第四章多壁碳纳米管的血液相容性实验的原理

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1、第四章多壁碳纳米管得血液相容性实验得原理、方法、以及结果分析对于任何一种准备用于人体得生物材料来讲，材料得生物相容性就是首先必 须考虑得问题。；生物材料如果比较成功，至少要使发生得反应被宿主接受 ，不产 生有害作用，因此要对生物材料进行生物安全性评价，即生物学评价.那么碳纳米 管材料就是否具有优良得生物相容性呢 ？我们做了几项血液相容性测试，从而反 映了其生物相容性。4、1实验所用试剂及仪器1、试剂名称备注生产厂家白蛋白（Alb）Sigma纤维蛋白原（Fib）Sigma免疫球蛋白（IgG）S i gma草酸钾天津市瑞金特化学品有限公司瞬酸盐缓冲液（P B S）北京中杉金桥生物技术有限公司二胺四

2、乙酸S i gma甲基硅油Sigma2、仪器与耗材CO2恒温培养箱T herm o F o r m a自动双重纯水蒸储器上海亚荣生化仪器厂数显恒温水浴锅金坛市荣华仪器制造有限公司电热恒温鼓风干燥箱上海精宏设备公司微量天平Nm e ttler Tole doLD5- 2 A型低速离心机北京医用离心机厂7 2 2分光光度计上海第三分析仪器厂Ni c o let 5700红外光谱仪（Om n i-采样器）美国T h e rm oF i sher公司液氮罐成都金凤液氮容器公司1 0 00ml正压/、锈钢滤器上海医药工业研究院一次性滤器（0、2阳1）L i fe S cience s（田胞计数板天津北海

3、玻璃仪器公司细胞计数器国产25cm2 一次性培养瓶Corning一次性培养板（2 4孔）Costa r一次性培养板（9 6孔）Costa r4、2蛋白吸附实验材料表面与血液接触后立即在材料表面吸附一层蛋白质，这一蛋白质吸附层 就是表面血栓形成得重要因素。蛋白吸附层得成份组成影响血小板在表面得黏 附，激活与释放反应。许多研究表明纤维蛋白原、纤维连接蛋白原与球蛋白在表 面得吸附能促进血小板在表面得黏附，易形成血栓；而白蛋白在表面得吸附，不 促进血小板在表面得黏附，不易形成血栓。因此材料表面纤维蛋白原得吸附在血 栓形成中起重要作用.4。2。1蛋白质溶液得配置（1）取1 ml、1 00mg/m 1得白

4、蛋白（A lb）溶液，加入4mlPBS缓冲液，配 置成5m 1终浓度为20mg/m 1得A 1 b溶液；（2） 取3、09ml、3 2、4m g/ml得免疫球蛋白（I gG）溶液，加入 1、8 1 mlPBS缓冲液，配置成5ml终浓度为20m g/m 1得I gG溶液； 称取100mg纤维蛋白原（Fib）冻干粉，溶解到5m 1 PBS缓冲液中, 配置成5ml终浓度为2 0 mg/ml得Fi b溶液。4。2。2实验步骤（1 ）取碳纸组、碳纳米管组材料各 9片，每片0。5 c mx0.5cm大小，在材 料上方滴加3 00 M得20m g/m 1得蛋白质溶液，每种蛋白质各3片，如图4、1 所示；碳纳

5、米管组图4、1研究蛋白质吸附时样品使用示意图(2)在37 c烘箱中吸附两小时后，吸走材料表面蛋白质溶液，用 PBS溶液 冲洗2次,置于干燥器中晾干；(3)将样品固定在Omni采样器上，启动程序,设定参数扫描间隔为4cm-1, 扫描为次数为32,扫描范围为6 5 0-4 0 0 0cm-1;(4)以未吸附蛋白质得空白材料为参考光谱， 对吸附有蛋白质得材料进行 扫描，利用Nicol 6 t 57 0 0红外光谱仪(美国Thermo公司),如图4、2所示获得 材料表面吸附蛋白质得红外光谱；(5 )对获得得红外光谱实验结果进行分析与处理。? 图4、2 Ni c o 1 et 5 7 00红外光谱仪4.

