析 的 优 点 。 在 许 多 情 况 下 ， cDNA芯 片 的 探 针 来 源 于 3EST (Duggan et al., 1999)， 所 以 EST序 列的 分 析 有 助 于 芯 片 探 针 的 设 计 。 Serial analysis of gene expression (SAGE) 技 术 流 程反转录酶切连接 测序单条测序对3040条EST测序分析由于采样量大大提高，可对低表达基因进行分析：基因表达量分

13、析、寻找新基因等等 基 因 芯 片 或 微 阵 列 技 术 流 程. Clone反 转 录 （ 可 选 ）读 取 光 密 度 聚 类 分 析 （ 非 同 源 功 能 注 释 ）标 记 杂 交反 转 录EST分 析 . G ene Chip0.1 0.06 0.05 0.04 0 0 0.07 0.01 表 达 量矩 阵G1,G3,G5 G2,G4 G6,G9 利 用 EST， SAGE分 析 结 果制 作 芯 片 （ 研 究 已 发 现 的基 因 ）连 接 ，转 化 Rice genome-wide DNA chip (60,000+预 测 基因 ) 果 蝇 基 因 芯 片 原 位合 成 几

14、种 大 规 模 分 析 基 因 表 达 水 平 的 方 法 的比 较 EST SAGE Microarray GeneChip 发 现 新 基 因 是 是 否 否 有 序 列 是 （ 可 直 接 进 行 可 变 剪 切 的 分 析 ） 否 否 否 主 要 问 题 采 样 量 实 验 过 程 重 复 性 成 本 高 ESTs很 短 ， 没 有 给 出 完 整 的 表 达 序 列 ； 低 丰 度 表 达 基 因 不 易 获 得 。 由 于 只 是 一 轮 测 序 结 果 ， 出 错 率 达 2%-5%； 有 时 有 载 体 序 列 和 核 外 mRNA来 源 的 cDNA污 染 或 是 基 因 组

15、 DNA的 污 染 ； 有 时 出 现 镶 嵌 克 隆 ； 序 列 的 冗 余 ， 导 致 所 需 要 处 理 的 数 据 量 很 大 。ESTs数 据 的 不 足 体 内 ： 翻 译体 外 研 究 ： 反 转 录连 接 ，转 化 一 、 cDNA文 库 构 建 非 标 准 化 的 cDNA文 库 的 构 建 。 经 标 准 化 或 扣 除 杂 交 处 理 的 cDNA文 库 。 OligoT cDNA文 库 。 随 机 引 物 cDNA文 库 。 cDNA文 库 的 构 建 及 其 均 一 化 扣 除 杂 交 处 理For subtraction of cDNA libraries the

16、procedure is similar to normalization, except that the PCR products arise from a different library (whose genes are to be subtracted from the original library) Reference: Bonaldo, M.F., et.al, 1996. Normalization and subtraction: Two approaches to facilitate gene discovery. Genome Res. 6: 791-806. 扣

17、 除 杂 交 技 术 的 发 展 扣 除 杂 交 技 术 最 早 应 用 是 在 20世 纪 80年 代 初 ， 当 时 的 目 的 是 为 了 构 建 非 洲 爪 蟾 的胚 囊 cDNA文 库 和 制 备 差 异 表 达 基 因 的 特 异探 针 。 差 异 表 达 的 基 因 通 过 检 测 样 本 cDNA(tester)和 过 量 的 对照 样 本 mRNA (driver)的 相 互 杂 交 而 得 到 。 在 检 测 样 本 cDNA (tester)和 对 照 样 本 mRNA (driver)同 时 表 达 的 基 因 会 形 成 mRNA/cDNA 杂 交 分 子 ， 而 检

18、 测 样 本 特 异 表 达 的 基 因则 保 持 单 链 状 态 。 单 链 分 子 和 双 链 分 子 通 过 羟 磷 灰 石 层 析 而 分 离 ， 分 离 得 到 的 单 链分 子 是 检 测 样 本 特 异 表 达 的 基 因 。 差 异 表 达 的 cDNA可 以 直 接 被 克 隆 或 通 过 cDNA文库 筛 选 而 得 到 。 这 个 方 法 后 来 又 得 到 改 进 ， 包 括 用 生 物 素 标 记和 oligo(dT)30-latex标 记 cDNA， 以 增 加 单 双 链 分 子 的 分 离 效 率 。 后 来 ， 通 过 PCR选 择性 cDNA扩 增 技 术

