色谱基础知识及原理

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1、关于色谱关于色谱 色谱是一种分离工具，而不是传统意义上的分析仪器 常见的分离方式： 蒸馏、离心、电泳、过滤、超滤 等等 色谱 是其中一种分离工具 色谱法简介色谱法简介 色谱法（Chromatography）溯源 俄国科学加1903年发现色谱的吸附原理，开创了应用吸附原理分离植物色素的新方法并见诸于俄文的文献 1906年正式命名（见诸文献） 色谱法；Chromatography 30年代开始广泛研究和应用 主要是气相色谱及薄层色谱 高效液相色谱法的广泛应用始于70年代 色谱的发明人色谱的发明人 俄国科学家：M. S. Tswett 正式命名“色谱”的文献 色谱分离的机理色谱分离的机理 分离是一个

2、物理的过程 流动相（流动相（Mobile Phase） 固定相（固定相（Stationary Phase） 样品（溶解于流动相中的溶质）样品（溶解于流动相中的溶质） 什么是液相色谱什么是液相色谱 色 谱液 相 色 谱柱 色 谱纸 色 谱薄 层 色 谱高 效 液 相 色 谱高 效 液 相 色 谱H P L CH P L C气 相 色 谱气相色谱：流动相是气相 液相色谱：流动相是液相 什么是高效液相色谱什么是高效液相色谱 High Performance Liquid Chromatography 高效液相色谱法，简称：HPLC 是一种区别于经典液相色谱；基于仪器方法的高效能分离手段： 高性能的色

3、谱柱，高精度、耐高压的输液泵以及高灵敏度的检测器 广泛应用于各个领域： 医药 / 环保 / 石化 / 生命科学 / 食品及农业 在技术，理论及应用上仍处于发展阶段 HPLC的仪器配置及流程的仪器配置及流程 溶剂溶剂 色谱泵 自动进样器 HPLC色谱柱色谱柱 检测器 废液 数据处理系统 HPLC的仪器配置及流程的仪器配置及流程 色谱泵色谱泵 自动进样器自动进样器 色谱柱及柱温箱色谱柱及柱温箱 检测器检测器 数据处理系统数据处理系统 溶剂溶剂 色谱图：色谱图：HPLC图形结果（图形结果（Chromatogram） 色谱图色谱图即色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图，其纵坐标为信号

4、强度，横坐标为保留时间。 色谱峰色谱峰 保留时间（分）保留时间（分） 基线基线 峰高峰高 峰宽峰宽 液相色谱图相关术语液相色谱图相关术语 色谱峰 Peak 色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分曲线 峰底 Peak Base 峰的起点与终点之间连接的直线 峰高 Peak Height 峰最大值到峰底的距离 峰宽 Peak Width 在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离 半（高）峰宽 Peak Width at Half Height 通过峰高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两侧相交两点之间的距离 液相色谱图相关术语液相色谱图相关术语 峰面积 Peak Area 峰与峰底之间

5、的面积,又称响应值 标准偏差； Standard Error 0.607倍峰高处所对应峰宽的一半 拖尾峰 Tailing Peak 后沿较前沿平缓的不对称峰 前伸峰 Leading Peak 前沿较后沿平缓的不对称峰 鬼峰 Ghost Peak 并非由试样所产生的峰；亦称假峰 液相色谱图相关术语液相色谱图相关术语 基线 Baseline 在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信号的曲线 基线飘移 Baseline Drift 基线随时间定向的缓慢变化 基线噪声；N Baseline Noise 由各种因素所引起的基线波动 谱带扩展 Band Broadening 由于纵向扩散,传质阻力等因素

6、的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象 液相色谱图相关术语液相色谱图相关术语 死时间，t0 Dead time 不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的时间 保留时间，tR Retention time 组分从进样到出现峰最大值所需的时间 死体积，V0 Dead volume 不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的流动相体积 保留体积，VR Retention volume 组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积 液相色谱应用：制备型液相色谱液相色谱应用：制备型液相色谱 分离及纯化样品是液相色谱原理的直接利用 对分离及纯化的要求 化合物的稳定性 样品的复杂性

7、制备量的要求 纯度的要求，及纯度的鉴定 方法的安全性 液相色谱应用：分析型液相色谱液相色谱应用：分析型液相色谱 定量分析主要基于与标准品的比较 是其最大应用领域 定性分析；不是色谱的强项 基于样品的保留时间比较 借助于和其联用的紫外、质谱或其他检测器 对定量及定性分析的要求 灵敏度、精度及准确度的要求 样品量的要求；复杂样品的分析能力 容易使用 液相色谱原理液相色谱原理 基本概念及方法开发基本概念及方法开发 液相色谱实验所需的基本参数 流动相：种类及配比，等度或梯度 固定相：色谱柱类型及内径、长短 流动相输送系统参数：流速 检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等 温度控制 进样量 以上参数即构成一

