实验培养基的配制、消毒与灭菌

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1、实 验 二 培 养 基 的 制 备 消 毒 与 灭 菌 培 养 基 配 制 实 验 原 理v培 养 基 是 人 工 配 制 的 适 合 微 生 物 生 长 繁殖 或 积 累 代 谢 产 物 的 营 养 基 质 。v人 工 制 备 培 养 基 的 目 的 ， 在 于 给 微 生 物创 造 一 个 良 好 的 营 养 条 件 。 培 养 基 配 制 要 素v营 养 ： 碳 源 、 氮 源 、 能 源 、 生 长 因 子 、 水 分 和无 机 盐 ；v适 宜 的 酸 碱 度 (pH值 )和 一 定 缓 冲 能 力 ；v一 定 的 氧 化 还 原 电 位 ；v合 适 的 渗 透 压 。 培 养 基 的

2、 分 类 根 据 微 生 物 的 种 类 和 实 验 目 的 的 不 同 ，培 养 基 分 类 可 以 按 以 下 方 式 ： 按 成 分 的 不 同 分 按 培 养 基 的 物 理 状 态 分1. 按 培 养 基 的 用 途 分 按 照 培 养 基 的 成 分 来 分v天 然 培 养 基 :主 要 成 分 是 复 杂 的 天 然 有 机 物 质v合 成 培 养 基 :用 化 学 成 分 完 全 了 解 的 纯 化 合 物 药品 配 制 而 成 的 培 养 基v半 合 成 培 养 基 :以 天 然 有 机 物 作 为 微 生 物 营 养 来源 的 同 时 ， 适 当 补 充 一 些 成 分 已

3、 知 的 化 学 药 品所 配 制 的 培 养 基 按 照 培 养 基 的 物 理 状 态v固 体 培 养 基 ： 加 入 凝 固 剂 ， 如 1.5% 2.0%琼 脂v半 固 体 培 养 基 ： 加 入 少 量 凝 固 剂 ， 如 0.2% 0.7%琼 脂v液 体 培 养 基 ： 不 含 任 何 凝 固 剂 按 照 培 养 基 的 用 途 分v基 础 培 养 基v营 养 培 养 基 （ 加 富 培 养 基 ）v鉴 别 培 养 基 ： 含 有 特 定 化 合 物 或 试 剂 。 某 种 微生 物 在 这 种 培 养 基 上 培 养 后 ， 它 所 产 生 的 某 种代 谢 产 物 与 这 种

4、特 定 的 化 合 物 或 试 剂 能 发 生 某种 明 显 的 特 征 性 反 应 ， 根 据 这 一 特 征 性 反 应 可以 将 某 种 微 生 物 与 他 种 微 生 物 区 别 开 来 。v选 择 培 养 基 ： 利 用 微 生 物 对 某 种 化 学 物 质 的 敏感 性 不 同 ， 在 培 养 基 中 加 入 这 类 物 质 ， 抑 制 不需 要 的 微 生 物 生 长 ， 而 利 用 所 需 分 离 的 微 生 物生 长 ， 从 而 达 到 分 离 或 鉴 别 某 种 微 生 物 的 目 的 。 培 养 基 灭 菌v配 制 培 养 的 各 类 营 养 物 质 和 容 器 等 含

5、 有各 种 微 生 物v微 生 物 生 长 繁 殖 ： 消 耗 养 分 改 变 培 养 的 酸 碱 度 产 生 毒 素 或 者 抑 制 物 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 的 制 备应 用 最 广 泛 的 细 菌 基 础 培 养 基 ， 普 通 培 养 基v牛 肉 膏 ： 3 gv蛋 白 胨 ： 10 gvNaCl： 5 gv琼 脂 ： 15-20 gv水 ： 1000 mLvpH ： 7.47.6 马 铃 薯 培 养 基 （ PDA） 的 制 备用 来 培 养 真 菌v马 铃 薯 ： 200 gv蔗 糖 （ 葡 萄 糖 ） 20 gv琼 脂 ： 15-20 gv水 ： 1000 mLvp

6、H ： 自 然马铃薯去皮，切成块煮沸30分钟，然后用纱布过滤；滤液中加入糖和琼脂，溶化后补足水至1000 mL。 高 氏号 培 养 基 的 制 备用 来 培 养 放 线 菌v可 溶 性 淀 粉 ： 20 gvKNO3： 1 gvNaCl： 0.5 gvK2H PO43H 2O： 0.5 g vMgSO 47H 2O： 0.5 g vFeSO47H 2O： 0.01 gv琼 脂 ： 20 gv水 ： 1000 mLvpH ： 7.27.4 无 氮 培 养 基 的 制 备用 来 培 养 固 氮 菌v葡 萄 糖 ： 10 gvKH 2PO4： 0.2 g vMgSO47H 2O： 0.2 g vNa

