维生素与测定课件

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1、第十章第十章 维生素的测定维生素的测定 维生素是维持机体正常生理功能及细胞内特异代谢反应所必需的一类微量低分子天然有机化合物。 虽然各类维生素的化学结构不同，生理功能各异、但它们都具有以下共同特点共同特点：它们都是以其本体的形式或可被机体利用的前体形式存在于天然食物中；大多数维生素不能在体内合成，也不能大量储存于组织，所以必须经常由食物供给；它们不是构成各种组织的原料，也不提供能量；虽然每日生理需要量(仅以mg或ug计)很少，然而在调节物质代谢过程中却起着十分重要的作用。维生素常以辅酶或辅基的形式参与酶的功能；不少维生素具有几种结构相近、生物活性相同的化合物。二、命名二、命名三、分类三、分类

2、根据维生索的溶解性可将其分成两大类：根据维生索的溶解性可将其分成两大类： 1脂溶性维生素脂溶性维生素 包括维生素包括维生素A、D、E、K，它们不溶于，它们不溶于水而溶于脂肪及有机溶剂水而溶于脂肪及有机溶剂(如苯、乙醚及氯仿等如苯、乙醚及氯仿等)中；在食物中；在食物中它们常与脂类共存，在酸败的脂肪中容易破坏；其吸收中它们常与脂类共存，在酸败的脂肪中容易破坏；其吸收与肠道中的脂类密切相关；主要储存干肝脏中；与肠道中的脂类密切相关；主要储存干肝脏中； 2水溶性维生素水溶性维生素 包括包括B族维生素（维生素族维生素（维生素B1、B2、PP、B6、叶酸、叶酸、B12，泛酸、生物素等）和维生素，泛酸、生物

3、素等）和维生素C。与脂溶性。与脂溶性维生素不同，水溶性维生素及其代谢产物较易排出，体内维生素不同，水溶性维生素及其代谢产物较易排出，体内没有非功能性的单纯的储存形式。没有非功能性的单纯的储存形式。 有些化合物，其活性类似维生素，曾被列入维生素类，有些化合物，其活性类似维生素，曾被列入维生素类，通常称之为通常称之为“类维生素类维生素”，如生物类黄酮、辅酶，如生物类黄酮、辅酶Q、肌醇、肌醇、硫辛酸、对氨基苯甲酸、乳清酸和牛磺酸等。硫辛酸、对氨基苯甲酸、乳清酸和牛磺酸等。四、测定意义四、测定意义食品科学研究者需要准确的食品成分分析信息，计食品科学研究者需要准确的食品成分分析信息，计算营养素的膳食摄入

4、，以改善人类的营养；算营养素的膳食摄入，以改善人类的营养；食品营养价值评价；食品营养价值评价；食品生产工艺设计及强化食品的评价；食品生产工艺设计及强化食品的评价；食品资源开发；食品资源开发；食品标签的准确性。食品标签的准确性。五、测定方法五、测定方法涉及人体和动物的生物分析方法；涉及人体和动物的生物分析方法；利用原生生物、细菌和酵母等的微生物分析方法；利用原生生物、细菌和酵母等的微生物分析方法；化学法、分光光度法、荧光法、色谱、酶法、免疫化学法、分光光度法、荧光法、色谱、酶法、免疫和放射等物理化学分析方法。和放射等物理化学分析方法。脂溶性维生素的理化性质：脂溶性维生素的理化性质：溶解性：不溶于

5、水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、溶解性：不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、苯、乙醚等有机溶剂。苯、乙醚等有机溶剂。耐酸碱性：耐酸碱性：VA、VD对酸不稳定，对碱稳定；对酸不稳定，对碱稳定； VE对酸稳定，对碱不稳定。对酸稳定，对碱不稳定。耐热性：耐热性：VA、VD、VE耐热性好，能经受煮沸耐热性好，能经受煮沸耐氧化性：耐氧化性：VA易被氧化，光、热促进氧化易被氧化，光、热促进氧化 VE易被氧化，光、热、碱促进氧化易被氧化，光、热、碱促进氧化 VD性质稳定，不易氧化性质稳定，不易氧化 维生素维生素A类是指含有类是指含有-白芷酮环的多烯基结构、并具有白芷酮环的多烯基结构、并具有视黄醇生物活