8、个具体的HPLC方法；亦称色谱条件 评价液相色谱方法的标准评价液相色谱方法的标准 问题：什么样的分离结果是好的？分离度？ 什么是色谱的分离度什么是色谱的分离度 分离度的公式： )(211212WWVVRR：分离程度的量度 影响分离度的因素：影响分离度的因素：K、及及N 分离度方程： K 是容量因子，表达了被分离组分与柱填料之间作用的强弱 是分离因子，描述两个被分离组份分离的好坏程度，是化学因素 N 是理论塔板数，描述色谱峰谱带展宽的程度 411 NkkR若若 N 增加增加 2倍倍 或或 3倍倍 , R会如何变化会如何变化? 1141RN 分离度方程解析：柱效项分离度方程解析：柱效项 N 理论塔

9、板数：分离效率的量度理论塔板数：分离效率的量度 1600 N.5516 NWV16N22100N2516NWV16N22PW = .5 PW = 2 色谱柱的柱效色谱柱的柱效 N N 理论塔板数计算公式： W s 方法 Wtan 16 切线法 Wh 5.54 半峰高 W3s 9 3s W4s 16 4s W5s 25 5s 21WVNs峰宽与塔板数的关系峰宽与塔板数的关系 2000400060008000050100150200250300理论塔板数理论塔板数 峰宽（峰宽（ L） k 2，Vo 1000 L 塔板数与流速的关系塔板数与流速的关系 流速（流速（cm/min） 塔板数塔板数 103

10、 123456789101112131415051015变化结果塔板数 % N N 73% 54.73000 3000N 41% 44.72000 2000N 31.61000 1000N 73% 122.415,000 15,000N 41% 10010,000 10,000N 70.7 5,000 5,000N 分离度与分离度与 N 的关系的关系 1N41R1分离度方程解析：分离因子项分离度方程解析：分离因子项 若若 = 1.1 or 1.4，R 会如何变化？会如何变化？ 分离因子：峰分离程度的量度分离因子：峰分离程度的量度 VVVV k k 01021V2V 或 3.5 - 1.5 -

11、2 2V 9 .5 - 1.5 - 5 3V V1 V2 V3 V0 时间 0.5 1 2 5 分离因子：分离因子： 定义： =1 时两组分分不开， 改变的途径 改变固定相或改变流动相 改变温度 改变样品的本身性质 120102 kkttttRR1R通过改变流动相改变，同样强度的不同溶剂 改变色谱柱 改变分离因子改变分离因子 的例子的例子 62:38 / 42:58 / 72:28 / 2322OHCNCHOHMeOHOHTHF若若 = 1, 2, 10 or 20, R会如何变化会如何变化? 1N141R分离度方程解析：容量因子项分离度方程解析：容量因子项 K 容量因子：保留能力的量度容量因

12、子：保留能力的量度 0011VVV k1.5.5 - 1 k 1V 9.5.5 - 5k 3V V0 V1 V2 V3 时间 0.5 1 2 5 k 值值 k 项项 k 对对分离度影响分离度影响 0 0 0 1 1/2 .50 2 2/3 .67 3 3/4 .75 10 10/11 .91 20 20/21 .95 容量因子容量因子 k 与分离度与分离度的关系的关系 与 R 的关系 容量因子容量因子 k 与峰高的关系与峰高的关系 改变 k 值的方法： 调节流动相的极性、pH、离子强度等 梯度淋洗 改变容量因子改变容量因子 K 的例子的例子 60/4050/5040/60 谱图 、k k 及及

13、 N N 如何控制分离度如何控制分离度 液相色谱原理液相色谱原理 更进一步的探讨更进一步的探讨 离子型化合物的分离方式 多数化合物是离子型的！ 使用离子交换柱：离子交换法 主要用于“强”阴、阳离子 使用反相柱 离子抑制色谱法：通过改变流动相的pH值，使样品成中性 离子对色谱法：加入“对离子”，使样品呈中性 离子抑制色谱离子抑制色谱 离子型化合物在反相色谱柱上不保留 改变流动相的pH值，抑制样品离子的电离 主要适用于弱酸性化合物的分离 降低流动相的pH值，使样品降低离子化 使用硅胶基质C18填料 使用条件应在填料基质的范围内 硅胶柱的pH在2-8（较保险值3-7）内 离子抑制色谱实例离子抑制色谱

