基因工程原理杨红final

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1、基 因 工 程 原 理Principle of Gene Engineering 杨 红 第 一 章第 一 节 基 因 工 程 原 理 Liaoning Normal UniversityLNNU 第 四 章 第 四 章 目 的 基 因 的 分 离 与 修 饰第 一 节 基 因 的 基 本 结 构 特 征第 二 节 基 因 组 文 库第 三 节 目 的 基 因 的 分 离 与 制 备第 四 节 基 因 突 变 与 修 饰 第 一 章第 一 节 基 因 工 程 原 理 一 个 能 转 录 、 翻 译 的 结 构 基 因 依 次 包 括 ：转 录 启 动 区核 糖 体 识 别 区 编 码 区转 录

2、 终 止 区 起 始 密 码 子 ATG开 放 阅 读 框终 止 密 码 子 （ TAG、TAA、 TGA） 第 一 节 基 因 的 基 本 结 构 特 征一 、 原 核 生 物 基 因 的 组 成 基 因 区启 动 区SD区转 录 终 止 子 和 终 止 因 子 原 核 生 物 基 因 启 动 区 的 结 构 乳 糖 操 纵 子 模 型 二 、 真 核 生 物 基 因 的 组 成 基 因 区转 录 启 动 区转 录 区 三 、 其 它 基 因 组 的 基 因 组 成编 码 区启 动 子终 止 子质 粒 基 因病 毒 （ 噬 菌 体 ） 基 因 ： 多 顺 反 子 、 重 叠 基 因 、 内

3、含 子线 粒 体 基 因 ： 多 顺 反 子叶 绿 体 基 因 ： 多 顺 反 子 四 、 基 因 的 排 列重 叠 基 因 ： 是 指 两 个 或 两 个 以 上 的 基 因 共 有 一 段 DNA序 列 ，或 是 指 一 段 DNA序 列 成 为 两 个 或 两 个 以 上 基 因 的 组 成 部 分 。 重 复 基 因 ： 重 复 基 因 指 染 色 体 上 存 在 多 数 拷 贝 基 因 ， 重 复 基因 往 往 是 生 命 活 动 最 基 本 ， 最 重 要 的 功 能 相 关 的 基 因 。加 倍 基 因基 因 重 排 ： 基 因 的 可 变 区 通 过 基 因 的 转 座 、 D

4、NA的 断 裂 错 接而 使 正 常 基 因 顺 序 发 生 改 变 的 现 象 。 尤 指 在 B细 胞 分 化 过 程中 抗 体 基 因 的 重 排 及 T细 胞 抗 原 受 体 基 因 的 重 排 ， 是 基 因 差别 表 达 的 一 种 调 控 方 式 。 第 二 节 基 因 组 文 库基 因 组 文 库 （ DNA文 库 ） ： 某 种 生 物 的 基 因 组 DNA通 过克 隆 载 体 储 存 在 一 个 受 体 菌 的 群 体 之 中 ， 这 个 群体 即 为 这 种 生 物 的 DNA文 库 。cDNA文 库 ： 某 种 生 物 基 因 组 转 录 的 部 分 或 全 部 mR

5、NA经 反 转 录 产 生 的 各 种 cDNA片 段 分 别 与 克 隆 载 体重 组 ， 贮 存 在 一 种 受 体 菌 群 体 中 ， 这 个 群 体 叫cDNA文 库 。 基 因 文 库 （ gene library) 某 种 生 物 的 全 部 遗 传 信 息 通 过 克 隆 载 体 储 存 在 一个 受 体 菌 的 群 体 之 中 ， 这 个 群 体 即 为 这 种 生 物 的 基 因文 库 。 1. 基 因 组 文 库 的 大 小 是 指 文 库 中 的 克 隆 子 数 量 。基 因 组 文 库 的克 隆 数 目 = 基 因 组 DNA总 长DNA插 入 片 段 的 平 均 长例

6、 如 ： 某 生 物 基 因 组 的 总 长 3 106kb， 酶 切 后 DNA平 均长 15kb， 则 其 基 因 组 文 库 的 克 隆 子 数 为 ： 3 10 6kb/ 15kb=2 105个 一 、 原 核 生 物 基 因 组 文 库 的 构 建 1976年 ， Clark等 提 出 估 算 克 隆 子 数 的 公 式 。N=ln（ 1-P） / ln（ 1-f） N： 基 因 组 文 库 必 需 的 克 隆 数 目 P： 文 库 中 目 的 基 因 出 现 的 概 率 （ 99%） f： 插 入 片 段 大 小 于 基 因 组 大 小 的 比 值例 如 上 面 例 子 ： N=l