19、被 应 用 到 扣 除 杂 交 中 ， 以 克 服 以 往 扣 除 杂 交 中 需 要 大 量 起 始 mRNA的 缺 点 ， 并 可 以 同 时 提 高 基 因 克 隆 地 效 率 。 扣 除 技 术 的 进 一 步 成 熟 是 在 1996年 ， Gurskaya 等 (1996) 和 Diatchenko 等 (1996) 同时 发 表 了 关 于 扣 除 杂 交 的 改 进 方 法 ， 其 主 要 的 技 术 方 法 类 似 ， 这 个 技 术 叫 抑 制 性 扣除 杂 交 技 术 （ Suppression Subtractive Hybridization， SSH） 。 SSH的

20、 原 理 与 基 本 过 程原 理 ： SSH的 基 本 原 理 是 以 抑 制 PCR为 基 础 的 DNA扣 除 杂 交 方 法 。 所 谓 抑 制 PCR， 是利 用 链 内 退 火 优 于 链 间 退 火 ， 比 链 间 退 火 更 稳 定 ， 从 而 使 非 目 的 系 列 片 段 两 端 反 向 重 复系 列 在 退 火 时 产 生 类 似 于 “ 锅 柄 ” 的 结 构 ， 无 法 与 引 物 配 对 ， 选 择 性 地 抑 制 了 非 目 的 基因 片 段 的 扩 增 。 同 时 ， 该 方 法 运 用 了 杂 交 二 级 动 力 学 原 理 ， 即 丰 度 高 的 单 链 c

21、DNA在 退火 时 产 生 同 源 杂 交 的 速 度 要 快 于 丰 度 低 的 单 链 cDNA， 从 而 使 原 来 在 丰 度 上 有 差 别 的 单链 cDNA相 对 含 量 达 到 基 本 一 致 。基 本 过 程 ： 分 别 抽 提 代 测 样 本 (tester） 和 对 照 样 本 （ driver)的 mRNA， 反 转 录 成cDNA， 用 RsaI或 HaeIII酶 切 ， 以 产 生 大 小 适 当 的 平 头 末 端 cDNA片 段 ， 将 tester cDNA分成 均 等 的 两 份 ， 各 自 接 上 两 种 接 头 ， 与 过 量 的 driver cDNA

22、变 性 后 退 火 杂 交 ， 第 一 次 杂交 后 有 4种 产 物 ： a是 单 链 tester cDNA， b是 自 身 退 火 的 tester cDNA双 链 ， c是 tester 和diver的 异 源 双 链 ， d是 driver cDNA。 第 一 次 杂 交 的 目 的 是 实 现 tester单 链 cDNA均 一 化(normalization),即 使 原 来 有 丰 度 差 别 的 单 链 cDNA的 相 对 含 量 达 到 基 本 一 致 ， 由 于 tester cDNA中 与 driver cDNA序 列 相 似 的 片 段 大 都 和 driver形 成

23、 异 源 双 链 分 子 c， 使 tester cDNA中 的 差 异 表 达 基 因 的 目 标 cDNA得 到 大 量 富 集 ， 第 一 次 杂 交 后 ， 合 并 两 份 杂 交 产 物 ， 再加 上 新 的 变 性 driver单 链 ， 再 次 退 火 杂 交 ， 此 时 ， 只 有 第 一 次 杂 交 后 经 均 等 化 和 扣 除 的单 链 tester cDNA和 driver cDNA一 起 形 成 各 种 双 链 分 子 ， 这 次 杂 交 进 一 步 富 集 了 差 异 表达 基 因 的 cDNA， 产 生 了 一 种 新 的 双 链 分 子 e， 它 的 两 个 5