14、实例 而在乙腈/水并且pH=7时，多数组份保留时间很短，无法完全分离。 CHOOHOCH3COONaCHOCOOHOCH31234离子抑制色谱的使用范围离子抑制色谱的使用范围 下列情况下不能使用离子抑制方法，如果： 一些酸在pH低于2时还保持离子化 一些碱在pH高于7时还保持离子化 可以有以下的选择 离子交换色谱 使用聚合物或其他耐碱性流动相的反相柱，在pH高于7时用离子抑制法 使用“离子对色谱法” 在高在高pH值下用离子抑制值下用离子抑制 色谱柱：D18-613(聚合物基质)，室温 流动相：乙腈/0.01M NH4OH + 0.01M TBA 流 速：1.0ml/min 检 测：UV-240

15、nm 样 品：巴比妥的衍生物 巴比妥 己琐巴比妥 甲基苯巴比妥 速可巴比妥 离子对色谱法离子对色谱法 在反相色谱流动相内加入“离子对”试剂 与样品中可电离的组份形成“对离子” 在反相色谱柱上分离离子型化合物 离子对试剂的类型： 磷酸季丁铵（PIC A），适用于弱酸 烷基磺酸盐（PIC B），适用于弱碱 烷基长度不同，形成对离子的能力不同 通常有：B5，B6，B7，B8 后面的数字是碳链的长度 磷酸二丁胺（PIC D4），适用于弱碱 离子对色谱机理离子对色谱机理 使用五烷基磺酸盐使用五烷基磺酸盐 Packing: Bondapak C18 Column: 4 mm ID x 30cm Solve

16、nt: Methanol/H2O with 0.005M PENTANE Sulfonic Acid & 1% HOAc (50/50) Flow Rate: 2.0 ml/min Detector: UV, 254 nm, 0.1 AUFS 1. Maleic Acid 2. Phenylephrine - HCl 3. Phenylpropanolamine - HCl 4. Naphazoline - HCl 5. Phenacetin 6. Pyrilamine Maleate 使用六烷基磺酸盐使用六烷基磺酸盐 Packing: Bondapak C18 Column: 4 mm ID

17、 x 30cm Solvent: Methanol/Water with 0.005M HEXANE Sulfonic Acid & 1% HOAc (50/50) Flow Rate: 2.0 ml/min Detector: UV, 254 nm, 0.1 AUFS 1. Maleic Acid 2. Phenylephrine - HCl 3. Phenylpropanolamine - HCl 4. Naphazoline - HCl 5. Phenacetin 6. Pyrilamine Maleate 用离子对、还是用离子抑制方法？用离子对、还是用离子抑制方法？ 开发液相色谱方法的

18、考虑因素开发液相色谱方法的考虑因素 分离度是色谱分离中主要考虑的因素 除分离度之外，在开发色谱方法时，以下几个因素也都要考虑： 灵敏度 载样量 分析速度 溶剂损耗 成本 容易使用 色谱柱寿命 效率 基本的基本的HPLC系统系统 溶剂 色谱泵色谱泵 自动进样器 HPLC色谱柱 检测器检测器 废液 数据处理系统数据处理系统 色谱泵及液相色谱对泵的要求色谱泵及液相色谱对泵的要求 稳定平滑并且重现性好的流速 可靠且充分的溶剂混合 准确及重现的自动溶剂混合 准确及重现的梯度形成 有效的流速范围 制备色谱或微柱、窄柱色谱更为关注 滞后体积 仅仅应用于梯度实验 目的：在任何情况下保持最高精度 梯度：高压混合

19、梯度：高压混合 高压梯度 使用多台色谱泵，在泵后混合 配置灵活、简单，脱气简单 易调节梯度的滞后体积 梯度：低压混合梯度：低压混合 低压梯度 用单泵产生梯度，泵前（低压端）混合 对脱气要求高 不易调节梯度的滞后体积 如设计不当，梯度的 准确性受影响 滞后体积（系统 体积）设计合理 梯度滞后：系统体积的影响 死体积/谱带展宽体积(无色谱柱时) 滞后(系统)体积 滞后(系统)体积 溶剂输送系统(泵) 检测器 进样器 色谱柱色谱柱 梯度混合器 溶剂输送系统(泵) 高压梯度 注意注意滞后体积包括进样器、阻尼滞后体积包括进样器、阻尼 器、混合器及其管路器、混合器及其管路 比例阀 检测器 进样器 A B

20、C D 色谱柱色谱柱 溶剂输送系统(泵) 低压梯度 阻尼器 混合器 梯度滞后大小的影响梯度滞后大小的影响 滞后体积太大会引起梯度变化的延迟 例如：滞后体积为2.0ml，流速1.0ml/min 实际梯度会比设置值晚 2 分钟响应，没有问题 对微柱色谱影响更大，同上例但流速0.1ml/min 实际梯度会比设置值晚20 分钟响应，不能接受 滞后体积的不同会使方法转换麻烦 滞后体积比文献大或小都会使方法不能重现 滞后体积的变化会导致梯度重现性不好 普通分析型液相色谱的滞后体积为24ml 滞后体积变化的影响滞后体积变化的影响 设计不好的HPLC系统，滞后体积随反压变化 滞后体积随反压变化的后果： 梯度的