7、n（ 1-0.99） / ln（ 1-15/ 3 10 6） = 9 105个为 了 保 证 基 因 组 文 库 具 有 代 表 性 ， 一 般 构 建 基 因 组 文 库 的 实 际 克隆 子 数 应 该 比 上 述 计 算 值 大 23倍 与 基 因 组 大 小 成 正 比 与 克 隆 的 DNA片 段 大 小 成 反 比 与 载 体 的 容 量 有 关 ：某 一 生 物 如 果 用 质 粒 作 载 体 需 要 900万 个 克 隆 ， 用 噬 菌 体 需 要 90万 个 克 隆 ， 用 cosmid作 载 体 需 要 35万 个 克 隆 。 2. 用 于 构 建 DNA文 库 的 克 隆

8、 载 体 EMBL系 列 、 DASH、 2001等优 点 ： 载 体 双 臂 DNA序 列 已 经 确 定 有 易 于 筛 选 的 遗 传 标 记 EMBL和 2001有 Spi-标 记 易 于 从 重 组 噬 菌 体 中 回 收 插 入 的 外 源 片 段 。 （ 1） 制 备 基 因 组 DNA并 片 段 化3. 构 建 基 因 组 文 库 的 基 本 步 骤提 取 总 基 因 组 DNA切 割 ： 机 械 方 法 、 RE法 、 识 别 序 列 4位 点回 收 ： 电 泳 、 梯 度 离 心 （ 2） DNA片 段 与 载 体 重 组 连 接 + 4. 原 核 生 物 基 因 组 文

9、库 的 构 建 二 、 真 核 生 物 基 因 组 文 库 的 构 建1. 构 建 噬 菌 体 基 因 组 文 库 2. 用 Cosmid构 建 基 因 组 文 库 3. 构 建 酵 母 人 工 染 色 体 基 因 组 文 库 三 、 cDNA基 因 文 库 的 构 建从 基 因 组 分 离 基 因 难 度 大 ： 基 因 以 单 拷 贝 形 式 存 在 ， 占 染 色 体 DNA的10-510 7； 真 核 染 色 体 DNA大 ， 难 定 位 基 因 ； 真 核 生 物 基 因 有 内 含 子 ， 在 原 核 细 胞 表 达时 没 有 加 工 功 能 。 1. cDNA文 库 的 概 念某

10、 种 生 物 基 因 组 转 录 的 部 分 或 全 部 mRNA经 反 转 录 产生 的 各 种 cDNA片 段 分 别 与 克 隆 载 体 重 组 ， 贮 存 在 一 种受 体 菌 群 体 中 ， 这 个 群 体 叫 cDNA文 库 。 表 达 型 cDNA文 库 ： 直 接 检 测 表 达 产 物 -蛋 白 质 ， 筛 选重 组 克 隆 ， 不 知 道 目 的 基 因 序 列 和 蛋 白 氨 基 酸 序 列 。 非 表 达 型 cDNA文 库 ： 已 知 目 的 基 因 序 列 或 蛋 白 氨 基酸 序 列 ， 可 以 通 过 杂 交 筛 选 。 2. cDNA文 库 的 构 建（ 1）

11、 分 离 细 胞 总 RNA， 并 从 总 RNA中 分 离 纯 化 出 mRNA 总 RNA包 括 ： rRNA（ 80-85%）tRNA（ 10-15%）mRNA（ 1-5%总 RNA的 提 取 ： 与 DNA的 提 取 相 似 。沉 淀 细 胞 裂 解 细 胞 离 心 去 残 渣 上 清 液 除 蛋白 沉 淀 RNA。 mRNA的 纯 化 Poly（ A） RNA的 分 离 柱 层 析 Oligo（ dT） mRNA分 级 ： 梯 度 离 心 ， 电 泳 ， mRNA转 译 活 性 鉴 定无 细 胞 体 系 （ 兔 网 织 红 细 胞 裂 解 物 ）蛙 卵 系 统 （ 非 洲 爪 蟾 卵