6、 2.3实验结果分析蛋白质得红外光谱有多个特征吸收峰，氨基II带(中心峰155 0 cm-1)得强度与材料表面吸附得蛋白质量呈线性关系：66：0图4、3为材料表面吸附蛋白质得红外光谱图。其中图A、C、E为碳纸表面吸附蛋白质得红外光谱，图B、D、F为多壁碳纳米管表面吸附蛋白质得红外光谱 (1450 1750 cm1)。根据碳纸与碳纳米管表面吸附蛋白质得红外光谱及根文献：67：中得方法计算得到蛋白质吸附量结果及两种材料表面得 Ra/f与Ra/i值列于表4、1中。0.030wave number (cm1).alecnap osbA0.0100.0090.0080.0070.0060.0050.00

7、40.0030.0020.0010.000175017001650160015501500145014001350A、碳纸表面吸附Alb得红外图谱 图谱B、碳纳米管表面吸附A 1 b得红外0.012DabrosbA.alxecn ap osbA0.0110.0100.0090.0081750170016501600155015001450wave number (cm -1)C、碳纸表面吸附Fib得红外图谱0.0420.0410.0400.0390.0380.0370.0360.0350.034u-arecnaDTOSDA-alec n apo sb A0.0330.0300.0270.024

8、0.0210.0180.0150.0121750170016501600155015001450wave number (cm-1)D、碳纳米管表面吸附Fib得红外图谱0.0160.0140.0120.0100.0080.0060.0040.0020.0001750170016501600155015001450wave number ( cm1)1750170016501600155015001450wave number (cm-1)E、碳纸表面吸附IgG得红外图谱F、碳纳米管表面吸附IgG得红外图谱X Axis Title图4、3材料表面吸附蛋白质得红外光谱表4、1红外实验数据结果-一材

9、料一MW CNTsAlb0、0 05 2 00、0 0520Fib0、0 00 97 70、008 9 3IgG0、0 0 4070、0 07 8 3Ra/f5、32 20、582Ra/i2780、664从表4、1可以瞧出这两种材料吸附白蛋白得量就是一样得，但碳纳米管表 面吸附得F ib与IgG得量均大于碳纸。一般认为，疏水性表面吸附得蛋白质量大 于亲水性表面，这与接触角测试中碳纳米管疏水性高于碳纸与本实验得出得疏水 得碳纳米管表面吸附得Fib与IgG得量均大于碳纸就是一致得。另外材料表面粗糙度与血栓得形成也有一定得关系。一般认为，材料表面吸附白蛋白可以抑制血小板粘附与血栓形成，而吸附纤维蛋白

10、原易于使血小板粘附 表面,进而导致血小板变形聚集，继发凝血形成。因此采用 Alb与F 1 b在材料表 面得吸附量之比（Ra/f）及A 1 b与IgG在材料表面得吸附量之比（R a/i）来 预测这两种材料得抗凝血性，Ra/f与Ra/i值得顺序均为：CMWCNTs,这个结 果说明碳纸得抗凝血性可能优于碳纳米管。但不能仅凭此项实验结果来确定材料 抗凝血性得优劣，必须进行其它得测试以及更进一步得研究。因此我们还做了溶血实验、血小板粘附实验等，来进一步研究材料得血液相容性。4、3溶血实验血液与合成材料接触时会发生一系列得变化通常情况下，血浆中得蛋白分子 会瞬间吸附于材料表面，形成血浆蛋白吸附层；吸附层中