24、端 有 两 个 不 同 的 接 头 ， 正 由 于这 两 上 不 同 的 接 头 ， 使 其 在 以 后 的 PCR中 被 有 效 地 扩 增 。 二 、 序 列 测 定 及 数 据 分 析 测 序 方 向 的 选 择根 据 不 同 的 实 验 目 的 选 择 不 同 的 测 序 方 向 ： 5 端 5 上 游 非 翻 译 区 校 短 且 含 有 较 多 的 调 控 信 息 。 一 般 在 寻 找 新基 因 或 研 究 基 因 差 异 表 达 时 用 5 端 EST较 好 ， 大 部 分 EST计 划 都是 选 用 5 端 进 行 测 序 的 ， 而 且 从 5 端 测 序 有 利 于 将 E

25、ST拼 接 成较 长 的 基 因 序 列 。 3 端 3 端 mRNA有 一 20 200bp的 plyA结 构 ， 同 时 靠 近 plyA又 有 特 异性 的 非 编 码 区 ， 所 以 从 3 端 测 得 EST含 有 编 码 的 信 息 较 少 但 研究 也 表 明 ， 10 的 mRNA3 端 有 重 复 序 列 ， 这 可 以 作 为 SSR标 记 ；非 编 码 区 有 品 种 的 特 异 性 ， 可 以 作 为 STS标 记 两 端 测 序 获 得 更 全 面 的 信 息 。 1. 去 除 低 质 量 的 序 列 （ Phred）2. 应 用 BLAST、 RepeatMaske

26、r或 Crossmatch遮 蔽 数 据 组 中 不 属 于 表 达 的 基因 的 赝 象 序 列 (artifactual sequences)。 载 体 序 列 重 复 序 列 污 染 序 列 (如 核 糖 体 RNA、 细 菌 或 其 它 物 种 的 基 因 组 DNA等 )3. 去 除 其 中 的 镶 嵌 克 隆 。4. 最 后 去 除 长 度 小 于 100bp的 序 列 。序 列 前 处 理 (pre-processing) 镶 嵌 克 隆 的 识 别 Back-to-back poly(A)+ tails. Linker-to-linker in middle of the se

27、quence. Blastn/Blastx search. ESTs的 聚 类 和 拼 接 聚 类 的 目 的 就 是 将 来 自 同 一 个 基 因 或 同 一 个 转 录 本 的 具 有 重 叠 部 分 (overlapping)的 ESTs整 合 至 单 一 的 簇 (cluster)中 。聚 类 作 用 ：v 产 生 较 长 的 一 致 性 序 列 (consensus sequence) ， 用 于 注 释 。v 降 低 数 据 的 冗 余 ， 纠 正 错 误 数 据 。v 可 以 用 于 检 测 选 择 性 剪 切 。ESTs聚 类 的 数 据 库 主 要 有 三 个 ：v Uni

28、Gene ( )v TIGR Gene Indices ( )v STACK 不 严 格 的 和 严 格 的 聚 类 (loose and stringent clustering) loose clustering 产 生 的 一 致 性 序 列 比 较 长 表 达 基 因 ESTs数 据 的 覆 盖 率 高 含 有 同 一 基 因 不 同 的 转 录 形 式 ， 如 各 种 选 择 性 剪 接 体 每 一 类 中 可 能 包 含 旁 系 同 源 基 因 (paralogous expressed gene)的 转 录 本 序 列 的 保 真 度 低 stringent clustering

29、 产 生 的 一 致 性 序 列 比 较 短 表 达 基 因 ESTs数 据 的 覆 盖 率 低 因 此 所 含 有 的 同 一 基 因 的 不 同 转 录 形 式 少 序 列 保 真 度 高 有 参 照 的 和 无 参 照 的 聚 类 (Supervised and unsupervised clustering) Supervised clustering 根 据 已 知 的 参 考 序 列 (如 全 长 mRNA、 已 拼 接 好 的 一 致 性 序 列 ) 聚 类 。 Unsupervised clustering 没 有 根 据 参 考 序 列 进 行 分 类 。 聚 类 的 算 法

30、 基 于 BLAST和 FASTA的 脚 本 (BLASTN and FASTAbased scripts) BLASTN和 FASTA算 法 的 本 身 目 的 在 于 寻 找 序 列 间 的 局 部 相 似 性 或 同 源 性 ， 这 与 聚 类 的目 的 不 同 ， 即 通 过 两 个 序 列 是 否 具 有 一 致 性 的 重 叠 或 连 续 的 比 对 来 判 断 二 者 是 否 能 归 成 一 类 。结 合 BLAST和 FASTA查 找 的 结 果 ， 采 用 解 释 性 语 言 (如 Perl)编 写 的 脚 本 ， 具 备 了 3方 面 的 功 能 ，即 运 行 查 找 过