7、Cl： 0.2 gvCaSO 42H 2O： 0.2 gvCaCO3： 5 gv琼 脂 ： 20 gv水 ： 1000 mLvpH ： 7.07.2 豆 芽 汁 培 养 基 的 制 备用 来 培 养 酵 母 菌v黄 豆 芽 ： 10 0 gv蔗 糖 （ 葡 萄 糖 ） ： 50 gv琼 脂 ： 20 gv水 ： 1000 mLvpH ： 自 然称取新鲜黄豆芽100 g，放入烧杯中加水煮沸约30 min，用纱布过滤。滤液中加入糖和琼脂，溶化后补足水至1000 mL，最后灭菌。 麦 氏 （ Meclary） 培 养 基 的 制 备用 来 培 养 酵 母 菌 ， 利 于 酿 酒 酵 母 子 囊 孢

8、子 的 形 成v葡 萄 糖 ： 1 gvKCl： 1.8 gv酵 母 浸 膏 ： 2. 5 g v醋 酸 钠 ： 8.2 g v琼 脂 ： 20 gv水 ： 1000 mLvpH ： 自 然 LB培 养 基 的 制 备用 来 培 养 细 菌v蛋 白 胨 ： 10 gv酵 母 膏 ： 5 gvNaCl： 10 gv琼 脂 ： 20 gv水 ： 1000 mLvpH ： 7.0 操作步骤称量溶化补足水分，调pH（过滤）分装6. 加塞7. 包扎8. 灭菌9. 搁置斜面10. 无菌检查 v称 量 药 品 时 ， 严 防 药 品 混 杂 。 称 完 一 种药 品 后 需 要 将 牛 角 匙 洗 净 、

9、擦 干 ， 再 称取 另 一 药 品 。 瓶 盖 也 不 要 盖 错 。v药 品 不 要 弄 错 。 如 ： K2H PO4和 KH 2PO4、水 合 形 式 和 无 水 形 式 的 化 合 物 要 注 意 分辨 。 v培 养 基 中 多 种 无 机 盐 可 能 相 互 作 用 而 产 生 沉 淀 。因 此 ， 在 混 合 培 养 基 成 分 时 ， 一 般 是 按 配 方 的顺 序 依 次 溶 解 各 成 分 ， 甚 至 有 时 还 需 要 将 二 种或 多 种 成 分 分 别 灭 菌 ， 使 用 时 再 按 比 例 混 合 。v对 于 微 量 成 分 ， 可 先 配 制 成 高 浓 度 的

10、 储 备 液 ，按 比 例 换 算 后 再 加 入 。v琼 脂 溶 化 过 程 中 ， 要 控 制 火 力 并 不 断 搅 拌 ， 以免 沸 腾 溢 出 或 琼 脂 糊 底 烧 焦 。v不 可 用 铜 或 铁 锅 加 热 溶 化 ， 以 免 离 子 进 入 培 养基 。 v调 pH 值 以 前 ， 先 补 足 水 分 。vpH 值 不 要 调 过 头 ， 以 免 回 调 影 响 个 离子 浓 度 。 v固 体 分 装 ： 不 超 过 试管 高 度 的 1/5； 不 超过 三 角 烧 瓶 容 积 的 一半 为 宜 。v分 装 过 程 中 ， 注 意 不要 使 培 养 基 沾 在 管（ 瓶 ） 口

11、 上 以 免 污 染棉 塞 而 引 起 污 染 。 v配 好 培 养 基 后 要 贴 上 标 签 ， 写 清 培 养基 类 型 、 组 别 、 配 制 时 间 。 消 毒 与 灭 菌v消 毒 是 一 般 指 采 用 物 理 、 化 学 和 生 物 的 方 法消 除 物 体 的 表 面 病 原 菌 和 有 害 微 生 物 营 养 体的 过 程 。v灭 菌 则 是 指 采 用 物 理 、 化 学 和 生 物 的 方 法 杀灭 一 切 微 生 物 的 营 养 体 、 芽 孢 和 孢 子 的 过 程 。v在 微 生 物 实 验 中 ， 需 要 进 行 纯 培 养 ， 不 能 有任 何 杂 菌 污 染