11、得血浆蛋白会继而激活 血液中得功能细胞。如血小板、白细胞、红细胞等，并最终导致溶血、血桂形成以及炎症反应等其它不良后果6”.此外，血浆蛋白在材料表面得非特异性吸附还 会激活人体免疫系统，引发免疫应：690因此，血浆蛋白分子在材料表面得吸附行为 就是决定材料引起生物系统何种后续响应得一个关键因素.但就是关于碳纳米管材料对血浆蛋白分子与血液细胞作用得研究还很少见于报道。多年来，尽管研究人员一直通过各种途径开发新型生物材料与对已有得生物 材料进行表面修饰改性，但血液相容性问题仍然存在，成为限制生物材料在血液 接触环境中应用得关键问题之一.碳纳米管所具备得独特结构与化学组成使其有 可能对血液产生不同于

12、现有生物材料得特殊作用。 本研究通过扫描电镜（S E M ）观察分析了单壁碳纳米管无纺膜对血浆蛋白分子得吸附行为以及对血小板得作用， 讨论了这种新型单壁碳纳米管无纺膜材料抑制血小板粘附与活化得可能作用机理。溶血试验通过试验样品与血液直接接触， 测定红细胞释放得血红蛋白量以检测样品体外溶血得程度。 材料得血液相容性评价就是材料生物学评价得重要组成部分 ,在众多得血液相容性试验中，溶血试验就是国内外各实验室开展比较多得一项试验， 就是最常用得粗筛试验， 也被认为就是细胞毒性评价得一个补充试验。溶血实验得机理在于红细胞破坏之后会造成血红蛋白得释放， 血红蛋白四方量得多少能通过分光光度计测定得 OD值

13、反应出来，因此以OD值来反映材料可溶性 成分或材料表面得溶血性能。YY/T0 1 27、1规定,材料溶血率在5 %以下为符合 要求 ,可以认为没有溶血作用70 .4 3 1 材料制备阴性对照组:生理盐水（NS）阳性对照组：蒸储水（H2O）样品组：碳纸（C）,多壁碳纳米管（MWCNTs）,氮掺杂多壁碳纳米管（MWCNT s -N）新鲜得稀释抗凝兔血制备：由健康成年新西兰兔心脏采血20 ml ，加 2%草酸钾1 ml ，制备成新鲜得抗凝兔血。取新鲜得抗凝兔血8 ml,加生理盐水注射液10 mlo4. 3。2实验步骤阴性对照组 3 支三角瓶,每瓶加入生理盐水注射液5 ml。阳性对照组3支三角瓶，每瓶

14、加入蒸储水5m 1 o每个样品组3支三角瓶，每瓶各加入5 cm2得材料，用生理盐水注射液冲洗样 品三次，然后加入生理盐水注射液5 ml o全部三角瓶封口后放入恒温水浴中37 土 C保温3 0 min；每只试管加入0、05 m 1稀释兔血，轻轻混匀，置 37步 C继续保温60 min,取出所有三角瓶待 其降至室温；用离心机1500 r、p、m离心15 min；肉眼观察上清液清亮，吸取上 清液移入比色皿中，用分光光度计在545 nm 波长处测定吸光度，记录结果。图4、 4 为 722分光光度计.图4、4 722分光光度计4.3.3实验结果分析样品组与对照组吸光度均取3支试管得平均值。阴性对照组得吸

15、光度应不大 于0、03,阳性对照管得吸光度应为0、 80、3,试验成立。但在本实验中由于 样品数量有限，所以未能按照国标取值，但实验中按照国家标准成比例缩小取值 范围，材料与取血量均成比例缩小，实验所得数值与国标标准数值可以参比。溶血率应按下式计算：式中：A样品组得吸光度B阴性对照组得吸光度C一-阳性对照组得吸光度5所示,作为阴性对照组得生a1与新鲜得抗凝血作用后，在离心管底部就是完好得红细胞，上部就是澄清得液体照组得红细胞，而阳，半透明得液体。三种表4、2样品得溶血率3- 平均值溶血率0、011NS （生理盐水, 阴性）H 2 0（阳性）C0、009羽性对照0、2 420、 0 14冬010