6、性的一大类物质。广义而言包括已经形成的视黄醇生物活性的一大类物质。广义而言包括已经形成的维生素维生素A和维生素和维生素A原。原。动物体内具有视黄醇生物活性功能的维生素动物体内具有视黄醇生物活性功能的维生素A类包括视黄类包括视黄醇、视黄醛、视黄酸等物质，醇、视黄醛、视黄酸等物质，4-氧视黄酸、氧视黄酸、4-羟视黄酸等羟视黄酸等不具有视黄醇生物活性功能。不具有视黄醇生物活性功能。维生素维生素A分为维生素分为维生素A1和维生素和维生素A2，A1主要存在于海产主要存在于海产鱼中，鱼中，A2主要存在于淡水鱼中。主要存在于淡水鱼中。在植物中不含已形成的维生素在植物中不含已形成的维生素A，在黄、绿、红色植物

7、中，在黄、绿、红色植物中含有类胡萝卜素，其中一部分可在体内转变成维生紊含有类胡萝卜素，其中一部分可在体内转变成维生紊A的的类胡萝卜素称为维生素类胡萝卜素称为维生素A原，如原，如-胡萝卜素、胡萝卜素、-l胡萝卜素、胡萝卜素、-胡萝卜素等。目前已经发现的类胡萝卜素约胡萝卜素等。目前已经发现的类胡萝卜素约600种，仅有种，仅有约约1/10为维生素为维生素A原。原。维生素维生素A 的功能：的功能：维持正常视觉维持正常视觉维持上皮的正常生长与分化维持上皮的正常生长与分化促进生长发育促进生长发育抑癌作用抑癌作用维持机体正常免疫功能维持机体正常免疫功能供给量与来源：供给量与来源：1989年年RDA中成人每人

8、每天摄入维生素中成人每人每天摄入维生素800ug视黄醇当量。视黄醇当量。1992年全国营养调查表明，我国城乡居民视黄醇当量平年全国营养调查表明，我国城乡居民视黄醇当量平均摄入量仅为均摄入量仅为476ug，其中约，其中约23来自植物性食物。来自植物性食物。维生素维生素A最好的来源是各种动物肝脏、鱼肝油、鱼卵、全最好的来源是各种动物肝脏、鱼肝油、鱼卵、全奶、奶油、禽蛋等；维生素奶、奶油、禽蛋等；维生素A原的良好来源是深色蔬菜和原的良好来源是深色蔬菜和水果，如冬寒菜、菠菜、首宿、空心莱、莴笋叶、芹菜叶、水果，如冬寒菜、菠菜、首宿、空心莱、莴笋叶、芹菜叶、胡萝卜、豌豆苗、红心红薯、椒及水果中的芒果、杏

9、子及胡萝卜、豌豆苗、红心红薯、椒及水果中的芒果、杏子及柿子等。柿子等。1 原理原理 维生素维生素A在三氯甲烷中与三氯化锑相互作用，生在三氯甲烷中与三氯化锑相互作用，生成蓝色物质，其颜色深浅与溶液中所含维生素成蓝色物质，其颜色深浅与溶液中所含维生素A的含的含量成正比。量成正比。 该蓝色物质不稳定，需在一定时间内（该蓝色物质不稳定，需在一定时间内（6秒）用分秒）用分光光度计于光光度计于620nm波长处测定其吸光度。波长处测定其吸光度。2 试剂试剂 无水乙醚、无水乙醇、三氯甲烷等试剂需预先处理。无水乙醚、无水乙醇、三氯甲烷等试剂需预先处理。 维生素维生素A标准溶液标准溶液3 操作步骤操作步骤维生素维

