微生物的培养与应用

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1、课 题 1 微 生 物 的 实 验 室 培 养 了 解 有 关 培 养 基 的 基 础 知 识 ， 进 行 无菌 技 术 的 操 作 ， 进 行 微 生 物 的 培 养 。 一 、 课 题 目 标 ： 掌 握 培 养 基 的 制 备 、 高 压 蒸 气 灭 菌 和平 板 划 线 法 等 基 本 操 作 技 术 ， 熟 练 、 规 范地 进 行 无 菌 操 作 ， 成 功 地 培 养 微 生 物 。无 菌 技 术 的 操 作 。二 、 课 题 重 点 和 难 点 ：三 、 技 能 目 标 ：课 题 1 微 生 物 的 实 验 室 培 养 基 本 操 作 程 序1、 培 养 基 的 配 制2、 培

2、 养 基 、 器 具 的 灭 菌3、 倒 平 板4、 微 生 物 的 接 种5、 微 生 物 的 培 养6、 菌 种 的 保 存 培 养 基 人 们 按 照 微 生 物 对 营 养 物 质 的 不 同 需 求 ， 配置 出 供 其 生 长 繁 殖 的 营 养 基 质 称 培 养 基 。 一 般 都 含 有 水 、 碳 源 、 氮 源 和 无 机 盐 等 营 养物 质 ， 另 外 还 需 要 满 足 微 生 物 生 长 对 pH、 特 殊 营养 物 质 ， 如 ： 生 长 因 子 (即 细 菌 生 长 必 需 ， 而 自 身不 能 合 成 的 化 合 物 ,如 维 生 素 、 某 些 氨 基 酸

3、 、 嘌 呤 、嘧 啶 )以 及 氧 气 、 二 氧 化 碳 、 渗 透 压 等 要 求 。 培养基的基本成分 液 体 培 养 基 ：培养基的种类1.按 物 理 状 态 分固 体 培 养 基 ：2.按 原 料 来 源 分合 成 培 养 基天 然 培 养 基半 天 然 培 养 基 3.按 用 途 分选 择 培 养 基鉴 别 培 养 基加 富 培 养 基 培 养 基在 液 体 培 养 基的 基 础 上 再 添加 琼 脂 。 半 固 体 培 养 基 ：增 菌纯 化 ， 增 菌动 力 检 测 ， 保 种 无菌技术 无 菌 操 作 泛 指 在 培 养 微 生 物 的 操 作 中 ，所 有 防 止 杂 菌

4、 污 染 的 方 法 技 术 。 获 得 纯 净 培 养 物 的 关 键 是 防 止 外 来 杂 菌 入 侵 。 无菌技术的种类使 用 较 为 温 和 的 方 法 （ 酒 精 、 紫 外 线 ） 来杀 死 部 分 对 人 体 有 害 的 微 生 物 。将 培 养 皿 、 接 种 用 具 进 行 灭 菌 ；使 用 较 为 强 烈 的 理 化 因 素 杀 死 物 体 内 外 的所 有 微 生 物 （ 包 括 芽 孢 和 孢 子 ） 。对 实 验 操 作 的 空 间 、 操 作 者 的 衣 着 和手 进 行 清 洁 消 毒 ； 无 菌 技 术接 种 的 过 程 要 在 酒 精 灯 附 近 进 行 。

5、 单 链 季 胺 盐 、 双 胍 类 、 中草 药 、 金 属 离 子杀 灭 细 菌 繁 殖 体 、亲 脂 病 毒低 效 消毒 法 超 声 波 、 碘 类 、 醇 类 、 酚类杀 灭 除 芽 孢 外 的致 病 微 生 物中 效 消毒 法 紫 外 线 、 含 氯 剂 、 臭 氧 、复 配 剂 等杀 灭 一 切 致 病 微生 物高 效 消毒 法 物 理 法 ： 热 力 、 辐 射 、 微波 、 等 离 子 体杀 灭 一 切 微 生 物灭 菌 法 方 法定 义分 类 化 学 法 ： 醛 类 、 烷 化 剂常用的消毒与灭菌的方法 无 菌 技 术 1.灼 烧 灭 菌 ：常用的消毒与灭菌的方法2.干 热

