实验四离心技术及物质代谢实验

《实验四离心技术及物质代谢实验》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验四离心技术及物质代谢实验（33页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、实 验 四 离 心 技 术 及 物 质 代 谢 实 验 离 心 技 术概 念 ： 根 据 物 质 沉 降 系 数 、 质 量 、 浮 力 因 素 等 的 不 同 ，应 用 离 心 力 使 物 质 分 离 、 浓 缩 、 提 纯 的 方 法 。应 用 ： 分 离 、 提 纯 、 鉴 别 生 物 高 分 子 ； 分 离 线 粒 体 、 染色 体 、 微 粒 体 、 溶 酶 体 等 亚 细 胞 物 质 。 基 本 原 理 F： 粒 子 在 离 心 场 中 所 受 的 离 心 力 a： 粒 子 旋 转 的 加 速 度 m： 沉 降 粒 子 的 有 效 质 量 ： 粒 子 旋 转 的 角 速 度 r：

2、粒 子 的 旋 转 半 径 (cm)rmamF 2 602 rpm ，36004 22 rm 转 速F= RCF(relative centrifugal force) ： 相 对 离 心 力 rpm( revolutions per minute ) ： 每 分 钟 转 速 低 速 离 心 时 常 以 转 速 “ rpm” 来 表 示 高 速 离 心 时 则 以 “ g” 表 示 9802rmgmaGFRCF l相 对 离 心 力 离 心 力 相 对 于 重 力 的 倍 数 ， 单 位 是 g l沉 降 系 数 （ S） : 超 速 离 心 时 ， 颗 粒 在 离 心 场中 的 沉 降 速

3、度 用 沉 降 系 数 来 表 示 ， 即 物 质 在 单位 离 心 力 场 下 的 沉 降 速 度 。 单 位 ： Svedberg， 1S=10-13s 是 是 物 质 特 有 的 物 理 常 数 ， 可 间 接 反 应 分 子 量的 大 小 。 离 心 分 离 技 术 的 基 本 理 论 数 据 ， 与 物 质 的 大 小 、形 状 、 密 度 及 介 质 的 密 度 、 粘 度 都 有 关 ， 通 过对 离 心 力 和 离 心 介 质 的 选 择 ， 即 可 分 离 纯 化 出不 同 质 量 大 小 和 物 理 形 状 的 物 质 。 另 外 ， 对 某 些 生 物 高 分 子 或 亚

4、 细 胞 器 组 分 的 化 学 结构 、 分 子 量 尚 不 了 解 时 ， 可 用 沉 降 系 数 对 其 物 理 特性 进 行 初 步 描 述 ， 将 其 区 别 开 来 ， 如 原 核 生 物 的 核蛋 白 体 RNA（ rRNA） 分 为 5S、 16S、 23S， 即 是 根 据其 在 离 心 场 中 的 行 为 来 进 行 分 类 。 离 心 机 的 类 型 和 主 要 构 造l 类 型 工 业 用 离 心 机离 心 机 制 备 性 离 心 机 实 验 用 离 心 机 分 析 性 离 心 机 普 通 离 心 机 ： 6000rpm 高 速 离 心 机 ： 6000 20000rp

5、m 超 速 离 心 机 ： 20000rpm制 备 性 离 心 机 l主 要 构 造 转 头 ， 离 心 管 和 管 帽 ， 制 冷 系 统 ， 真 空 系 统 ， 制 动 装 置 ， 指 示 表 盘 转 头 1 角 式 转 头 2 荡 平 式 转 头 ： 这 种 转 头 是 由 吊 着 的 4或 6个 自 由 活 动 的 吊 桶 (离 心 套 管 )构 成 。 3 区 带 转 头 ： 区 带 转 头 无 离 心 管 ， 主 要 由 一 个 转 子 桶 和 可 旋 开 的 顶 盖 组 成 。 4 垂 直 转 头 ： 其 离 心 管 是 垂 直 放 置 的 。 5 连 续 流 动 转 头 ： 转

6、 头 与 区 带 转 头 类 似 ， 由 转 子 桶 和 有 入 口 和 出 口 的 转 头 盖 及 附 属装 置 组 成 。 最 大 额 定 转 速 一 定 的 使 用 限 度 ， 使 用 一 定 次 数 或 一 定 时 间 后 递 减 10%。 离 心 管 不 锈 钢 和 塑 料 离 心 管 ， 管 帽 防 止 样 品 溢 出 。 l离 心 操 作 的 注 意 事 项 使 用 各 种 离 心 机 时 ， 必 须 事 先 在 天 平 上 精 密 地 平 衡离 心 管 和 其 内 容 物 ， 转 头 中 绝 对 不 能 装 载 单 数 的 管子 ， 当 转 头 只 是 部 分 装 载 时 ，