21、准确性不好，造成：方法的适应性不好 用静态梯度混合器；固定滞后体积可明显改善梯度特性 梯度百分比 保留时间 梯度曲线 好的梯度 滞后曲线 保留时间 梯度百分比 不好的梯度 滞后曲线 固定滞后体积，改善了梯度性能 普通的低压梯度系统 色谱柱反压变化对梯度实验的影响色谱柱反压变化对梯度实验的影响 P680A LPG without pulse damper Back-pressure: 60 bar, 85 bar and 105 bar Variation: 2% Acclaim 120, C18, 5 m, 4.6 x 100 mm; 0.5 mL/min; 25C; 5 L injectio

22、n volume; UV detection at 256 nm; Eluent (A) Water and (B) Acetonitril; Gradient: 30 % b to 100 % B in 10 min; Methyl-, Ethyl-, Propyl- and Butylparabene, 10 mg/L each 液相色谱的检测器液相色谱的检测器 常规检测器 示差折光检测器（Refractive Index） 紫外/可见光吸收检测器（UV-Vis） 荧光检测器（Fluorescence） 蒸发光散射检测器（Evaporative Light Scattering） 其他检测

23、器（Other Detectors） 高端检测器 光电二极管矩阵检测器（Photodiode Array） 质谱检测器（Mass Spectrometry） HPLC检测器应提供的功能检测器应提供的功能 对样品有响应并有一个输出信号 应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性关系；并且所设计的校正技术应该促进这种关系 但是：但是： 由于受HPLC系统其他部件的影响会产生响应与浓度之间关系的与线性偏离现象 并不是所有的检测器是线性的 受HPLC系统其他部件的影响，检测器的表现可能与其最佳水平有较大的差距 用于用于HPLC的检测器的检测器 没有任何一种单独的检测器可以适应所有的液相色谱分离！ HP

24、LC检测器可以分为：检测器可以分为： 溶质性质检测器（Solute property detectors） 对溶质的物理或化学性质响应，一般不反应流动相的变化（选择型） 整体性质检测器（Bulk property detectors） 不管是否有溶质，对流动相任何物理性质的变化作出响应（通用型） 不同种类的检测器的分类不同种类的检测器的分类 整体性质整体性质 示差折光检测器示差折光检测器 蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器 电导检测器电导检测器 溶质性质溶质性质 荧光检测器荧光检测器 固定波长固定波长 可变波长可变波长 光电二极管矩阵光电二极管矩阵 电化学检测器电化学检测器 放射化学检测器放射化

25、学检测器 氮氮/硫检测器硫检测器 质谱检测器质谱检测器 紫外紫外/可见光检测器可见光检测器 理想的理想的HPLC检测器检测器 高灵敏度；可忽略的基线噪音 宽的线性范围 独立于流动相及操作参数的响应 对压力、温度及流速等变化不敏感 长时间操作的稳定性 低死体积 非破坏性 选择性 灵敏度：信噪比灵敏度：信噪比 灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪音的比值（S/N） 检测限（LOD）：S/N = 3 定量限（LOQ）：S/N = 10 好的信噪比有利于： 更好的色谱峰确认 更好的定量 更好地完成色谱峰纯度/均一性 6:1 N S 方法开发的过程方法开发的过程 Adapted from: Snyd

26、er, L.R.; Kirkland, J.J.; Glajch, J.L; Practical HPLC Method Development 2nd Ed., Wiley-Interscience, New York, 1997, p. 2 1. 得到样品信息，确定分离目标得到样品信息，确定分离目标 2. 确定特定确定特定HPLC过程、样品预处理等的需求过程、样品预处理等的需求 3. 选择检测器及其条件选择检测器及其条件 4. 选择选择HPLC方法；初步分离；建立最佳分离条件方法；初步分离；建立最佳分离条件 5. 优化分离条件优化分离条件 6. 检查特定过程的问题及需要检查特定过程的问题及

27、需要 7. 定量校正定量校正 8. 日常使用的确认日常使用的确认 选择液相色谱的检测器选择液相色谱的检测器 要考虑的因素：要考虑的因素： 你要分离的化合物/样品的化学特性 化学结构、分子量及紫外光谱等等 流动相的影响（溶剂、缓冲盐改性剂等） 梯度还是等度 灵敏度需求 是否有双检测的需求 选择液相色谱的检测器选择液相色谱的检测器 通用检测器通用检测器 RI ELSD MS 灵敏度 mg ng pg 线性范围 104 否 103 流速敏感 是 否 是 温度敏感 是 否 否 破坏性 否 是 是 选择性检测器选择性检测器 ABS FL EC Cond MS 灵敏度 ng pg fg pg pg 线性范