12、 母 细 胞 系 统 ） Oligo（ dT） 引 导 的 cDNA合 成mRNA-cDNA （ 2） 以 mRNA分 子 为 模 版 ， 合 成 cDNA第 一 链 （ 3） 双 链 cDNA的 合 成 AAAAAAAAAAAAAAA 大 肠 杆 菌 RNaseH媒介 取 代 法 Oligo（ dG） 寡 聚引 物 引 导 法 合 成 双 链DNA PCR法 RNADNA （ 4） 将 合 成 的 双 链 cDNA重 组 到 质 粒 或 噬 菌 体 载 体 上 ， 导入 大 肠 杆 菌 增 殖 以 质 粒 为 载 体 构 建 cDNA文 库 ： 重 组 子 鉴 定 、文 库 扩 增 方 便

13、。 克 隆 效 率低 。 以 质 粒 为 载 体 构 建 cDNA文 库末 端 转 移 酶dGTP 以 噬 菌 体 为 载 体 构 建 cDNA文 库 克 隆 效 率 高 ， 重 组 子 鉴 定 、 文 库 扩 增 繁 琐 。 mRNA丰 度 与 cDNA文 库 大 小 的 关 系 cDNA文 库 大 小 的 理 论 估 算 ：文 库 中 cDNA的克 隆 数 细 胞 总 mRNA数细 胞 中 某 种 mRNA的 拷贝 数=例 如 ： 细 胞 总 mRNA数 为 500500个 ，丰 度 为 3500拷 贝 /细 胞 的 基 因 ， 其 cDNA文 库 应 为 ：500500/3500=143

14、个 克 隆 ；丰 度 为 14拷 贝 /细 胞 的 基 因 ， 其 cDNA文 库 应 为 ：500500/14=35750个 克 隆 ； N： cDNA基 因 组 文 库 必 需 的 克 隆 数 目P： 文 库 中 目 的 基 因 出 现 的 概 率 （ 99%）f： mRNA丰 度 与 总 mRNA比 值 实 际 cDNA基 因 文 库 大 小 ：N=ln（ 1-P） / ln（ 1-f）例 如 ， 丰 度 3500时 ， N是 650个 。N=ln（ 1-0.99） / ln（ 1-3500/ 500500） = 650个 4. cDNA克 隆 的 优 越 性 cDNA克 隆 适 合 R

15、NA病 毒 的 研 究 cDNA文 库 的 筛 选 比 较 简 单 易 行 目 的 基 因 筛 选 的 假 阳 性 率 低 可 以 克 隆 在 细 菌 中 表 达 的 基 因 用 于 mRNA的 结 构 和 功 能 的 研 究 第 三 节 目 的 基 因 的 分 离 与 制 备 基 因 文 库 分 离 法 PCR扩 增 法 差 式 分 析 法 DNA插 入 诱 变 法 基 因 定 位 克 隆 标 签 测 序 法 化 学 合 成 法 一 、 从 基 因 文 库 中 筛 选 分 离 目 的 基 因1. 制 备 核 酸 探 针 进 行 杂 交 筛 选 制 备 猜 测 体 探 针 ： 根 据 已 知

16、氨 基 酸 顺 序 人 工 合 成 探 针 。 探 针 的 特 异 性 ： 长 度 不 小 于 17-20bp（ 6个 以 上连 续 氨 基 酸 顺 序 ） 遗 传 密 码 的 简 并 性 ： 一 组 探 针 ， 导 致 假 阳 性 。 与 cDNA文 库 杂 交事 实 上 的 DNA序 列 将 已 知 蛋 白 作 为 抗 原 ， 从 cDNA表 达 文 库 中 筛 选 。 cDNA应 克 隆 在 表 达 载 体 中 一 般 以 融 合 形 式 表 达 目 的 基 因 考 虑 cDNA表 达 的 方 向 性 Western blotting方 法2. 制 备 抗 体 进 行 免 疫 杂 交 筛

17、 选 disulfide bridges抗 原 -抗 体 免 疫 反 应 必 须 在 特 异 性 蛋 白 纯 化 后 应 用 某 些 基 因 的 表 达 量 很 少 ， 难 以 纯 化 有 些 基 因 没 有 蛋 白 产 物 不 同 发 育 阶 段 、 不 同 环 境 下 蛋 白 不 同 遗 传 密 码 简 并 性 导 致 正 确 探 针 的 难 度 。 利 用 被 克 隆 DNA片 段 与 寄 主 细 胞 染 色 体 DNA在功 能 上 的 同 源 互 补 性 筛 选 目 的 基 因 。例 如 ： 大 肠 杆 菌 His缺 陷 型 寄 主 细 胞 ， 原 因 之 一 是 吲哆 甘 油 磷 酸