7、管 子 必 须 互 相 对 称 地放 在 转 头 中 ， 以 便 使 负 载 均 匀 地 分 布 在 转 头 的 周 围 。 每 个 转 头 各 有 其 最 高 允 许 转 速 和 使 用 累 计 期 限 ， 使用 转 头 时 要 查 阅 说 明 书 ， 不 得 过 速 使 用 。 装 载 溶 液 时 ， 要 根 据 各 种 离 心 机 的 具 体 操 作 说 明 进 行 ，根 据 待 离 心 液 体 的 性 质 及 体 积 选 用 适 合 的 离 心 管 ， 有的 离 心 管 无 盖 ， 液 体 不 得 装 得 过 多 ， 以 防 离 心 时 甩 出 ，造 成 转 头 不 平 衡 、 生 锈

8、 或 被 腐 蚀 ;而 制 备 性 超 速 离 心 机的 离 心 管 ， 则 常 常 要 求 必 须 将 液 体 装 满 ， 以 免 离 心 时塑 料 离 心 管 的 上 部 凹 陷 变 形 。若 要 在 低 于 室 温 的 温 度 下 离 心 时 。 转 头 在 使 用 前 应 放置 在 冰 箱 或 置 于 离 心 机 的 转 头 室 内 预 冷 。 离 心 过 程 中 不 得 随 意 离 开 物 质 代 谢 实 验v 实 验 二 十 一 、 糖 酵 解 中 间 产 物 的 鉴 定v 血 清 胆 固 醇 测 定v 血 清 甘 油 三 酯 测 定v 实 验 二 十 、 邻 甲 苯 胺 法 测

9、血 糖 含 量 实 验 二 十 一 、 糖 酵 解 中 间 产 物 的 鉴 定 【 实 验 目 的 】 检 测 糖 酵 解 中 间 产 物 磷 酸 丙 糖 的 生 成 。 【 实 验 原 理 】 G G-6-P F-6-P F-1,6-BP 磷酸二羟丙酮 1,3-二磷酸甘油酸3-磷酸甘油酸 2-磷酸甘油酸 PEP 丙酮酸 乳酸 ATP ADP ATP ADP NADH+H+ NAD+H2O 醛缩酶 Pi 异构酶 PFK-1 3-磷酸甘油 醛脱氢酶 ATP ADP 磷酸甘油 酸激酶 变位酶 烯醇化酶 ADP ATP 丙酮酸激酶 LDH 己糖激酶 异构酶 3-磷酸甘油醛 糖 酵 解 的 反 应 过

10、 程 见 下 图 ： 将 酵 母 液 （ 含 有 葡 萄 糖 及 糖 酵 解 的 全 部 酶 ） 在 一 定 的介 质 中 （ 适 宜 的 pH， 必 要 的 金 属 离 子 等 ） 进 行 保 温 ，在 酵 母 液 中 酶 体 系 的 作 用 下 ， 酵 母 液 中 原 来 含 有 的 糖就 进 行 酵 解 反 应 ， 当 反 应 进 行 到 生 成 二 分 子 磷 酸 丙 糖 ，进 一 步 变 化 是 在 3 磷 酸 甘 油 醛 脱 氢 酶 催 化 下 进 行 的 ， SH为 3 磷 酸 甘 油 醛 脱 氢 酶 的 必 需 基 团 ， 加 入 一 碘醋 酸 可 与 此 酶 的 SH起 反

11、应 ， 从 而 使 酶 失 去 活 性 ，酵 解 反 应 就 停 留 在 磷 酸 丙 糖 阶 段 。 酶 -SH+ICH2COOH 酶 S-CH2COOH+HI 然 后 以 硫 酸 肼 为 稳 定 剂 ， 保 护 磷 酸 丙 糖 不 致 自发 分 解 ， 使 其 不 能 向 其 他 方 向 变 化 ， 结 果 磷 酸丙 糖 在 反 应 体 系 中 堆 积 ， 从 而 与 2， 4 二 硝 基苯 肼 反 应 生 成 相 应 的 苯 腙 ， 后 者 在 碱 性 溶 液 中溶 解 呈 紫 红 色 ， 可 借 此 鉴 定 丙 糖 之 生 成 。 v 【 实 验 方 法 】 取 试 管 3支 ， 编 号