16、0、0140、2400、24440 6 01血照片0、016p八、 0、2420、 0 14 31、4 3%到破坏而通过破损得细胞膜释放出血红蛋白形成了红色传 样品材料得溶血测试结果良好，与阴性组得情况基本一 于可用范围。MWCN Ts0、0 1 40、0 130、0150、0141、3%M WCNTs-N0、01 40、 01110、01 40、013r。、87%根据表4、2中得数据，绘制成图4、6得溶血率柱状图，可以很明显得比较 出三种材料得溶血率大小关系。paper溶血率图4、6溶血率柱状图表4、2为样品溶血率得计算结果，结合图4、6可以瞧出三种样品得溶血率 顺序为:C MWCNT s

17、MWC NTsN,但都小于标准值 5%,实验过程中我 们瞧到，放有三种材料得离心管底部就是完好得红细胞，上部就是澄清得液体 与图4。3a阴性对照组情况相同，则可认为材料良好，没有溶血性，对红细胞 没有破坏。我们能预测碳纳米管与掺氮碳纳米管可能具有更为优秀得血液相容 性，因此我们进行了进一步得实验研究。4、4血小板粘附实验血小板(blo o d p 1 a te 1 e t)就是哺乳动物血液中得有形成分之一。 血小板 在长期内被瞧作就是血液中得无功能得细胞碎片。血小板具有特定得形态结构与生化组成，在止血、伤口愈合、炎症反应、血栓形成及器官移植排斥等生理与病 理过程中有重要作用。当血管破损时，血小

18、板受到损伤部位激活因素刺激出现血小板得聚集，成为血小板凝块，起到初级止血作用，接着血小板又经过复杂得变化产生凝血酶，使邻近血浆中得纤维蛋白原变为纤维蛋白,互相交织得纤维蛋白使血小板凝块与血细胞缠结成血凝块，即血栓。同时血小板得突起伸入纤维蛋白网内 ,随着血小板微丝(肌动蛋白)与肌球蛋白得收缩，使血凝块收缩，血栓变得更坚实,能更有效地起止血作用。随着生物与医学得发展,细胞得粘附成为细胞生物学中得重要课题之一。研究血小板粘附、 聚集可望使这一课题取得新进展。 血小板粘附实验就是血液相容性评价得重要实验 ，从而为国家血液相容性评价标准化提供可靠得依据71 .4.4。1 材料制备大量相关得学术研究表明

19、甲基硅油在微相结构表面性能方面具有良好得抗凝血性能，而玻璃得抗凝血性能较差.因此，甲基硅油与玻璃常用作血液相容性试验得参比对照。 本研究采用甲基硅油与玻璃两种材料作为验证血液相容性优劣得参比对照 。碳纸组：将碳纸在清水中浸泡4 -5h,以清除表面附着得非晶态碳，裁成1 1 c m2大小得正方形，备用。碳纳米管组： 将碳纳米管在清水中浸泡4 5h， 以清除表面附着得非晶态碳,裁成11cm2大小得正方形，备用。掺氮碳纳米管组：将掺氮碳纳米管在清水中浸泡4-5h,以清除表面附着得非晶态碳，裁成11 cm2大小得正方形，备用。阴性对照组:直径0、 5、 、 MM 得玻璃球表面涂以 2%得甲基硅油，自然

20、干燥后备用 .阳性对照组：直径0、5、MM得玻璃球.4。4。2实验步骤在24孔板中，取1X1 c m2得碳纸与碳纳米管材料各2片，分别放入4个 孔中。阴性对照组2个孔，各放涂有2%甲基硅油得直径为0.5mm得玻璃球14 0个.阳性对照组2个孔，各放直径为0.5mm得玻璃球140个.取健康成年新西兰兔心脏血，与样品接触1 560秒钟，将通过材料得血液 与EDTA (1%)以9: 1比例混匀.再用血小板保存液稀释抗凝血。 并在镜下做血 小板计数。取出材料对表面进行扫描电镜分析。4。4.3实验结果分析血小板(platelet)就是存在于循环系统中得无核盘状细胞，直径多为34仙俱 在血液中得含量约为0

