冠心病患者肺炎衣原体包涵体的检测和意义

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1、冠心病患者肺炎衣原体包涵体的检测和意义 作者：蔡俊明 许香广, 张国良,李涛【摘要】 目的：探讨冠心病(CHD)患者血液肺炎衣原体(Cpn)包涵体的检测和临床意义。方法：收集2006年CHD患者150例和同期体检正常者55例的血液标本，采用-85 冰冻保存的外周抗凝血液，低渗溶血制备淋巴细胞悬液，用直接免疫荧光法(DIF)检测特异性Cpn包涵体。结果：冠心病组150例，包涵体阳性20例，阳性率为13.3%;健康对照组55例，包涵体阳性1例，阳性率为1.8%，差异有统计学意义(P<0.001)，相对危险度为8.3，95%的可信区间为1.0963.46。结论：CHD患者Cpn包涵体阳性率高于

2、健康者，说明CHD患者存在Cpn感染状况。 【关键词】 肺炎衣原体包涵体;冰冻外周抗凝血;直接免疫荧光法;冠心病 Detection of Chlamydia pneumoniae inclusion body in patients with coronary heart diseaseCAI Junming1 , XU Xiangguang1, ZHANG Guoliang2, LI Tao2(1.Pingshan People Hospital in Shenzhen City; 2.Futian People Hospital in Shenzhen City Shenzhen 518

3、118, China)(Cpn) inclusion body detection in peripheral blood mononuclear cell (PBMC) of patients with coronary heart disease (CHD). Methods: The anticoagulant peripheral blood of CHD patients were preserved at -85 . and lymphocyte suspension were prepared with hypoosmotic hemolysis. Cpn inclusion b

4、ody was detected by direct immunofluorescence (DIF).Results: Cpn inclusion bodies was detected in 20 (13.3%) of 150 patients with CHD and in 1(1.8%)of 55 in healthy control group. The positive rate of inclusion bodies in CHD group was significant higher than those in control group (P<0.001).Concl

5、usion: Patients with CHD have higher showing evidence for the presence of Cpn inclusion bodies and was infectingKEY WORDS Chlamydia pneumoniae inclusion body; Anticoagulation peripheral blood; Direct immunofluorescence; Coronary heart disease冠心病(CHD)已成为危害人类健康、致残和死亡的第1位原因，CHD 已知有很多危险因子，如：动脉硬化、高血压、高血脂

6、、高血糖、肥胖、吸烟和家族遗传史等。但也有发现近半数CHD人群并没有明确的危险因子。近年来人们把视线转向了某些致病微生物的致炎症作用，其中肺炎衣原体(chlamydia pneumomae， Cpn)研究和报道较多，基于在冠脉的斑块培养中有活性的Cpn存在，从而引起了人们对CHD与Cpn的相互病理关系的怀疑。目前，检测Cpn感染的实验方法很多，通常有分离培养法、免疫荧光法、酶免标记法、免疫组化法和多聚酶链反应法。这些方法各有特殊点和优缺点。检测结果只能说明Cpn的既往感染，而无法鉴定Cpn活的致病因子的存在，Cpn的生活周期有：原体(elementary body， EB)、中间体及网状体(r

7、eticulate body， RB)。只有原体EB才有侵袭宿主的能力，故如果机体有EB存在，说明有Cpn感染的存在。我们对CHD患者使用早期-85 保存的抗凝外周血，经低渗溶血制备淋巴细胞悬液后，用直接免疫荧光法(DIF)检测特异性的Cpn包涵体(inclusion body)，获得较满意的结果，报道如下。1 资料与方法1.1 临床资料收集2006年住院的CHD患者120例，年龄4080岁，查找所有患者病案，经临床症状判断、心电图检查、心肌酶检测，部分患者经冠脉造影DSA证实为CHD，符合WHO诊断标准。健康对照组为同期体检正常者，经询问排除心血管、肺部感染、自身免疫等疾病者。1.2 标本与

8、主要试剂、仪器血液标本为-85 冷冻管保存的EDTA抗凝，从冰箱里提取。主要试剂、仪器：(1)IMAGEN衣原体检测盒，鼠抗人FITC免疫荧光标记单克隆抗体，DAKO，丹麦。(2)硅化玻璃片，中山医科大学试剂中心。(3)荧光显微镜 Axioskop-2mot, Zeiss ，德国。(4)Mounting fluid。1.3 制备方法(1)-85 低温冰冻保存的EDTA抗凝外周血，常温解冻，DDW低渗处理约10 min，Hanks平衡盐溶液等渗，HBSS配制成的约1068/mL细胞浓度。在已格式化的硅化玻片上，滴30 mL细胞液，离心涂片，室温干燥，甲醇固定。(2)在细胞玻片上，均匀涂布25 m

9、L鼠抗人荧光标记单克隆抗体(FITC),37 室温保存30 min，PBS冲洗3次。加1滴Mounting fluid。封片后在荧光显微镜下观察。 1.4 判断标准1.4.1 阳性质控片 在荧光显微镜下可见到Cpn-cwl-029感染的HEP-2细胞，经DIF染色后，细胞浆见有被FITC荧光标记的鼠单克隆抗体结合成呈亮绿色荧光块状物。细胞核被Evans blue染成红色，此为Cpn包涵体。阴性细胞无上述荧光染色存在。1.4.2 标本检测片 至少计数200个的PBMC，其中有1个或以上的细胞里有特征性的亮苹果绿色荧光染色块，呈大小不等，染色特异，亮度均匀，位于细胞偏侧，有清晰包膜者视为待定阳性;

