临床微生物学检验：实验5

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1、临床微生物学检验临床微生物学检验第五个实验周第五个实验周目的要求目的要求1.1.掌握掌握下呼吸道标本下呼吸道标本的分离培养及检测方法的分离培养及检测方法2.2.掌握的掌握的铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌形态染色、培养特性、菌落特形态染色、培养特性、菌落特征和鉴定方法征和鉴定方法3.3.掌握掌握流感、副流感嗜血杆菌流感、副流感嗜血杆菌形态染色、培养特性、形态染色、培养特性、菌落特征和鉴定方法菌落特征和鉴定方法 菌种试剂菌种试剂菌种：流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、金黄色葡菌菌种：流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、金黄色葡菌 球菌球菌标本：模拟痰标本标本：模拟痰标本 主要试剂：主要试剂：X X、V V、X X

2、V V因子纸片，氧化酶试剂，因子纸片，氧化酶试剂，革兰染色液革兰染色液 不发酵细菌微量生化编码管不发酵细菌微量生化编码管 第一天实验内容第一天实验内容1.1.模拟痰标本模拟痰标本 分离培养：接种（分离培养：接种（1 1个大血平个大血平/人人+1+1个个Mac/Mac/人人+1+1个巧克力个巧克力/人）人）涂片干燥固定后革兰染色涂片干燥固定后革兰染色2.2.流感嗜血杆菌或副流感嗜血杆菌：流感嗜血杆菌或副流感嗜血杆菌：菌落观察、涂片干燥固定后革兰染色菌落观察、涂片干燥固定后革兰染色 卫星试验（卫星试验（1个小血平板个小血平板/人）人）因子试验（因子试验（MH平板平板 1个个/人）人）转种巧克力平板

3、（转种巧克力平板（2 2个个/组）组）痰液及上呼吸道标本痰液及上呼吸道标本 肉眼观察肉眼观察 培养前处理培养前处理 直接涂片检查直接涂片检查 血平板、血平板、MacMac 特殊细菌培养特殊细菌培养 初报初报 巧克力平板巧克力平板 选择适当培养基和条件选择适当培养基和条件 菌落观察菌落观察 分离鉴定分离鉴定 涂片涂片 纯培养纯培养 生化鉴定生化鉴定 药敏药敏 最终报告最终报告 合格痰标本合格痰标本：白细胞：白细胞25/25/低倍视野，鳞状上低倍视野，鳞状上皮细胞皮细胞10/10/低倍视野低倍视野洗痰、胰酶均质化洗痰、胰酶均质化嗜血杆菌属嗜血杆菌属形态：形态：G-b 细小细小 呈球杆状呈球杆状 短

4、丝状或多形态短丝状或多形态 培养：培养：5-10%CO2 营养要求高营养要求高 生长需生长需X或或V因子因子 巧克力平板巧克力平板菌落菌落:直径直径0.5-1.5mm、圆形、光滑、湿润、圆形、光滑、湿润、无色或灰白色半透明小菌落无色或灰白色半透明小菌落革兰阴性短小球杆菌（有多形性）革兰阴性短小球杆菌（有多形性）副流感嗜血杆菌革兰染色结果副流感嗜血杆菌革兰染色结果培养基：巧克力平板培养基：巧克力平板 血液中含有血液中含有X、V因子，因子，V因子处于抑制状态，因子处于抑制状态，加加热热80-90 10-15min可破坏可破坏V因子的抑制物使因子的抑制物使V因因子发挥作用。子发挥作用。巧克力琼脂中加

5、入抗生素可提高检出率巧克力琼脂中加入抗生素可提高检出率 菌落特征菌落特征:巧克力平板上巧克力平板上无色或灰白色半透明小菌落无色或灰白色半透明小菌落卫星试验卫星试验：金葡菌能合成释放：金葡菌能合成释放V因子，在金葡菌菌落因子，在金葡菌菌落 周围，流感嗜血杆菌菌落较大，远离则小周围，流感嗜血杆菌菌落较大，远离则小因子试验因子试验：MH平板上贴上平板上贴上X、V、XV因子纸片，因子纸片，不同嗜血杆菌会在所需因子纸片周围生长不同嗜血杆菌会在所需因子纸片周围生长副流感嗜血杆菌副流感嗜血杆菌流感流感嗜血嗜血杆菌杆菌卫星试验（血平板）卫星试验（血平板）金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌（划线或点种）（划线或点种）