28、围 105 103 106 105 103 流速敏感 否 否 是 是 是 温度敏感 否 否 是 是 是 破坏性 否 否 是 否 是 可供选择的液相色谱检测器可供选择的液相色谱检测器 Absorbance (UV/Vis) Chemiluminescence Circular Dichroism (Chiral) Conductivity Electrochemical Evaporative Light Scattering Fluorescence Laser Induced Florescence Laser Interferometer Laser Polarimeter Mass Sp

29、ectrometric (LC/MS) Nitrogen Specific Detector Nuclear Magnetic Resonance Offline Methods Optical Rotation Detector Photo Diode Array Refractive Index Radiochemical Sulfur Specific Detector Viscometry Multi Angle Light Scattering 示差折光（示差折光（Refractive Index）检测）检测 示差折光检测器（RI）是第一个商品化的液相色谱检测器（上世纪六十年代末、七

30、十年代初） 通常被认为是一种通用检测器 检测溶液中所有被溶解的溶质 非特异性 任何光学介质的折光率都被定义为光在该介质中与真空中的速度之比值 R S 示差检测器示差检测器 基本原理基本原理 检测基于被分析物的折光指数的差异 测量样品流路与参比流路在折光指数上的差别 当折光指数差异最大时灵敏度也达到最大 并不测量绝对的折光指数而是测定折光指数的差别（Differential RI） 典型的应用领域 没有紫外吸收、荧光的化合物，例如： 碳水化合物（Carbohydrates）、聚合物（Polymers） 脂肪酸（Fatty Acids）及油脂类（Lipids） 示差检测器的优、缺点示差检测器的优、

31、缺点 优点 通用检测器 容易使用；通常来说是比较耐用的检测器 维护成本低 缺点 灵敏度低、选择性差 对流速、温度及粘度的变化敏感 不能用于梯度方法 色谱峰可能是正的，也可能是负的 示差检测器的优点示差检测器的优点 通用性通用性 根据随机统计；任何一对液体都会有大约0.07的折光率差异 因此；除非正好被分析的样品与溶液的折光指数完全相同，都会被检测到 Separation of Lactose-Reduce Milk MV -20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 Minutes 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.

32、0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 葡萄糖 乳糖 半乳糖 示差检测器的缺点示差检测器的缺点 灵敏度灵敏度 缺乏灵敏度缺乏灵敏度 和其他检测器相比，和其他检测器相比，RI检测器一般灵敏度较低检测器一般灵敏度较低 UV254 nm S/N 15000:1 MV -30.00 -25.00 -20.00 -15.00 -10.00 -5.00 0.00 5.00 10.00 15.00 Minutes 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 AU 0.00 0.

33、02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 Refractive Index S/N 125:1 流动相： MeOH/H2O 60:40 流速： 1.0 mL/min 色谱柱： C18 色谱柱温：30 C 检测温度：35 C 样品： Paraben Mixture 示差检测器的缺点示差检测器的缺点 不适宜作梯度不适宜作梯度 流动相： A= CH3CN/H2O 75:25 B= CH3CN 流速： 1.4 mL/min 色谱柱： NH2 色谱柱温： 30 C 检测温度： 35 C MV -2600 -2400 -2200 -2000 -1800 -1600 -1400 -1

34、200 -1000 -800 -600 -400 -200 0 200 400 Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 0% B 25 % B Chromatography Forum: Is RI with a Reverse Phase gradient possible? By XXXXXXXXX: I have a good separation of a multi-substituted, cyclohexane that fully resolves 12 different oligomers. I can dete

35、ct the components by MS, but I would like to use a standard LC detector instead. There is virtually no adsorption above 230nm and below 230nm picks up solvent interference. Im considering using RI detection and afterward subtracting a blank run. Is there any hope of this working or would I be wastin

36、g my time? http:/ 示差检测器的缺点示差检测器的缺点 对温度敏感对温度敏感 流动相 甲醇 0.25mL / minute 检测器温度 35C；没有使用柱温箱 Temp.(Deg C) 18.5 19.0 19.5 20.0 MV -1.00 0.00 1.00 2.00 Minutes 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 室温变化 RI 基线 吸光度（吸光度（Absorbance UV/Vis）检测）检测 目前实验室中最流行的选择 多数公司约75%的检测器是吸光度检测器（其中50%是多波长，25%是PDA） 测量通过溶液后的紫