10、再在普通光学显微镜下，确认同一位置染色斑块在淋巴细胞内便为确证阳性细胞。细胞浆里没有出现上述苹果绿色荧光或光学显微镜下亮苹果绿色块状物在位于细胞外者均视为Cpn包涵体阴性细胞。1.5 统计学处理所有数据用PEMS3.1软件包进行统计学处理，计数资料采用2检验，P<0.05为差异有统计学意义。2 结果CHD组150例，检测到Cpn包涵体阳性20例，阳性率为13.3%。健康对照组55例中有1例阳性，阳性率为1.8%。两组差异有统计学意义(P<0.001)，相对危险度8.3。95%可信区间为1.6963.46。3 讨论Cpn是1989年1继衣原体属下的沙眼衣原体种、鹦鹉热衣原体种之后，被

11、WHO正式确认的TWAR衣原体属新株。迄今，已发现Cpn与CHD有密切关系的事实很多：(1)CHD患者中有高滴度的急性感染抗体IgM，慢性感染抗体IgG，重叠感染抗体IgA。(2)游离血管内皮细胞能被Cpn感染，导致内膜损伤，AS斑块形成。(3)在分离培养、免疫组化、投射显微镜等可观察到Cpn的存在。(4)AS斑块中有高浓度的DNA，外膜蛋白和原体EB的存在。(5)大环内酯在急性感染期对消除炎症，降低临床事件有作用(注：也有相反的结论)。人们通过呼吸道吸入Cpn的原体EB而被感染，EB进入宿主巨噬细胞后，不断增殖成中间体和网状体。RB、中间体和EB三者同时存在一个网状结构里，此为包涵体，EB释

12、出再侵入下一个宿主细胞造成又一次感染，过程大概3 d为1个生活周期。Cpn在人体内，可以通过针对：抗体、外膜蛋白、DNA、包涵体等形式而被免疫荧光法、酶标法、免疫组化法、基因扩增法、透射电镜法而被检测出来。1997年Jackson报道2，在颈动脉内膜里，用电子显微镜让仍有梨形的EB存在，使用DNA探针Southern杂交技术检测到Cpn-DNA，进一步对其主要外膜蛋白(momp)基因序列分析表明与Cpn基因一致。Kao3于1993年证明在冠状动脉斑块缺损部位用透射电镜和免疫组化技术在泡沫细胞里1um大小的Cpn包涵体存在。外周血中Cpn病原体的检测能直接反映体内有无活性的Cpn病原体的存在4,

13、5，先前我们的研究结果表明，CHD患者的Cpn-DNA阳性率为32.7%，现今实验Cpn包涵体的阳性率13.3%，明显地高于经冠脉造影正常的非CHD患者组。国内，王卫群6于2001年报道采用直接免疫荧光法(DIF)在人动脉瘤组织中有Cpn抗原，及在PBMC中有Cpn抗原存在。我们在国内首次应用低渗溶血法处理-85 超低温冰箱保存的外周抗凝血液标本，制备有核细胞，经过瑞氏染色、姬姆萨染色、台酚兰染色和细胞计数，证实为单个核细胞。以HBSS配成106/mL细胞含量后，以针对Cpn的主要外膜蛋白(Momp)FITC标记的鼠抗人单克隆抗体染色，荧光镜下可观察到单个核细胞浆里有特异性、亮度均匀的苹果绿色

14、包涵体，与阳性标准片比较，特征相同。每个标本至少计数200个细胞，有苹果绿色特征性亮点者为阳性，没有者为阴性。我们体会，本法优点在于不需要在接到血液标本后4 h内分离出淋巴细胞，而可以将标本立即-85 冷冻管冰冻，批量检测。本方法收集的细胞量多，故血标本文献报道用610 mL的量，本方法减少到3 mL量。用FITC标记的荧光单克隆抗体染色，检测Cpn包涵体方法，有较好的特异性，较其他检测方法佳。国外报道用该方法作为是否存在包涵体的判断依据。但是，由于超低温冰冻储存血及操作过程的影响，PBMC的形态和结果模糊不清，甚至破坏。只能通过单核细胞的光镜对照，出现均匀一致亮绿色荧光的依据而确认，这是其不

15、足。现有的研究仍不清楚Cpn是否系CHD的危险因子，有证据表明CHD的发病也有可能与病原微生物的感染有关，包涵体的检出无疑对阐明CHD的发病机理、临床诊治和预后评估有重要的意义。【参考文献】 1 Saikku P, Leinonen M, Mattila K,et al .Serological evidence of an association of a novel Chlamydia, TWAR, with chronic coronary heart diseases and acute myocardial infarctionJ.lancet,1988，2(8618):983985

16、.2 Jackson LH, Campbell LA, Kuo CC, et al. Isolation of chuamydia pneumoniae from a carotid endarterectomy specimen J.The J Infect Dis，1997，176:292295.3 Kuo CC, Shor A, Campbell LA, et al .Demonstration of Chlamydia pneuoniae in Atherosclerotic Lesions of coronary ArteriesJ. The J Infect Dis，1993，16

17、7：841849.4 Bodetti TJ, Timms P. Detection of Chlamydia pneumoniae DNA and antigen in the circulating mononuclear cell fraction of humans and KoalasJ.Infect Immun,2008,68(5):27442747.5 File TM, Bartlet JG, Cassell GH, et al. The importance of Chlamydia pneumoniae as a pathogen: The 1996 Consensus conference on chlamydia pneumonia infectionJ. Infect Dis in Clin practice,1997,6(2 suppl):2831.6 王卫群，张瑞华，龚辉,等. 外周血单核细胞中肺炎衣原体特异性抗原的检测J. 中国临床医学，2002,9(3):243245.