10、生素A极易被光破坏，实验操作应在微弱光线极易被光破坏，实验操作应在微弱光线下进行，或用棕色玻璃仪器。下进行，或用棕色玻璃仪器。全国癫痫病医院全国癫痫病医院癫痫病医院排名癫痫病医院排名癫痫病的早期症状癫痫病的早期症状郑州军海癫痫病医院郑州军海癫痫病医院omom癫痫病人的寿命癫痫病人的寿命. .comcom癫痫医院排行榜癫痫医院排行榜3.1样品处理：样品处理：根据样品性质，可采用皂化法或研磨法。根据样品性质，可采用皂化法或研磨法。 3.1.1皂化法：皂化法：适用于维生素适用于维生素A含量不高的样品，可减含量不高的样品，可减少脂溶性物质的干扰，但全部试验过程费时，且易导少脂溶性物质的干扰，但全部试验

11、过程费时，且易导致维生素致维生素A损失。损失。皂化：根据样品中维生素皂化：根据样品中维生素A含量的不同，称取含量的不同，称取0.55g样品于三角瓶中，加入样品于三角瓶中，加入10mL 1:1氢氧化钾及氢氧化钾及2040mL乙醇，于电热板上回流乙醇，于电热板上回流30min至至皂化完全皂化完全为止。为止。 提取：提取：洗涤：洗涤：浓缩：浓缩：水层水层皂化瓶内混合物皂化瓶内混合物分液漏斗分液漏斗1 1号号水洗水洗乙醚洗乙醚洗振摇，静置，分层振摇，静置，分层水层水层醚层醚层分液漏斗分液漏斗2 2号号振摇，静置，分层振摇，静置，分层醚层醚层水层水层分液漏斗分液漏斗3 3号号振摇，静置，分层振摇，静置，

12、分层醚层醚层分液漏斗分液漏斗1 1号号提取提取振摇，静置，分层振摇，静置，分层分液漏斗分液漏斗1 1号号水洗水洗醚层醚层水层水层KOHKOH溶液洗溶液洗振摇，静置，分层振摇，静置，分层醚层醚层KOHKOH溶液层溶液层水洗水洗振摇，静置，分层振摇，静置，分层醚层醚层水层水层振摇，静置，分层振摇，静置，分层水洗水洗醚层醚层水层水层净化净化分液漏斗醚层分液漏斗醚层乙醚洗涤乙醚洗涤水浴蒸馏水浴蒸馏减压抽干减压抽干氯仿定容（氯仿定容（5mL)5mL)无水硫酸钠无水硫酸钠浓缩浓缩3.1.2研磨法研磨法：适用于每克样品维生素：适用于每克样品维生素A含量大于含量大于510g样品的测定，如肝的分析。（步骤简单，

13、省时，结果准样品的测定，如肝的分析。（步骤简单，省时，结果准确。）确。）研磨：研磨：精确称精确称25g样品，放入盛有样品，放入盛有35倍样品重量的无倍样品重量的无水硫酸钠研钵中，研磨至样品中水分完全被吸收，并均质水硫酸钠研钵中，研磨至样品中水分完全被吸收，并均质化。化。提取：提取：小心地将全部均质化样品移入带盖的三角瓶内，准小心地将全部均质化样品移入带盖的三角瓶内，准确加入确加入50100mL乙醚。紧压盖子，用力振摇乙醚。紧压盖子，用力振摇2min，使样，使样品中维生素品中维生素A溶于乙醚中。使其自行澄清溶于乙醚中。使其自行澄清(大约需大约需12h)，或离心澄清或离心澄清(因乙醚易挥发，气温高