37、外或可见光光强度的损失 吸光度与样品浓度呈线性关系 在被测物的最大吸收波长处检测时灵敏度最大 吸光度检测器（吸光度检测器（UV/Vis） 优点优点 这种检测器简单、可靠 多数人熟悉并喜欢这种技术 可以作梯度实验并且是非破坏性的 大多数有机化合物有一定程度的吸光度 一般来说灵敏度还可以 AU 0.00 0.05 0.10 0.15 Minutes 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 Parabens at 254 nm 吸光度检测器（吸光度检测器（UV/Vis） 缺点缺点 由于不是所有化合物都有吸光度，因此不是通

38、用检测器 对某些化合物的检测灵敏度不及其他检测器 样品中不同化合物的最大吸收波长不同时，需要使用多波长检测，或使用折衷的波长 受流动相组成的影响： 用截止波长以上至少510nm作为工作波长 缓冲盐、离子对试剂、胺改性剂也会有影响 背景吸收的影响背景吸收的影响 背景吸收降低了线性范围 多数流动相有紫外吸收 实际 浓度浓度 理想 1 0 吸光度吸光度 2 1 0 背景吸收背景吸收 背景吸收对紫外检测器噪音的影响背景吸收对紫外检测器噪音的影响 UV Spectrum of Eluents with 0.1% TFA Against HPLC Grade H2O Blank AU 0.00 0.10

39、0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30 1.40 1.50 nm 200.00 210.00 220.00 230.00 240.00 250.00 260.00 270.00 280.00 290.00 H20 with 0.1% TFA 50% ACN with 0.1% TFA 溶剂混合的基线噪音溶剂混合的基线噪音 色谱条件色谱条件 色谱柱： C18, 5 m, 3.9x150mm at 35 C. 流动相： A: 0.1% TFA in Water. B: 0.1% TFA in Acetonitrile.

40、 梯度： 5 - 40% B in 35 min. 流速： 1.0 mL/min. 样品： 水（10 L inj. vol.） 检测： 214 nm 图1；好的梯度系统 图2；一般的二元梯度系统 图3；一般的四元梯度系统 为何如此重要？为何如此重要？ 五个小肽的5ng进样，好的色谱系统非常容易鉴别出所有峰。在不好的色谱系统中，第一个峰则消失在基线噪音中。 基线噪音对积分的影响基线噪音对积分的影响 1.224 1.183 1.183 Caffeine 271 nm 荧光（荧光（Fluorescence）检测检测 发荧光的化合物吸收光（UV或VIS），其分子达到激发态，其返回到基态时发射光的现象即

41、荧光 基态 激发态 S1 S0 激发 （1） 振动能（2） 发射 （3） 1. 分子在吸收UV或可见光后进入激发态，分子达到不稳定的高能量状态。 2. 电子失去过剩的能量成为振动能，并达到最低的激发单重态。 3. 电子失去能量达到基态时发出荧光 共轭及芳香族化合物最容易有荧光现象 荧光检测器原理荧光检测器原理 荧光检测器的应用荧光检测器的应用 环境中的污染物 多环芳烃(PAH)，多酚，氨基甲酸酯等 食品、饮料 食品中的毒素；例如：黄曲霉毒素 染料 维生素及衍生氨基酸 生物技术及制药 氨基甲酸酯类杀虫剂 OOOOOOCH3黄曲霉毒素 多环芳烃（PAH） OHCH3CH3CH3CH3CH3维生素

42、OOONHCH3CH3CH3荧光检测器的优点荧光检测器的优点 选择性提高 灵敏度提高（在 pg/fg 范围） 低背景技术 mV -0.10 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 Minutes 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 6.894 9.639 OONHCH3CH3OOCH3NH2MDA及及MDMA 柱上柱上200pg Excitation =280 Emission =360 荧光检测器的缺点荧光检测器的缺点 不是所有化合物都有荧光，需要衍生 检测器对溶解气体及其他淬灭物质（如甲醇）敏感 对Ex及Em

43、的最佳，易受温度、溶剂的极性和粘度、溶剂的pH值及样品浓度影响 多数仪器的批次间差异较大，同一型号的不同荧光检测器会得到不同的结果。 有的仪器信号及噪音大于另一台23倍，光电倍增管的特征是导致这个现象的原因。 溶剂中溶解的气体对响应值的影响溶剂中溶解的气体对响应值的影响 Minutes Column - PAH Column 27 C Eluent A: Water Eluent B: Acetonitrile Gradient: 60% B to 100% B using curve 9 in 12 minutes Hold 11 minutes Back to initial condit