6、流感嗜血杆菌（密流感嗜血杆菌（密集涂布于平板上）集涂布于平板上）卫星试验阳性结果卫星试验阳性结果 嗜血杆菌（嗜血杆菌（密密集涂布于平板上）集涂布于平板上）X XV VV VX X因子试验（因子试验（MH平板）平板）操作方法、注意事项操作方法、注意事项XV生长，生长，V生长生长因子试验结果因子试验结果第一天实验内容第一天实验内容1.1.模拟痰标本模拟痰标本 分离培养：接种（分离培养：接种（1 1个大血平个大血平/人人+1+1个个Mac/Mac/人人+1+1个巧克力个巧克力/人）人）涂片干燥固定革兰染色涂片干燥固定革兰染色2.2.流感嗜血杆菌或副流感嗜血杆菌：流感嗜血杆菌或副流感嗜血杆菌：巧克力平

7、板上菌落观察、涂片干燥固定革兰染色巧克力平板上菌落观察、涂片干燥固定革兰染色 卫星试验（卫星试验（1个小血平板个小血平板/人）人）因子试验（因子试验（1个个MH平板平板/人）人）转种巧克力平板（转种巧克力平板（2 2个个/组）组）部分接种流感，部部分接种流感，部分接种副流感分接种副流感一个接种流感嗜血杆菌，一个接种流感嗜血杆菌，一个接种副流感一个接种副流感金葡点种或划线金葡点种或划线第二天实验内容第二天实验内容1.嗜血杆菌：观察分区划线结果，观察菌落特点嗜血杆菌：观察分区划线结果，观察菌落特点 卫星现象结果观察卫星现象结果观察 因子试验结果观察因子试验结果观察2.痰标本：痰标本：血平板血平板菌

8、落观察和革兰染色、菌落观察和革兰染色、氧化酶试验。氧化酶试验。麦康凯和巧克力平板上菌落观察。麦康凯和巧克力平板上菌落观察。3.取取Mac上浅粉红色的菌落上浅粉红色的菌落接种相应的微量生化编码接种相应的微量生化编码系统（非发酵菌微量生化编码系统）。系统（非发酵菌微量生化编码系统）。（上述实验每人均做）（上述实验每人均做）流感嗜血杆菌培养流感嗜血杆菌培养24h菌落菌落菌落菌落:直径直径0.5-1.5mm、圆形、光滑、湿润、圆形、光滑、湿润、无色或灰白色半透明小菌落无色或灰白色半透明小菌落流感嗜血杆菌培养流感嗜血杆菌培养48h菌落菌落同学分离的流感嗜血杆菌菌落流感嗜血杆菌卫星试验阳性结果流感嗜血杆菌

9、卫星试验阳性结果流感嗜血杆菌和副流感嗜血杆菌卫星流感嗜血杆菌和副流感嗜血杆菌卫星现象结果（二者卫星现象均阳性，上现象结果（二者卫星现象均阳性，上面面“+”，下面，下面“-”）溶血嗜血杆菌的卫星试验阳性溶血嗜血杆菌的卫星试验阳性流感嗜血杆菌卫星试验阳性流感嗜血杆菌卫星试验阳性某同学做的“卫星试验”副流感嗜血杆菌因子试验结果副流感嗜血杆菌因子试验结果流感嗜血杆菌因子试验结果流感嗜血杆菌因子试验结果X+V因子周围因子周围生长生长流感嗜血杆菌因子试验结果流感嗜血杆菌因子试验结果X+V因子因子周围生长周围生长溶血嗜血杆菌因子试验结果溶血嗜血杆菌因子试验结果 X X因子因子 V V因子因子 溶血溶血流感嗜