14、时应在冷水浴中操作。因乙醚易挥发，气温高时应在冷水浴中操作。装乙醚的试剂瓶也应事先放入冷水浴中装乙醚的试剂瓶也应事先放入冷水浴中)浓缩：浓缩：取澄清提取乙醚液取澄清提取乙醚液25mL，放入比色管中，在，放入比色管中，在7080水浴上抽气蒸干。立即加入水浴上抽气蒸干。立即加入1mL三氯甲烷溶解残三氯甲烷溶解残渣。渣。3.2 标准曲线制备标准曲线制备 准确取一定量的维生素准确取一定量的维生素A标准液于标准液于45个容量瓶个容量瓶中，以三氯甲烷配制标准系列。中，以三氯甲烷配制标准系列。 取相同数量比色管顺次取取相同数量比色管顺次取1mL三氯甲烷和标准系三氯甲烷和标准系列使用液列使用液1mL，各管加入

15、乙酸酐，各管加入乙酸酐1滴，制成标准比色系滴，制成标准比色系列。列。 于于620nm波长处，以三氯甲烷调节吸光度至零点，波长处，以三氯甲烷调节吸光度至零点，将其标准比色系列按顺序移入光路前，迅速加入将其标准比色系列按顺序移入光路前，迅速加入9mL三氯化锑三氯甲烷溶液。于三氯化锑三氯甲烷溶液。于6s内内测定吸光度。测定吸光度。 以吸光度为纵坐标，以维生素以吸光度为纵坐标，以维生素A含量为横坐标绘含量为横坐标绘制标准曲线图。制标准曲线图。3.3 样品测定样品测定于一比色管中加入于一比色管中加入10mL三氯甲烷，加入三氯甲烷，加入1滴乙酸滴乙酸酐为空白液。酐为空白液。 另一比色管中加入另一比色管中加

16、入1mL三氯甲烷，其余比色管中三氯甲烷，其余比色管中分别加入分别加入1mL样品溶液及样品溶液及1滴乙酸酐。滴乙酸酐。 其余步骤同标准曲线的制备。其余步骤同标准曲线的制备。4 结果计算结果计算 1000100VmCX1.原理原理样品中的维生素样品中的维生素A及维生素及维生素E经皂化提取处理后，经皂化提取处理后，将其从不可皂化部分提取至有机溶剂中。用高效液相将其从不可皂化部分提取至有机溶剂中。用高效液相色谱法色谱法C18反相柱将维生素反相柱将维生素A和维生素和维生素E分离，经紫外分离，经紫外检测器检测，并用内标法定量测定。检测器检测，并用内标法定量测定。 最小检出量分别为最小检出量分别为VA：0.

17、8ng；E：91.8ng；E：36.6ng；E：20.6ng。2 试剂试剂 无水乙醚、无水乙醇、三氯甲烷等试剂需预先处无水乙醚、无水乙醇、三氯甲烷等试剂需预先处理。理。 维生素维生素A标准溶液、维生素标准溶液、维生素E标准溶液标准溶液 内标物溶液：内标物溶液：10g10g苯并苯并e芘芘 /mL3 仪器和设备仪器和设备高压液相色谱仪带紫外分光检测器。高压液相色谱仪带紫外分光检测器。 4.操作步骤操作步骤4.1样品处理样品处理4.1.1皂化皂化称取称取110g样品样品(含维生素含维生素A约约3g，维生素，维生素E各异构体约为各异构体约为40g)于皂化瓶中，加于皂化瓶中，加30mL无水乙醇，无水乙醇

18、，进行搅拌，直到颗粒物分散均匀为止。加进行搅拌，直到颗粒物分散均匀为止。加5mL 10%抗坏血酸抗坏血酸，苯并苯并e芘标准芘标准液液2.00mL，混匀。，混匀。加加10mL1:1氢氧化钾氢氧化钾，混匀。于沸水浴上回流，混匀。于沸水浴上回流30min使使皂化皂化完全。皂化后立即放入冰水中冷却。完全。皂化后立即放入冰水中冷却。4.1.2提取提取 将皂化后的样品移入分液漏斗中，用将皂化后的样品移入分液漏斗中，用50mL水分水分23次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用约次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用约100mL乙醚乙醚分两次分两次洗洗皂化瓶及其残渣，乙醚液并入分液漏斗皂化瓶及其残渣，乙醚液并入分液漏