12、， 因 此 对 所 用 器 材 、 培 养 基 和工 作 场 所 都 要 进 行 严 格 的 消 毒 和 灭 菌 。 消 毒 与 灭 菌 方 法v加 热 灭 菌干 热 灭 菌湿 热 灭 菌v过 滤 除 菌v辐 射 灭 菌放 射 线 辐 照 灭 菌紫 外 线 灭 菌v化 学 药 品 灭 菌 干 热 灭 菌v干 热 灭 菌 是 利 用 高 温 使 微 生 物 细 胞 内 的 蛋 白 质凝 固 变 性 而 达 到 灭 菌 的 目 的 。v干 热 灭 菌 有 火 焰 灼 烧 灭 菌 和 热 空 气 灭 菌 两 种 。 v细 胞 内 蛋 白 质 的 凝 固 性 与 其 含 水 量 有 关 。 在 菌体

13、受 热 时 ， 当 环 境 和 细 胞 内 含 水 量 越 大 ， 则 蛋白 蛋 凝 固 就 越 快 ， 反 之 凝 固 缓 慢 。v因 此 ， 与 湿 热 灭 菌 相 比 ， 干 热 灭 菌 所 需 温 度 要高 （ 160 170 ） ， 时 间 要 长 （ 1 2h） ， 但干 热 灭 菌 温 度 不 能 超 过 180 ， 否 则 ， 包 器 皿的 纸 或 棉 塞 就 会 烧 焦 ， 甚 至 引 起 燃 烧 。 高 压 蒸 气 灭 菌v高 压 蒸 气 灭 菌 是 将 待 灭 菌 的 物 品 放 在 一 个 密 闭 的 灭 菌 锅内 ， 通 过 加 热 ， 使 灭 菌 锅 隔 套 间 的

14、 水 沸 腾 而 产 生 蒸 汽 。待 水 蒸 气 急 剧 将 锅 内 冷 空 气 从 排 气 阀 中 趋 尽 ， 关 闭 排 气阀 ， 继 续 加 热 。 由 于 水 蒸 气 无 法 排 出 ， 增 加 了 灭 菌 锅 内的 压 力 ， 从 而 使 沸 点 增 高 ， 得 到 高 于 100 的 温 度 。 导致 菌 体 蛋 白 质 凝 固 变 性 而 达 到 灭 菌 目 的 。v一 般 培 养 基 在 0.1 MPa下 ， 121 维 持 15 30 min可 达 到彻 底 灭 菌 的 目 的 。 灭 菌 的 温 度 及 维 持 的 时 间 随 灭 菌 物 品的 性 质 和 容 量 等 具

15、 体 情 况 而 有 所 改 变 。 在 同 一 温 度 下 ， 湿 热 的 杀 菌 效 力 比 干 热 大 。其 原 因 有 三 ：一 是 湿 热 中 细 菌 菌 体 吸 收 水 分 ， 蛋 白 质 较 易 凝 固 ，因 蛋 白 质 含 水 量 增 加 ， 所 需 凝 固 温 度 降 低 ；二 是 湿 热 的 穿 透 力 比 干 热 大 ；三 是 湿 热 的 蒸 气 有 潜 热 存 在 。 1 g水 在 100 时 ， 由 气 态 变 为 液 态 时 可 放 出 2.26 kJ(千 焦 )的 热 量 。 这 种 潜 热 ， 能 迅 速 提 高 被 灭 菌物 体 的 温 度 ， 从 而 增 加

16、 灭 菌 效 力 。 在 使 用 高 压 蒸 气 灭 菌 锅 灭 菌 时 ， 灭 菌 锅 内 冷 空气 的 排 除 是 否 完 全 极 为 重 要 ， 因 为 空 气 的 膨 胀压 大 于 水 蒸 气 的 膨 胀 压 ， 所 以 ， 当 水 蒸 气 中 含有 空 气 时 ， 在 同 一 压 力 下 ， 含 空 气 蒸 气 的 温 度低 于 饱 和 蒸 气 的 温 度 。 当 含 盐 类 的 液 体 和 含 盐 的 琼 脂 中 大 量 的 盐 类 泼洒 在 工 作 腔 体 ， 要 立 即 换 水 ， 冲 洗 腔 体 ， 仔 细擦 干 锅 盖 垫 圈 上 的 水 滴 。 否 则 它 们 会 带 来