10、血杆菌流感嗜血杆菌 +-+-副流感嗜血杆菌副流感嗜血杆菌 -+-+-X X因子因子 V V因子因子 溶血溶血 流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌 +-溶血嗜血杆菌溶血嗜血杆菌 +副流感嗜血杆菌副流感嗜血杆菌 -+-副嗜沫嗜血杆菌副嗜沫嗜血杆菌 -+-副溶血嗜血杆菌副溶血嗜血杆菌 -+杜克雷嗜血杆菌杜克雷嗜血杆菌 +-嗜沫嗜血杆菌嗜沫嗜血杆菌 -几种嗜血杆菌对生长因子需求几种嗜血杆菌对生长因子需求痰培养平板上致病菌的痰培养平板上致病菌的初步判断初步判断原则：需要结合“痰标本涂片、培养及临床表现”才能判断培养出来的细菌是定植还是致病菌患者的血象、体温、胸痛和肺部啰音等体现感染的临床表现。痰涂片镜检见大量白细

11、胞吞噬细菌痰涂片见到的细菌培养大量生长（占所分出细菌的50%以上）绿色色素、金属光泽、特殊气味、绿色色素、金属光泽、特殊气味、-溶血环溶血环血平板麦康凯平板巧克力平板巧克力平板：巧克力平板：菌落圆形、大小不一、边缘不整、菌落圆形、大小不一、边缘不整、扁平、湿润、常呈融合态，扁平、湿润、常呈融合态，特殊气味特殊气味、色、色 素不易观察到。素不易观察到。血平：血平：类似巧克力琼脂上菌落，类似巧克力琼脂上菌落，绿色色素绿色色素、特殊特殊气味气味，有金属光泽有金属光泽、有、有溶血溶血。铜绿假单胞菌菌落形态铜绿假单胞菌菌落形态革兰染色革兰染色铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌G-b、菌体、菌体长短不一长短不一、球

12、杆状或长球杆状或长丝状丝状 可疑菌落（痰培养中优势菌）可疑菌落（痰培养中优势菌）涂片革兰染色涂片革兰染色革兰阴性杆菌革兰阴性杆菌 氧化酶氧化酶(+)非发酵菌鉴定系统鉴定到种非发酵菌鉴定系统鉴定到种 非发酵菌微量生化鉴定系统非发酵菌微量生化鉴定系统第三天实验内容第三天实验内容1.不发酵菌微量编码系统结果判断不发酵菌微量编码系统结果判断2.痰标本鉴定结果报告痰标本鉴定结果报告非发酵菌微量生化鉴定系统非发酵菌微量生化鉴定系统 DNADNA酶试验酶试验原理：甲基绿与长链原理：甲基绿与长链DNADNA结合呈绿色，而短链的寡核苷酸结合呈绿色，而短链的寡核苷酸不与甲基绿结合，呈灰白色。不与甲基绿结合，呈灰白

13、色。精氨酸双水解酶试验精氨酸双水解酶试验（在非发酵菌鉴定中不加石蜡油）（在非发酵菌鉴定中不加石蜡油）原理：精氨酸经两次水解后原理：精氨酸经两次水解后,生成鸟氨酸、氨及二氧化碳。生成鸟氨酸、氨及二氧化碳。鸟氨酸又在脱羧酶的作用下生成腐胺。鸟氨酸又在脱羧酶的作用下生成腐胺。氨及腐胺氨及腐胺均为均为碱性碱性物物质，故可使培养基变碱，用指示剂指示出来质，故可使培养基变碱，用指示剂指示出来。乙酰胺利用试验乙酰胺利用试验 原理：许多非发酵菌产生一种脱酰胺酶，可使乙酰胺经脱原理：许多非发酵菌产生一种脱酰胺酶，可使乙酰胺经脱酰胺作用释放酰胺作用释放氨，使培养基变碱氨，使培养基变碱。非发酵菌微量编码系统结果判断非发酵菌微量编码系统结果判断枸 橼 酸 盐麦 芽 糖精 氨 酸 甘 露 醇木 糖乙 酰 胺D N A硝 酸 盐葡萄糖(厌氧)葡萄糖(需氧)氧 化 酶 I II III IV 2 1 4 2 1 4 2 1 4 2 1 014204214011675