19、斗中。如有残渣，可将此液通过有少许脱脂棉的漏斗滤中。如有残渣，可将此液通过有少许脱脂棉的漏斗滤入分液漏斗。轻轻振摇分液漏斗入分液漏斗。轻轻振摇分液漏斗2min，静置分层，静置分层，弃弃去水层去水层。4.1.3洗涤洗涤 用约用约50mL水洗水洗分液漏斗中的乙醚层，用分液漏斗中的乙醚层，用pH试纸试纸检验直至水层不显碱性检验直至水层不显碱性(最初水洗轻摇，逐次振摇强度最初水洗轻摇，逐次振摇强度可增加可增加)。4.1.4浓缩浓缩 将乙醚提取液经过无水硫酸钠将乙醚提取液经过无水硫酸钠(约约5g)滤入与旋转蒸发器滤入与旋转蒸发器配套的配套的250300mL球形蒸发瓶内，用约球形蒸发瓶内，用约10mL乙醚

20、冲洗分乙醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠液漏斗及无水硫酸钠3次，并入蒸发瓶内，并将其接至旋次，并入蒸发瓶内，并将其接至旋转蒸发器上，于转蒸发器上，于55水浴中减压蒸馏并回收乙醚，待瓶中水浴中减压蒸馏并回收乙醚，待瓶中剩下约剩下约2mL乙醚时，取下蒸发瓶，立即用乙醚时，取下蒸发瓶，立即用氮气吹掉乙醚氮气吹掉乙醚。立即加入立即加入2.00mL乙醇，充分混合，溶解提取物。乙醇，充分混合，溶解提取物。 将乙醇液移入一小塑料离心管中，离心将乙醇液移入一小塑料离心管中，离心5min(5000rpm)。上清液供色谱分析。如果样品中维生素含量过少，可用氮上清液供色谱分析。如果样品中维生素含量过少，可用氮气将乙醇液吹

21、干后，再用乙醇重新定容。并记下体积比。气将乙醇液吹干后，再用乙醇重新定容。并记下体积比。 4.2高效液相色谱分析条件（推荐条件）预柱：ultrasphere ODS 10m，4mm4.5cm。分析柱：ultrasphere ODS 5m，4.6mm25cm。流动相：甲醇 水98 2。混匀。于临用前脱气。紫外检测器波长：300nm。量程0.02。进样量：20L。流速：1.7mL/min。4.3标准曲线的制备4.3.1维生素A和维生素E标准浓度的标定方法取维生素A和各维生素E标准液若干微升，分别稀释至3.00mL乙醇中，并分别按给定波长测定各维生素的吸光值。用比吸光系数计算出该维生素的浓度。 31

22、1000. 31001SEAX标准加入标准的量S,ul比吸光系数，Ecm1%波长，,nm视黄醇（VA）10.001835325-生育酚100.071294-生育酚100.092.8298-生育酚100.091.22984.3.2标准曲线的制备（采用内标法） 把一定量的维生素A、生育酚、生育酚、生育酚及内标苯并e芘液混合均匀。 进样，色谱分析。 以维生素峰面积与内标物峰面积之比为纵坐标，维生素浓度为横坐标绘制维生素标准曲线，或计算直线回归方程。 本方法不能将E和E分开，E峰中包含有E峰。 4.4样品分析取样品浓缩液20L，待绘制出色谱图及色谱参数后，再进行定性和定量。4.4.1定性：用标准物色谱