18、 脱 氢 酶 基 因 突 变 。 利 用 这 特 点 ， 筛 选面 包 酵 母 吲 哆 甘 油 磷 酸 脱 氢 酶 基 因 。3. 功 能 互 补 法 克 隆 基 因 His-His-： 大 肠 杆 菌 His-菌 株 不 能 生 长 某 cDNA文 库的 cDNA片 段导 入 大 肠 杆 菌 His-菌 株说 明 产 生 His的 酶 的 基 因 重组 进 大 肠 杆 菌 His-菌 株 中 4. 利 用 PCR技 术 筛 选 基 因 文 库 5. 利 用 噬 菌 体 表 面 显 示 技 术 分 离 目 的 cDNA克 隆噬 菌 体 表 面 显 示 技 术 ： 也 称 噬 菌 体 展 示 技

19、 术 ， 将 外 源 蛋 白 质或 多 肽 的 基 因 插 入 到 丝 状 噬 菌 体 外 壳 蛋 白 质 基 因 的 信 号 肽 后 ，与 噬 菌 体 外 壳 蛋 白 融 合 表 达 ， 展 示 在 噬 菌 体 颗 粒 的 表 面 ， 借助 于 固 体 基 质 上 附 着 的 抗 体 、 受 体 等 分 子 与 靶 分 子 的 亲 和 力 ，筛 选 目 的 蛋 白 。 是 研 究 蛋 白 质 相 互 作 用 的 一 种 重 要 方 法 。 . 利 用 酵 母 双 杂 合 系 统 分 离 目 的 cDNA克 隆酵 母 双 杂 交 技 术 原 理 利 用 转 录 激 活 因 子 GAL4的 特

20、性 而 建 立 的 。GAL4 GAL4由 两 个 结 构 域 组 成 ：N端 的 DNA结 合 域 (DB) C端 的 转 录 激 活 域 (AD) 酵 母 双 杂 交 技 术 研 究 蛋 白 质 之 间 的 相 互 作 用是 细 胞 内 实 验 ， 即 不 需 提 纯 蛋 白 便 可 研 究 蛋 白 的相 互 作 用 ， 消 除 了 提 纯 过 程 引 起 的 蛋 白 变 性 ， 因而 研 究 的 是 有 生 物 活 性 的 蛋 白 与 蛋 白 之 间 的 相 互作 用 ， 反 映 了 体 内 的 真 实 作 用 情 况 。 大 规 模 酵 母 双 杂 交 技 术 的 局 限 性酵 母 双

21、 杂 交 筛 系 统 虽 因 其 优 点 而 广 泛 用 于 研 究 蛋 白 质 相 互 作用 ， 但 也 有 其 自 身 固 有 的 缺 点 ， 如 实 验 设 计 、 结 果 处 理 和 分析 时 都 要 考 虑 的 假 阳 性 和 假 阴 性 问 题 。假 阴 性 产 生 的 原 因 细 胞 定 位 特 性 出 现 假 阴 性 结 果 ： 分 泌 蛋 白 难 以 检 测 ； 蛋 白 未 能 正 确 修 饰 和 折 叠 ； 有 的 蛋 白 对 酵 母 菌 株 有 毒 性 或 抑 制 菌 株 生 长 BD-X的 自 激 活 作 用 ； 一 些 AD-Y融 合 蛋 白 中 的 Y可 能 结 合

22、 BD或 启 动 子 附 近 序 列或 蛋 白 ， 并 能 激 活 转 录 ； BD-X与 AD-Y并 非 通 过 BD-X Y-AD直 接 激 活 转 录 ， 而 是通 过 第 3种 蛋 白 或 多 蛋 白 的 复 合 体 把 X、 Y募 集 到 一 起 ，然 后 激 活 转 录 ； 非 特 异 BD-X Y-AD相 互 作 用 ， 因 为 有 的 蛋 白 表 面 具 有 成簇 的 疏 水 氨 基 酸 或 其 它 可 引 起 X、 Y非 特 异 作 用 的 结 构 ；假 阳 性 产 生 的 原 因 二 、 利 用 聚 合 酶 链 式 反 应 (PCR)技 术 扩 增 目 的 基 因PCR技

23、术 的 基 本 原 理 ： 1. 套 式 PCR技 术 (nested PCR)巢 式 PCR（ nested PCR） ，是 指 利 用 两 套 PCR引 物（ 巢 式 引 物 ） 对 进 行 两轮 PCR扩 增 反 应 。 在 第一 轮 扩 增 中 ， 外 引 物 用以 产 生 扩 增 产 物 ， 此 产物 在 内 引 物 的 存 在 下 进行 第 二 轮 扩 增 。 2. 反 向 PCR技 术 (inverse PCR)未 知 序 列 已 知 序 列 3. 锚 定 PCR (anchored PCR)RACE: rapid amplification of cDNA,是 以 mRNA为