12、 ， 按 下 表 进 行 操 作 记 录 三 管 所 发 生 的 情 况 ， 并 加 以 简 要 的 分 析 CCL3COOH的 作 用 ： 强 酸 ， 使 糖 酵 解 的 全 部 酶 失 活 。 一 碘 醋 酸 的 作 用 ： 使 3 磷 酸 甘 油 醛 脱 氢 酶 失 活 。 硫 酸 肼 的 作 用 ： 稳 定 磷 酸 丙 糖 ， 使 其 不 向 其 它 方 向 转 变 。 试 剂 （ ml） 1 2 3pH7.4磷 酸 盐 缓 冲 液 一 碘 醋 酸 硫 酸 肼 10 CCL3COOH 酵 母 液 水 2.0 0.5 0.5 1.0 4.0 2.00.5 0.54.01.0 2.0 4.

13、0 2.0混 匀 ， 在 37 38 恒 温 水 浴 中 保 温 30分 钟一 碘 醋 酸 硫 酸 肼10 CCL3COOH 水 2.0 1.0 1.0 0.50.51.0 混 匀 ， 静 置 10分 钟 ， 离 心 ,3000转 /min,10分 钟 ， 再 取 三 支 试 管 ，对 号 按 下 表 操 作 上 清 液 1mol/LNaOH 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5混 匀 ， 在 室 温 放 置 10分 钟2， 4 二 硝 基 苯 肼 1mol/L NaOH 0.5 3.5 0.5 3.5 0.53.5 v 实 验 注 意 事 项 ： 成 腙 反 应 前 ， 溶 液 必

14、 须 先 碱 化 并 在 室 温 放 置10min， 目 的 是 使 磷 酸 丙 糖 中 的 磷 酸 基 水 解 脱去 ， 生 成 的 颜 色 比 较 稳 定 ； 一 碘 醋 酸 和 三 氯 乙 酸 是 酶 的 抑 制 剂 ， 使 用 移 液管 后 必 须 彻 底 清 洗 移 液 管 ， 否 则 易 导 致 实 验 失败 。 血 清 胆 固 醇 测 定 （ 酶 法 ）v 【 实 验 目 的 】 1. 了 解 胆 固 醇 氧 化 酶 法 测 定 血 清 胆 固 醇 的 原 理 。 2. 掌 握 血 清 胆 固 醇 测 定 的 临 床 意 义 。 血 清 中 总 胆 固 醇 包 括 胆 固 醇 酯

15、 (CE, 70%)和 游 离 型 胆 固 醇 (FC, 30%)。 胆 固 醇 酯 酶 （ CEH） 先 将 胆 固 醇 酯 水 解 为 胆 固 醇 和 游离 脂 肪 酸 （ FFA） ， 胆 固 醇 在 胆 固 醇 氧 化 酶 （ COD） 的 作 用下 氧 化 生 成 4-胆 甾 烯 酮 和 过 氧 化 氢 。 后 者 经 过 氧 化 物 酶（ POD） 催 化 与 4-氨 基 安 替 比 林 （ 4-AAP） 和 酚 反 应 ， 生 成红 色 的 醌 亚 胺 ， 其 颜 色 深 浅 与 胆 固 醇 的 含 量 呈 正 比 ， 在500nm波 长 处 测 定 吸 光 度 ， 与 标 准

16、管 比 较 可 计 算 出 血 清 胆 固醇 的 含 量 。 反 应 式 如 下 ：【 实 验 原 理 】 1. 标 本 ： 不 溶 血 的 血 清 或 血 浆 标 本 。 血 浆 用肝 素 钠 、 EDTA抗 凝 ， 不 可 用 草 酸 盐 、 氟化 物 。2.取 试 管 3支 ， 编 号 ， 按 下 表 操 作 。【 实 验 方 法 】加 入 物 （ ul） 测 定 管 标 准 管 空 白 管血 清 10 - -胆 固 醇 标 准液 - 10 -蒸 馏 水 - - 10酶 应 用 液 1000 1000 1000 【 计 算 】 A标 本 CHO（ mmol/L） = 标 准 液 浓 度