23、峰的保留时间定性。4.4.2定量：根据色谱图求出某种维生素峰面积与内标物峰面积的比值，以此值在标准曲线上查到其含量。或用回归方程求出其含量。5计算式中：X2某种维生素的含量，mg/100g；C由标准曲线上查到某种维生素含量，g/mL；V样品浓缩定容体积，mL；m样品质量， g。10001002VmCX 胡萝卜素是一种广泛存在于有色蔬菜和水果中的天然色素，有多种异构体和衍生物，总称为类胡萝卜素，其中在分子结构中含有-紫罗宁残基的类胡萝卜素，在人体内可转变为维生素A，故称为维生素A原。如、胡萝卜素，其中-胡萝卜素效价最高，每mg -胡萝卜素约相当于167ug维生素A。胡萝卜素的性质： 胡萝卜素对热

24、及酸、碱比较稳定，紫外线和空气中的氧可促进其氧化破坏。胡萝卜素易溶于有机试剂，可用有机溶剂从食物中提取。胡萝卜素含有共轭双键数目较多，本身是一种色素，在450nm波长处有最大吸收。测定方法：薄层色谱、纸色谱、HPLC国家标准中采用纸色谱法进行测定（GB/T 123891990） 1. 测定原理 以丙酮和石油醚提取食物中的胡萝卜素及其他植物色素；以石油醚为展开剂进行纸层析，将胡萝卜素与与其他色素分离；剪下含胡萝卜素的区带，洗脱后于450nm波长下定量测定。2 操作方法（1）样品处理粮食：样品用水洗三次，置60烤箱中烤干，磨粉，储于塑料瓶内，放一小包樟脑精，盖紧瓶塞保存，备用。蔬菜与其他植物性食物

25、：取可食部用水冲洗三次后，用纱布吸去水滴，切碎，用匀浆器制成匀浆，贮于塑料瓶内，冰箱内保存备用。（2）提取（需避光条件下进行）取适量样品（相当于含胡萝卜素约2080g）置于100mL带塞锥形瓶中加入丙酮20mL，石油醚5mL，振摇1min，静置5min将提取液转入盛有100mL 5%硫酸钠溶液的分液漏斗中于锥形瓶中加入10mL丙酮石油醚混合液，振摇1min，静置5min，将提取液并入分液漏斗中。重复提取23次，直至提取液无色为止。植物油和高脂肪样品：需先皂化，取适量样品(10g)，加脱醛乙醇30mL，再加10mL 1:1氢氧化钾溶液，回流加热30min，然后用冰水使之迅速冷却，皂化后样品用石油

26、醚提取，直至提取液无色为止。 （3）洗涤提取液静置分层，弃去下层水溶液；反复用5%硫酸钠溶液振摇洗涤，直至下层水溶液清亮为止。将皂化后样品提取液用水洗涤至中性。石油醚提取液通过盛有10g无水硫酸钠的小漏斗，漏入球形瓶，用少量石油醚分数次洗净分液漏斗和无水硫酸钠层内的色素，洗涤液并入球形瓶内。（4）浓缩与定容提取液于旋转蒸发器上减压蒸发（60），蒸发至约1mL时，取下，氮气吹干，立即加入2.00mL石油醚定容，备层析用。（5）纸层析点样：在18cm30cm滤纸下端距底边4cm处作一基线，在基线上取A、B、C、D四点，吸取0.1000.400mL浓缩液(6.3)在AB和CD间迅速点样。展开：待纸上

27、所点样液自然挥发干后，将滤纸卷成圆筒状，置于预先用石油醚饱和的层析缸中，进行上行展开。洗脱：待胡萝卜素与其他色素完全分开后，取出滤纸，自然挥发干石油醚，剪下位于展开剂前沿的胡萝卜素层析带，立即放入盛有5mL石油醚的具塞试管中，用力振摇，使胡萝卜素完全溶入溶剂中。（6）比色测定用1cm比色杯，以石油醚调节零点，于450nm波长下，测吸光度，以其值从标准曲线上查出胡萝卜素的含量，供计算时使用。标准曲线绘制（7）标准曲线制备 取胡萝卜素标准使用液(浓度为50g/mL)1.00、2.00、3.00、4.00、6.00、8.00mL，分别置于100mL具塞锥形瓶中，按样品测定步骤进行操作，点样体积为0.