21、、3%,粘附于表面并聚集成血栓子以减少出血。它能通过形成血小板栓抑制流血，通过催化凝血反应使血小板栓稳定，导致血栓。血小板粘附试验就是评价生物材料抗凝血性能得方法之一72 .甲基硅油就是一种抗凝血性能较好得材料，而玻璃球就是抗凝血能力就很差，因此本文就分别以它们作为 阴、阳性参照物。与正常对照计数算出样品血小板得黏附率。式中：A- 抗凝血中得血小板数；B 与材料作用完之后得抗凝血中得血小板数。表4、3样品得血小板数及血小板粘附率12血小板平均数血小板粘附率空白326369347、5-硅27 12 912 8 119、14%玻璃7 37272、579、13%C25228426822、87%MWC

22、NTs-N28 3276279、519、57%MWCNT s31932 83 2 3、56、9%甲基硅油就是一种抗凝血性能较好得材料，而玻璃球就是抗凝血能力就很 差，分别以它们作为阴、阳性参照物。表 4、3为样品表明粘附血小板数及血小 板粘附率得计算结果，可以瞧出三种材料得血小板粘附率顺序为：CMWCNTs-N MWCN Ts, 一般认为疏水性表面可以抑制血小板得粘附与血栓得形 成.因此，实验结果说明碳纳米管与掺氮碳纳米管表面得疏水性高于碳纸，而扫描 电镜结果显示碳纳米管得粗糙度显著大于碳纸,这都与实验过程中瞧到MWCNTs接触血液初期基本不吸附得现象一致.但三种材料却都与阴性对照组得数值 接

23、近且远低于阳性对照组并接近于阴性对照组 ，均处于可使用范围。图4、7碳纸表面血小板粘附情况（20 0。倍）图4、8碳纳米管表面血小板粘附情况 （2 0 00倍）12W200SHVWD8.28 16 AM 20 0 7 2000x 9 OmniDet图4、9氮掺杂碳纳米管表面血小板粘附情况（2000彳）2C0KV1QCDC 9 ijIZrSCOS a. 02 03 AM图4、11碳纳米管表面血小板粘附情况（1000 0倍）12006 HV I WD I Off ，1龌则目:56 *苴M 竺Cikvkooonl占白 EE ETO图4、12杂碳纳米管表面血小板粘附情况（1 0 0 0 0彳）图4、7

24、- 4、12分别为碳纸、碳纳米管表与掺氮碳纳米管表面血小板粘附得扫描电镜图片。比较图4、7-4、1 2可以瞧出碳纸与M WCNTs-N表面出现很 多丝状物，而在MWCNTs表面几乎很少（丝状物为血浆中得可溶性纤维蛋白原 在血小板得作用下变成得不可溶得纤维蛋白，纤维蛋白原就是形成血栓得原料 ）。有研究表明，光滑得表面可减少血小板得聚集与解体,但纳米管表面相对于碳纸较为粗糙,血小板得聚集情况应更为明显。这与本实验中在扫描电镜下观察到得在纳米管表面血小板以个体存在得情况很少， 基本上都就是以血小板得聚集形式存在得情况就是一致得。图4、104、1 2为三种材料表面血小板聚集情况 得图片，通过比较发现碳纸与M WCNTs-N表面血小板发生变形与聚集并在周 围产生了大量得纤维原蛋白将其包裹住，血小板个体形态几乎不能分辨。在M WCNTs表面虽然也有血小板得变形与聚集，但就是仍能清晰瞧到血小板得形 态，并且几乎没有纤维蛋白得产生.溶血实验与血小板粘附实验所得到结果相一致表明掺氮碳纳米管与无掺氮碳纳米管得抗凝血性都高于碳纸得结论， 进一步说明了材料可能具有优良得血液 相容性。