17、A标 准 【 标 准 液 】 胆 固 醇 5.17mmol/L（ 200mg/dL） 【 正 常 参 考 范 围 】 3.10 5.70mmol/L 混 匀 后 ， 37 水 浴 保 温 15分 钟 ， 在 500nm波 长 处比 色 ， 以 空 白 管 调 零 ， 读 取 各 管 吸 光 度 。 血 清 甘 油 三 酯 的 测 定 （ 酶 法 ）【 实 验 目 的 】 1、 了 解 酶 法 定 量 测 定 血 清 甘 油 三 酯 的 基 本 原 理 。 2、 掌 握 酶 法 定 量 测 定 血 清 甘 油 三 酯 的 实 验 方 法 。 血 清 中 甘 油 三 酯 经 脂 肪 酶 水 解 为

18、 甘 油 和 脂 肪 酸 ， 甘 油 在 甘油 激 酶 （ GK） 及 ATP存 在 下 ， 生 成 3-磷 酸 甘 油 ， 尔 后 ， 在 磷酸 甘 油 氧 化 酶 （ GPO） 作 用 氧 化 成 磷 酸 二 羟 丙 酮 并 生 成 过 氧化 氢 ， 过 氧 化 氢 与 底 物 4-氨 基 安 替 比 林 和 ESPAS在 过 氧 化 物酶 （ POD） 作 用 下 ， 生 成 红 色 亚 醌 化 合 物 ， 其 颜 色 深 浅 与 甘油 三 酯 含 量 成 正 比 。 在 500nm波 长 处 测 定 吸 光 度 ， 与 标 准 管比 较 可 计 算 出 血 清 甘 油 三 酯 的 含

19、量 。 反 应 式 如 下 ： 甘 油 三 酯 + 4H2O 脂 蛋 白 脂 酶 甘 油 + 脂 肪 酸 甘 油 + ATP 甘 油 激 酶 /Mg2+ 甘 油 -3-磷 酸 + ADP 甘 油 -3-磷 酸 + O2 甘 油 -3-磷 酸 氧 化 酶 磷 酸 二 羟 丙 酮 + H2O2 2H2O2 + ESPAS + 4-氨 基 安 替 比 林 过 氧 化 物 酶 红 色 醌 亚 胺 色素 + 4H2O【 实 验 原 理 】 1. 标 本 ： 不 溶 血 的 血 清 或 血 浆 标 本 。 血 浆 用肝 素 钠 、 EDTA抗 凝 ， 不 可 用 草 酸 盐 、 氟化 物 。2.取 试 管

20、 3支 ， 编 号 ， 按 下 表 操 作 。【 实 验 方 法 】加 入 物 （ ul） 测 定 管 标 准 管 空 白 管血 清 10 - -甘 油 三 酯 标准 液 - 10 -蒸 馏 水 - - 10酶 应 用 液 1000 1000 1000 【 计 算 】 A标 本甘 油 三 酯 （ mmol/L） = 标 准 液 浓 度 A标 准【 标 准 液 】 甘 油 三 酯 2.26 mmol/L 【 正 常 参 考 范 围 】 0.56 1.71mmol/L 混 匀 后 ， 37 水 浴 保 温 15分 钟 ， 在 500nm波 长 处比 色 ， 以 空 白 管 调 零 ， 读 取 各

21、管 吸 光 度 。 葡 萄 糖 在 浓 酸 溶 液 中 （ 加 在 含 有 硼 酸 的 冰 醋 溶 液 中 ） ， 水 浴加 热 至 100 左 右 ， 脱 水 生 成 羟 甲 基 呋 喃 甲 醛 （ 或 称 羟 甲 基 糠醛 ） ， 后 者 能 与 邻 甲 苯 胺 缩 合 生 成 蓝 绿 色 的 化 合 物 ， 根 据 颜 色深 浅 并 进 行 630nm波 长 比 色 测 定 其 含 量 。 实 验 二 十 、 邻 甲 苯 胺 法 测 血 糖 含 量【 实 验 目 的 】掌 握 邻 甲 苯 胺 法 测 定 血 糖 的 原 理 及 方 法【 实 验 原 理 】 1） 取 试 管 四 支 ， 按 下 表 操 作试 剂 （ ml） 测 定 管 （ 后 ) 标 准 管 空 白 管血 清糖 标 准蒸 馏 水邻 甲 苯 胺 试剂 0.14.0 0.14.0 0.14.0【 实 验 方 法 】2） 混 匀 ， 置 沸 水 浴 中 加 热 10分 钟 ， 取 出 立 即 置 冷 水 中冷 却 3） 用 630nm波 长 ， 以 空 白 管 校 正 吸 光 度 为 0， 分 别 测 定各 管 吸 光 度 值 4) 计 算【 标 准 液 】 葡 萄 糖 标 准 液 0.1 mg/ml 【 正 常 参 考 范 围 】 3.9 6.1mmol/L