28、100mL，标准曲线各点胡萝卜素含量依次为2.50、5.00、7.50、10.00、15.00、20.00g。以胡萝卜素含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 （8）结果计算1000110012mVVCX 维生素E又称生育酚，属于酚类化合物。目前已经确认的有四种异构体：、生育酚和、三烯生育酚。维生素E的测定方法有：比色法、荧光法、HPLC法等 1原理 样品经皂化、提取、浓缩蒸干后，用正己烷溶解不皂化物。在295nm激发波长，324nm发射波长下测定其荧光强度，并与标准-维生素E作比较，从而计算出样品中维生素E的含量。2 操作方法（1）样品处理 称样皂化瓶维生素维生素C C 无水乙醇无水乙

29、醇 KOHKOH溶液溶液水水分液漏斗乙醚乙醚分离水层水层乙醚层乙醚层醚层经无水硫酸钠过滤，氮气流真空蒸干正已烷溶解，定容。（2）荧光测定激发波长：295nm 发射波长：324nm激发狭缝：3nm 发射狭缝：2nm样品及标准溶液分别置于1cm比色杯，测定荧光激发光谱和发射光谱，读取最大激发波长及最大发射波长下的荧光强度F（3）结果计算1000100mFVCFXSSi 水溶性维生素B1、B2和C，广泛存在于动植物组织中，饮食来源充足。性质：溶解性：水溶性维生素都易溶于水易溶于水，而不溶于苯、乙 醚、氯仿等大多数有机溶剂。稳定性：在酸性介质稳定酸性介质稳定，既使加热也不破坏； 但在碱性介质中不稳定，

30、易于分解，特别在 碱性条件下加热，可大部或全部破坏。 易受空气、光、热、酶、金属离子等的影响， 维生素B2对光，特别是紫外线敏感，易被光 线破坏 维生素C对氧、铜离子敏感，易被氧化。食品中水溶性维生素的测定食品中水溶性维生素的测定食品中维生素食品中维生素B1的测定的测定食品中维生素食品中维生素B2的测定的测定食品中维生素食品中维生素C的测定的测定食品中烟酸的测定食品中烟酸的测定食品中维生素食品中维生素B6的测定的测定维生素B1又称硫胺素、抗神经炎素。测定方法：比色法 荧光法（GB/T 12390-1990） HPLC法1. 荧光法原理 硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中被氧化成噻嘧色素，硫胺素在碱性铁

31、氰化钾溶液中被氧化成噻嘧色素，在紫外线下，噻嘧色素发出荧光。在给定的条件下，在紫外线下，噻嘧色素发出荧光。在给定的条件下，以及没有其他荧光物质干扰时，此荧光之强度与噻嘧以及没有其他荧光物质干扰时，此荧光之强度与噻嘧色素量成正比，即与溶液中硫胺素量成正比。色素量成正比，即与溶液中硫胺素量成正比。 本方法适用于各类食物中硫胺素的测定，但不适本方法适用于各类食物中硫胺素的测定，但不适用于有吸附硫胺素能力的物质和含有影响噻嘧色素荧用于有吸附硫胺素能力的物质和含有影响噻嘧色素荧光物质的样品。光物质的样品。本方法的最小检出限为本方法的最小检出限为0.05g。 2. 主要试剂活性人造浮石硫胺素标准溶液3.

32、仪器设备荧光分光光度计Maizel-Gerson 反应瓶盐基交换管3. 操作步骤（1）试样处理 样品匀浆（或粉碎）于低温冰箱中冷冻保存。（2）提取水解 酶解称样三角瓶三角瓶高压水解高压水解盐酸溶液盐酸溶液调调pHpH值值乙酸钠溶液乙酸钠溶液酶解酶解淀粉酶淀粉酶定容定容（3）净化样品样品热水热水酸性氯化钾酸性氯化钾收集酸性氯化钾定容至收集酸性氯化钾定容至25ml25ml（4）氧化 静置 过滤 脱水反应瓶编号标准A瓶标准B瓶样品A瓶样品B瓶加标准液或样品液标准液5ml 标准液5ml 样品液5ml 样品液5ml加氢氧化钠3ml3ml加碱性铁氰化钾3ml3ml加正丁醇10ml10ml10ml10ml（