44、ions Flow Rate 1.2 ml/min Injection: 20ul Time programmed wavelength changes 20.5 21.0 22.0 1000 MV 充分脱气 未充分脱气 Fluorescence Detector 1 2 3 1. Benzo(b)flouranthene - 400 ppb 2. Benzo(k)fluoranthene - 200 ppb 3. Benzo(a)pyrene - 200 ppb 浓度对芘（浓度对芘（Pyrene）最大激发波长的影响）最大激发波长的影响 Emission Excitation 103 M 10

45、 5 M 在正己烷中 From: Turro, N.J., Modern Molecular Photochemistry Menlo Park CA, Benjamin/Cummings Publishing, 1978 蒸发光散射（蒸发光散射（Evaporative Light Scattering） 用氮气把流动相吹成细雾状 流动相的液滴通过一个预加热的腔体后被蒸发掉 蒸发的溶剂被从检测器中除去 溶质的挥发性小于流动相，因此产生颗粒束与光束相交 被颗粒散射的光由光电倍增管（PMT）收集 PMT的输出与溶质的存在量呈比 例关系 蒸发光散射检测器原理蒸发光散射检测器原理 Evaporativ

46、e Light Scattering 简称：ELSD ELSD 优点及应用领域优点及应用领域 通用型 比流动相挥发性小的物质都能被检测 可以作梯度实验；检测下限可到纳克级水平 对环境条件不敏感；可以使用有强紫外吸收的溶剂作流动相 应用领域： 碳水化合物 油脂及脂肪酸 未衍生的氨基酸 制药行业 表面活性剂 天然产物 ELSD 缺点缺点 不能使用不挥发性的流动相（例如：磷酸盐） 要求使用雾化气源（典型的是氮气） 不同的色谱条件下雾化及除溶剂的参数需要重新优化 破坏性技术 蒸发出的溶剂要因到户外或通风橱里 对挥发性化合物的检测不理想 一般得到的是非线性校正曲线 某些化合物的检测灵敏度不如其他检测器

47、光电二极管矩阵（光电二极管矩阵（Photo Diode Array） Photo Diode Array 简称：PDA或DAD PDA检测器检测器 特点特点 三维水平的吸光度检测器三维水平的吸光度检测器 AU0.0000.0020.0040.0060.0080.0100.0120.0140.0160.0180.0200.0220.0240.0260.0280.0300.032nm200.00220.00240.00260.00280.00300.00320.00283.5240.9245.6AU0.0000.0050.0100.015Minutes2.002.503.003.504.004.5

48、05.005.506.006.507.002.1934.3106.448二极管矩阵检测器是在1982年首度出现的 在整个UV-Vis带宽上检测吸光度 都需要相应的软件进行数据的分析 PDA检测器的用途及要求检测器的用途及要求 光电二极管检测器可以提供许多又用的功能 光谱信息 色谱峰纯度 谱库拟合 像其他所有的UV/Vis检测器一样，需要： 高的信噪比；好的线性 另外；还需要： 光学分辨率 光谱灵敏度及光谱分析软件 光学分辨率（带宽）光学分辨率（带宽） 好的光谱分辨率可得到高质量的光谱信息好的光谱分辨率可得到高质量的光谱信息 230.00 250.00 270.00 nm Benzene 3.0

49、nm vs 1.0nm 损失分辨率，UV最大波长移动 1.0 nm 3.0 nm 190 nm 5.0 nm 分辨率与色谱性能分辨率与色谱性能 高分辨率给出更多数据点（同样波长范围） 高分辨率有更好的线性 低分辨率的数据文件尺寸较小 宽的光学带宽可以得到更高的光通量（灵敏度） AU0.0000.0010.002nm250.00300.00266.2AU0.0000.0010.0020.003nm250.00300.00271.5312.11.2 nm 14.4 nm PDA的优点及缺点的优点及缺点 优点 通用的UV/Vis检测 好的选择性、线性 提供色谱峰的UV/Vis光谱图（峰确认） 可提供

50、纯度估计 缺点 低光学通量（较窄的带宽通量） 与普通UV/Vis相比更复杂，容易漂移 灯输出能量随时间降低 质谱（质谱（Mass Spec.）作为）作为HPLC检测器检测器 m/z +/- MS： 质谱（Mass Spectrometry）是一种按照分子量及其电荷分离物质的技术，经过多年的不断开发及改进，已经使质谱成为一种多功能、高灵敏度，并被愈来愈广泛使用的分析技术。 LC/MS： 液相色谱与质谱的连用。需要：需要： 除去HPLC的溶剂；产生离子；分离离子；检测离子；计算离子强度；处理数据 除去溶剂除去溶剂 离子化前的准备：离子化前的准备： 1.雾化（Nebulization） 2.蒸发溶剂