24、模 板 ,逆 转 录 合 成 cDNA的 第 一 条 链 ,然 后 用 PCR技 术 扩 增 出 从 某 个 特 定 为 点 到 3和 5端 之 间 的 未 知 核 苷 酸 序 列 ,对 应 成 为3RACE和 5RACE. Oligo(dT) n 锚 定 引 物 4. 不 对 称 PCR (asymmetric PCR)5. 长 程 PCR(long and accurated PCR, LA PCR)6. 逆 转 录 PCR(RT-PCR)7. Alu PCR 三 、 利 用 差 式 分 析 法 分 离目 的 基 因 克 隆1. mRNA 差 别 显 示 技 术 （ DD-PCR）mRNA

25、 差 别 显 示 技 术的 原 理 和 基 本 程 序 . 代 表 性 差 别 分 析 技 术（ ） 传 统 的 减 法 杂 交 技 术从 表 达 目 的 基 因 的 组 织 中 提 取 mRNA并 反 转 录 成cDNA， 与 无 目 的 基 因 表 达 的 组 织 中 提 取 的 mRNA杂 交 形 成 cDNA-mRNA双 链 分 子 ， 通 过 层 析 去 掉 杂交 分 子 后 ， 留 下 的 单 链 cDNA中 含 有 目 的 基 因 。 逆 转 录 无 目 的 基 因 表 达 的 组 织中 提 取 的 mRNA表 达 目 的 基 因 组 织 中 提取 的 mRNA （ ） 基 因

26、组 DNA的 代表 性 差 别 分 析 技 术 检 测 DNA 驱 赶 DNA （ ） cDNA RDA 抑 制 性 减 法 杂 交 技 术 （ SSH） 四 、 DNA插 入 诱 变 分 离 目 的 基 因1. 转 座 子 标 签 法 . T-DNA标 签 法 五 、 应 用 基 因 定 位 克 隆 技 术 分 离 筛 选 目 的 基 因1. 基 因 定 位 克 隆 的 基 本 步 骤 . 染 色 体 步 查 法 分 离 目 的 基 因 （ chromosome walking） 六 、 标 签 测 序 法 分 离 目 的 基 因1. 表 达 序 列 标 签 法 （ EST）是 指 基 因

27、序 列 中 一 段 能 特 异 地 标 记 或 表 征 基 因 的 序 列 ， 通 常 它 含有 足 够 的 结 构 信 息 以 显 示 出 该 基 因 与 其 它 基 因 的 差 异 ， 长 度 为 100-500bp。 . 基 因 表 达 序 列 分 析 法 （ SAGE） ： （ 1） 从 转 录 物 某 一 特 定 位 置 上 分 离 得到 一 段 9-10kb的 寡 核 苷 酸 引 物 ， 该 引 物 含 有 确 定 一 个 独 特 转 录 物 的 足 够 信 息 ， 可 以 代 表此 转 录 物 的 特 异 性 ； （ 2） 多 个 序 列 标 签 能 以 锚 定 酶 识 别 为

28、点 序 列 相 隔 连 成 双 标 签 序 列的 多 联 体 。 生 物 素 -oligo(dT) 七 、 基 因 的 酶 法 合 成 第 四 节 基 因 的 突 变 与 修 饰一 、 随 机 诱 变1. 盒 式 诱 变 （ cassette mutagenesis） 2. 化 学 诱 变 . 易 错 PCR诱 变 （ error-prone PCR）Taq DNA聚 合 酶提 高 MgCl2浓 度化 学 诱 变 剂 ： 亚 硝 酸 、 羟 氨 、 肼 、 甲 酸 、 亚 硫 酸 氢 盐 . 嵌 套 缺 失 诱 变 二 、 定 位 诱 变 . PCR介 导 的 定 点 诱 变（ ） 重 叠 延 伸 PCR法 （ overlap extension PCR, OE PCR） （ 2） 大 引 物 PCR法 （ mega primer PCR） （ 3） 快 速 定 点 突 变 法 . 寡 核 苷 酸 介 导 的 诱 变 三 、 DNA改 组 技 术 DNA改 组 技 术 （ DNA shuffling） 的 基 本 原 理2 DNA改 组 技 术 的 发 展