17、 腐 蚀和 变 质 。 要 检 查 压 力 表 上 的 指 数 为 “ 0 MPa” 后 才 能 打开 锅 盖 。 外 来 物 质 （ 金 属 、 液 体 ） 不 能 堵 塞 通 风 孔 ， 否则 会 引 起 装 置 故 障 、 起 火 、 短 路 。 过 滤 除 菌 过 滤 除 菌 是 通 过 机 械 作 用 滤 去 液 体 或 气 体中 细 菌 的 方 法 。 根 据 不 同 的 需 要 选 用 不 同的 滤 器 和 滤 板 材 料 。 此 法 除 菌 的 最 大 优 点 是 可 以 不 破 坏 溶 液 中各 种 物 质 的 化 学 成 分 ， 但 由 于 滤 量 有 限 ，所 以 一 般

18、 只 适 用 于 实 验 室 中 小 量 溶 液 的 过滤 除 菌 。 紫 外 线 灭 菌l紫 外 线 灭 菌 是 用 紫 外 线 灯 进 行 的 。 波 长 为 200300 nm的 紫 外 线 都 有 杀 菌 能 力 ， 其 中 以 260nm的 杀 菌力 最 强 。l在 波 长 一 定 的 条 件 下 ， 紫 外 线 的 杀 菌 效 率 与 强 度 和时 间 的 乘 积 成 正 比 。l紫 外 线 杀 菌 机 理 主 要 是 因 为 它 诱 导 了 胸 腺 嘧 啶 二 聚体 的 形 成 和 DNA链 的 交 联 ， 从 而 抑 制 了 DNA的 复制 。 另 一 方 面 ， 由 于 辐

19、射 能 使 空 气 中 的 氧 电 离 成O， 再 使 O 2氧 化 生 成 臭 氧 （ O3） 或 使 水 （ H 2O）氧 化 生 成 过 氧 化 氢 （ H 2O2） 。 O3和 H 2O2均 有 杀 菌作 用 。 紫 外 线 穿 透 力 不 大 ， 所 以 ， 只 适 用 于 无 菌 室 ，接 种 箱 ， 手 术 室 内 的 空 气 及 物 体 表 面 的 灭 菌 。紫 外 线 灯 距 照 射 物 以 不 超 过 1.2m为 宜 。 为 了 加 强 紫 外 线 灭 菌 效 果 ， 在 打 开 紫 外 灯 前 ，可 在 无 菌 室 内 (或 接 种 箱 内 )喷 洒 3% 5%石 炭酸

20、溶 液 ， 一 方 面 使 空 气 中 附 着 有 微 生 物 的 尘 埃降 落 ， 另 一 方 面 也 可 以 杀 死 一 部 分 细 菌 。 无 菌 室 内 的 桌 面 、 凳 子 可 用 2% 3%的 来 苏 尔擦 洗 ， 然 后 再 开 紫 外 灯 照 射 ， 即 可 增 强 杀 菌 效果 ， 达 到 灭 菌 目 的 。 v灭 菌 的 试 管 培 养 基 冷 至 50 左 右 再 搁 置 ，以 防 斜 面 上 冷 凝 水 太 多 。v斜 面 长 度 不 超 过 试 管 总 长 的 一 半 。 v将 灭 菌 的 培 养 基 放 入 37 的 温 室 中 培养 24 48小 时 ， 以 检

21、 查 灭 菌 是 否 彻 底 。 实 验 任 务 v每 组 配 制 700 mL牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 （ P241）v趁 热 将 培 养 基 分 装 至 6把 试 管 （ 67支，不 超 过管 高 1/5） ； 剩 余 的 培 养 基 装 入 锥 形 瓶 中 （ 每 瓶约 150 mL ）v对 试 管 、 锥 形 瓶 进 行 包 装 ， 贴 上 标 签 （ 培 养 基 名称 、 配 制 时 间 、 组 别 ）v高 压 蒸 汽 灭 菌 （ 121 ,灭 菌 20min） 作 业 v实 验 报 告v思 考 题 1： 培 养 基 配 置 好 后 ， 为 什 么 必 须 立 即 灭 菌 ？如 何 检 查 灭 菌 后 的 培 养 基 是 否 为 无 菌 的 ？v思 考 题 2： 如 果 需 要 配 制 一 种 含 有 某 抗 生 素 的 固 体 培养 基 ， 其 中 抗 生 素 的 终 质 量 浓 度 （ 或 工 作 浓 度 ） 为50ug/mL， 你 将 如 何 操 作 ？ （ 提 示 ： 抗 生 素 在 高 温 下易 失 效 ）v下 一 次 实 验 ： 细 菌 的 简 单 染 色