31、程 、 解 析 (Parsing)查 找 的 结 果 和 按 照 用 户 定 义 的 标 准 判 断 两 个 序 列 是 否 为 一 类 。 基 于 字 的 聚 类 (Wordbased clustering) 基 于 字 的 聚 类 省 略 了 所 有 的 比 对 过 程 ， 其 核 心 在 于 识 别 并 计 算 序 列 间 有 多 少 长 度 为 n的 字(word)能 够 匹 配 ， 而 且 并 未 采 用 有 关 克 隆 的 来 源 及 注 释 信 息 ， 代 表 性 的 算 法 是 d2_cluster。 该 算法 为 一 种 凝 聚 性 (agglomerative)的 聚 类

32、算 法 (即 每 一 类 从 单 一 的 序 列 开 始 ， 通 过 一 系 列 的 合 并 形成 最 后 的 类 )， 它 可 以 被 描 述 为 最 小 联 接 聚 类 (minimal linkage clustering)。 即 ， 假 设 两 条 序 列 A和 B， 如 果 二 者 存 在 一 定 水 平 的 相 似 ， 那 么 将 A、 B归 于 一 类 ； 即 便 二 者 并 没 有 任 何 相 似 性 ， 若存 在 序 列 C， 而 且 C同 时 与 A、 B都 有 足 够 的 相 似 性 ， 那 么 也 将 A、 B归 于 一 类 。 类 和 类 之 间 的 联 接 标 准

33、是 识 别 两 个 序 列 在 一 定 大 小 窗 口 中 相 同 的 碱 基 数 。 常 用 的 拼 接 软 件 Phrap (http:/www.genome.washington.edu/UWGC/analysistools/Phrap.cfm) CAP3(Xiaoqiu H uang ， ) d2_cluster (http:/www.sanbi.ac.za/) Cluster的 连 接利 用 cDNA克 隆 的 信 息 和 5,3端 Reads的 信 息 ， 不 同 的 Cluster可以 连 接 在 一 起 。 UniGene Unigene 结 合 有 指 导 的 和 无 指 导

34、 的 方 法 ， 而 且 在 聚 类 过 程 中 使 用 了 不 同 水平 的 严 格 度 ， 聚 类 的 算 法 为 megablast,数 据 库 不 产 生 一 致 性 序 列 。 TIGR Gene Index用 的 是 有 严 格 的 和 有 指 导 的 聚 类 方 法 ,聚 类 的 算 法 为类 似 于 BLAST和 FASTA的 FLAST， 该 法 得 到 的 一 致 性 序 列 较 短 ， 交 替 剪 切得 到 的 不 同 的 基 因 属 于 不 同 的 索 引 。 STACK STACK 用 不 严 格 的 和 无 指 导 的 聚 类 方 法 ， 聚 类 的 算 法 为 d

35、2_cluster,产 生较 长 的 一 致 性 序 列 ， 同 一 索 引 中 含 有 不 同 的 剪 切 方 法 得 到 的 基 因 。 Clean Short and Tight TIGR-THCUniGeneSTACK Long and Loose 基 因 注 释 及 功 能 分 类注 释 ： 序 列 联 配 Blastn， Blastx 蛋 白 质 功 能 域 搜 索 (二 结 构 比 对 ) Pfam Interpro 基 因 功 能 分 类 手 工 分 类 大 部 分 以 Adams 95年 的 文 章 中 的 采 用 分 类 体 系 为 标 准 。【 Adams. MD, et

36、 al. Initial assessment of human gene diversity and expression patterns based upon 83 million nucleotides of cDNA sequence. Nature. 1995 377(6547 Suppl):3-174 】 计 算 机 批 量 处 理 利 用 标 准 基 因 词 汇 体 系 Gene Ontology， 进 行 近 似 的 分 类 。 ( G O 的 组 织 结 构 ： 定 向 无 环 图 （ directed acyclic graphs DAGs） 各 大 数 据 库 中 基