51、或解吸附（Evaporation/ or Desorption） 3.大气压下或减压下（Atmosphere or Pressure reduction） 4.离子化（Ionization Ion Source） Liquid Gas LC MS Co(l) C+/-(l) C+/-(g) Co(g) Evaporation Desorption LC/MS Interface LC-MS的离子产生的离子产生 电子轰击源（Electron Impact / Electron Ionization EI） 大气压电离源（Atmospheric Pressure Ionization API） 大

52、气压化学电离源（Atmospheric Chemical Ionization APCI） 电喷雾源（Electrospray ESI） 200 300 400 500 600 700 800 m/z 529 527 233 489 543 APCI(-): 40V 100 200 300 400 500 m/z 57 97 147 219 278 515 530 EI OHCH3CH3CH3CH3CH3CH3OO(CH2)17CH3LC-MS技术的应用技术的应用 10 410 210 110 310 5LCGC PolarityMolecular WeightVolatilityLCGCEl

53、ectrospray (ESI)APCIEIGC不同离子源的流速范围不同离子源的流速范围 Flow rate, mL/min 0 0.5 1.0 1.5 2.0 50 100 Relative intensity APCI Pneumatically assisted ESI Pure ESI 流速对API源的影响 Intensity1x1062x1063x1064x1065x1066x1067x1068x106Minutes2.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.00色谱的数据类型色谱的数据类型 采集类型：采集类型： 单离子模式（SIR） 扫描模式（S

54、can） 总离子流（TIC或BPC） ESI +ve 180-400 m/z TIC ESI -ve 180-400 m/z TIC 极性切换：极性切换： 正离子 负离子 离子排序及检测离子排序及检测 离子排序方式 四极杆（Quadrupole） 离子阱（Ion Trap） 飞行时间（Time of Flight） 磁质谱（Sector Mass Analyzers） 富里叶变换（Fourier Transform） 检测方式 电子倍增 光电倍增 液相色谱的分离依然重要液相色谱的分离依然重要 02004006008001000120014001600180002004006008001000M

55、olecular WeightFrequency of Occurrance标称分子量在250的化合物的数量超过了1500！ Adapted from: R. Willoughby et al A Global View of LC/MS, 1998 液相色谱的分离依然重要液相色谱的分离依然重要 Intensity0.05.0 x1051.0 x106294.20Intensity0500000294.20Intensity01x1062x106m/z240.00250.00260.00270.00280.00290.00300.00310.00320.00278.22Intensity3x1

56、064x1065x106Minutes0.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.002.4592.8039.5722.60 min 2.80 min 9.60 min trans-10-hydroxyamitriptyline (EHAT) cis-10-hydroxyamitriptyline (ZHAT) amitriptyline 其他重要的检测器其他重要的检测器 电化学检测器 Electrochemical 电导检测器 Conductivity W R C 有机及无机离子 儿茶酚胺 Catecholamines 亚硝胺 Nitrosamine

57、s 有机酸 Organic acids 碳水化合物 Carbohydrates 氨基酸 Amino Acids 特殊的检测器特殊的检测器 N2/S2 Radiochemical NMR 液相色谱对数据处理最基本的要求液相色谱对数据处理最基本的要求 数据的采集 数据的处理 数据的报告 液相色谱的数据处理及其要求液相色谱的数据处理及其要求 色谱数据处理系统色谱数据处理系统 一般用户所期望的更多功能一般用户所期望的更多功能 仪器控制 采集二维数据及GC的数据 可靠且强壮 服务与支持 用户培训 从基本要求的基础上扩展从基本要求的基础上扩展 色谱数据处理系统色谱数据处理系统 能使用先进的检测方式及特殊应

58、用能使用先进的检测方式及特殊应用 光电二极管矩阵（PDA）、质谱（MS）检测 不同领域的应用及其特殊计算 从基本要求的基础上扩展从基本要求的基础上扩展 色谱数据处理系统色谱数据处理系统 色谱数据管理及用户自定义计算、自定义报告色谱数据管理及用户自定义计算、自定义报告 自定义文档字段 用户自定义报告 搜索能力 排序能力 综合计算 从基本要求的基础上扩展从基本要求的基础上扩展 色谱数据处理系统色谱数据处理系统 网络及系统管理能力网络及系统管理能力 配置规模可扩展 灾难防御与恢复 系统安全性 开放结构 存档功能 从基本需求的基础上扩展从基本需求的基础上扩展 色谱数据处理系统色谱数据处理系统 法规遵从法规遵从 支持GXP所要求的工具 软件的确认（Qualification） 支持电子记录 支持电子签名 从基本需求的基础上扩展从基本需求的基础上扩展 色谱数据处理系统色谱数据处理系统