33、5）荧光强度测定激发波长365nm；发射波长435nm；激发波狭缝5nm；发射波狭缝5nm。4.计算 1000100121mVVSSVCUUXbb维生素维生素B2又称核黄素又称核黄素测定方法主要有：微生物法、荧光法、测定方法主要有：微生物法、荧光法、HPLC法法GB/T 12391-1990采用的是微生物法和荧光法。采用的是微生物法和荧光法。（一）微生物法（一）微生物法原理：原理：某一种微生物的生长某一种微生物的生长( (繁殖繁殖) )必需某些维生素。必需某些维生素。例如干酪乳酸杆菌例如干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei(Lactobacillus casei，简称，简称L.

34、C.)L.C.)的生长需要核黄素，培养基中若缺乏这种维生素该细的生长需要核黄素，培养基中若缺乏这种维生素该细菌便不能生长。在一定条件下，该细菌生长情况，以菌便不能生长。在一定条件下，该细菌生长情况，以及它的代谢物乳酸的浓度与培养基中该维生素含量成及它的代谢物乳酸的浓度与培养基中该维生素含量成正比，因此可以用酸度及混浊度的测定法来测定样品正比，因此可以用酸度及混浊度的测定法来测定样品中核黄素的含量。中核黄素的含量。 （二）荧光法（二）荧光法1.原理：原理： 核黄素在核黄素在440500nm波长光照射下发生黄绿色荧波长光照射下发生黄绿色荧光。在稀溶液中其荧光强度与核黄素的浓度成正比。光。在稀溶液中

35、其荧光强度与核黄素的浓度成正比。在波长在波长525nm下测定其荧光强度。试液再加入低亚硫下测定其荧光强度。试液再加入低亚硫酸钠酸钠(Na2S2O4)，将核黄素还原为无荧光的物质，然后，将核黄素还原为无荧光的物质，然后再测定试液中残余荧光杂质的荧光强度，两者之差即再测定试液中残余荧光杂质的荧光强度，两者之差即为食品中核黄素所产生的荧光强度。为食品中核黄素所产生的荧光强度。 为使为使VB2游离出来，采用需经酸解和酶解游离出来，采用需经酸解和酶解 为消除干扰，试样通过氧化处理和柱层析处理。为消除干扰，试样通过氧化处理和柱层析处理。 2.测定步骤测定步骤（1）样品提取）样品提取称样三角瓶三角瓶高压水解

36、高压水解盐酸溶液盐酸溶液调调pHpH值值氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液酶解酶解淀粉酶淀粉酶定容定容蛋白酶蛋白酶（2）氧化去杂）氧化去杂样品提取液样品提取液具塞试管具塞试管水水双氧水双氧水冰乙酸冰乙酸高锰酸钾高锰酸钾氧化去杂氧化去杂褪色褪色标准液按相同方法进行标准液按相同方法进行（3）柱层析）柱层析样品液样品液水水丙酮丙酮- -乙酸乙酸- -水混合液水混合液水水收集洗脱液收集洗脱液定容至定容至10ml10ml* *标准液按相标准液按相同操作进行同操作进行（4）荧光测定）荧光测定激发光波长激发光波长440nm，发射光波长，发射光波长525nm，测量样品管，测量样品管及标准管的及标准管的荧光值荧光值。 待样品及标准的荧光值测量后，在各管的剩余液中加待样品及标准的荧光值测量后，在各管的剩余液中加0.1mL 20%低亚硫酸钠低亚硫酸钠溶液，立即混匀，在溶液，立即混匀，在20s内内测测出各管的荧光值，作为各自的出各管的荧光值，作为各自的空白值空白值。3.计算计算 10001002fmDCSBAX