37、因 或 基 因 产 物 与 G O 术 语 的 对 照 后 续 分 析 比 较 基 因 组 学 分 析 基 因 表 达 谱 分 析 新 基 因 研 究 基 因 可 变 剪 切 分 析 实 验 验 证 MicroArray GeneChip RTPCR Northen bloting 实例介绍家 猪 脑 组 织 EST分 析 文 库 信 息Library name cbe ece fce ecc fcc ebs fbsTissue Cerebellum Cortex cerebrum Brain stemDevelop-mental phase adult Foetus 50d Foetus 1

38、00d Foetus 50d Early born 107d Foetus 50d Newborn 115d 文 库 与 序 列 质 量 检 验聚 类 和 重 叠 群 分 析ORF的 寻 找功 能 分 类 和 注 释表 达 谱 分 析交 替 剪 接 分 析 分 析 过 程 序 列 长 度 和 质 量 处 理v序 列 长 度 ： 无 统 一 标 准 ， 一 般 认 为 100bp以 上 的 EST即 可 代 表 足 够 表 达 基 因 信 息v序 列 质 量 处 理污 染 序 列 去 除 ， 包 括 载 体 序 列 、 细 菌 基 因 组 序 列(Crossmatch)重 复 序 列 的 屏 蔽

39、 （ RepeatMasker)低 质 量 区 去 除 （ Q20）扔 掉 100bp以 下 的 序 列 序 列 长 度 和 质 量 分 布 0 100 200 300 400 500 600 700 800 9000 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Sequence Length Distribution Sequence Length(step=4) Seq uenc e Nu mbe r 15 20 25 30 35 40 45 500 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 Sequence Quality D

40、istribution Average Quality(step=1) Seq uenc e Nu mbe r v聚 类 和 重 叠 群 （ Contig)分 析High-quality ESTs 46011, Avg. full length: 388.5 , Avg. quality: 35.9 per base拼 接 软 件 高 质 量 序 列 contigs singletsPhrap 46011 5740 10763Cap3 46011 5176 13459 0 20 40 60 80 1000 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 Contig Size Lo g1 0 #

41、of Co nti g N um be r Contig Size Distribution Based on phrap assembly Contig 大 小 分 布 BLAST search result (based on phrap assembly， e=1e-10) 对 GenBank蛋 白 质 和 核 酸 库 BLAST结 果 33% 41% 26% hits vs nr hits vs nt &no hits vs nr no hits vs nt&nr 对 人 EST库 BLAST结 果 76% 24% hits no hits BLAST Search against h

42、uman genome sequence(e=1e-5) 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 Hs _1 Hs _2 Hs _3 Hs _4 Hs _5 Hs _6 Hs _7 Hs _8 Hs _9 Hs _1 0 Hs _1 1 Hs _1 2 Hs _1 3 Hs _1 4 Hs _1 5 Hs _1 6 Hs _1 7 Hs _1 8 Hs _1 9 Hs _2 0 Hs _2 1 Hs _2 2 Hs _X Hs _Y 对 人 类 染 色 体 blast结 果 功 能 分 类 和 注 释按 照 Gene Ontology（ 基 因 分 类 标 准 词 汇

43、 体 系 ） 的三 个 标 准 分 子 功 能 、 生 物 学 过 程 和 细 胞 组 分 对序 列 注 释 classification by molecular function 0 1 2 3 4 5log10 of ESTs number transporter activity translation regulator activitytranscription regulator activity structural molecule activity signal transducer activityprotein tagging activity obsolete mot

44、or activity enzyme regulator activitydefense/immunity protein activity chaperone activity cell adhesion molecule activitycatalytic activity binding apoptosis regulator activityantioxidant activity classification by biological process 0 1 2 3 4 5 log10 of ESTs number viral life cycle physiological pr

45、ocesses obsolete development cellular process biological_process unknown behavior 表 达 量 比 较 实 例Apoptosis inhibitor protein( TCTP abundance comparison) 0 10 20 30 40 50 # of ESTs cbe ece fce ecc fcc ebs fbs library name ESTs number of TCTP 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 percentage cbe ece fce ecc fcc ebs fbs library name ESTs percentage of TCTP