6、灭 菌 ：3.高 压 蒸 汽 灭 菌 ： 接 种 用 具 和 接 种 过 程 中 的 试 管 口 或 瓶 口 放 在 酒 精灯 火 焰 的 燃 烧 层 中 进 行 充 分 灼 烧 灭 菌 。 将 玻 璃 器 皿 、 金 属 用 具 等 能 耐 高 温 并 需 要 保 持 干燥 的 物 品 放 到 干 热 灭 菌 箱 内 ， 在 160 170 中 加 热1 2h即 可 。 将 需 灭 菌 物 品 放 到 盛 有 水 的 高 压 灭 菌 锅 内 煮 沸 ，待 冷 空 气 排 尽 后 ， 密 闭 继 续 加 热 至 锅 内 压 达 100kPa，温 度 达 121 后 ， 维 持 15 30min

7、即 可 。 无 菌 技 术 二 、 实 验 操 作 制备牛肉膏蛋白胨固体培养基1.牛 肉 膏 蛋 白 胨 固 体 培 养 基 配 方物 质 牛 肉 膏 蛋 白 胨 NaCl 琼 脂 水重 量 5g 10g 5g 20g 定 溶 至 100mL2.称 量 按 比 例 称 取 各 种 物 质 。注 意 ： 牛 肉 膏 要 放 在 称 量 纸 上 称 量 ， 牛 肉 膏 、 蛋 白 胨都 易 吸 潮 ， 称 取 时 动 作 要 迅 速 ， 称 后 及 时 盖 上 瓶 盖 。 3.溶 化 ：4.灭 菌 ：5.倒 平 板 ： 制备牛肉膏蛋白胨固体培养基 先 将 牛 肉 膏 连 同 称 量 纸 一 起 放

8、 入 烧 杯 ， 加 少 量水 ， 加 热 至 牛 肉 膏 溶 化 并 与 称 量 纸 分 离 后 ， 用 玻 璃棒 取 出 称 量 纸 。 加 入 蛋 白 胨 和 氯 化 钠 ， 用 玻 璃 棒 搅拌 使 之 溶 解 ， 再 加 入 琼 脂 ， 搅 拌 ， 待 溶 解 后 ， 加 水定 溶 至 100mL。 将 配 制 好 培 养 基 放 到 锥 形 瓶 中 （ 瓶 口 加 棉 塞 ，包 上 牛 皮 纸 ） ， 连 同 培 养 皿 （ 3 5套 ， 用 几 层 报 纸包 好 ） 一 起 放 到 高 压 锅 内 灭 菌 。 待 培 养 基 冷 却 到 50 左 右 时 倒 平 板 。 倒 平

9、板 操 作 的 讨 论 1.培 养 基 灭 菌 后 要 冷 却 到 50 时 倒 平 板 。用 什 么 办 法 来 估 计 培 养 基 的 温 度 ？ 2.为 什 么 需 要 使 锥 形 瓶 的 瓶 口 通 过 火 焰 ？ 用 手 触 摸 锥 形 瓶 ， 温 度 下 降 到 刚 刚 不 烫 手时 即 可 开 始 倒 平 板 。 通 过 灼 烧 灭 菌 ， 防 止 瓶 口 的 微 生 物 污 染 培养 基 。 3.平 板 冷 凝 后 ， 为 什 么 要 将 平 板 倒 置 ？ 4.在 倒 平 板 的 过 程 中 ， 如 果 不 小 心 将 培 养 基 溅 在皿 盖 与 皿 底 之 间 的 部 位

10、 ， 这 个 平 板 还 能 用 来 培 养 微 生物 吗 ？ 为 什 么 ？ 平 板 冷 凝 后 ， 皿 盖 上 会 凝 结 水 珠 ， 凝 固 后的 培 养 基 表 面 的 湿 度 也 比 较 高 ， 将 平 板 倒 置 ，既 可 以 使 培 养 基 表 面 的 水 分 更 好 地 挥 发 ， 又 可以 防 止 皿 盖 上 的 水 珠 落 入 培 养 基 ， 造 成 污 染 。 空 气 中 的 微 生 物 可 能 在 皿 盖 与 皿 底 之 间 的培 养 基 上 滋 生 ， 因 此 最 好 不 要 用 这 个 平 板 培 养微 生 物 。倒 平 板 操 作 的 讨 论 纯化大肠杆菌 微 生

11、 物 接 种 方 法 常 见 的 有 平 板 划 线 法 和 稀释 涂 布 平 板 法 。1.平 板 划 线 法 通 过 接 种 环 在 琼 脂 固 体 培 养 基 表 面 连 续 划线 的 操 作 ， 将 聚 集 的 菌 种 逐 步 稀 释 分 散 到 培 养基 的 表 面 。 在 数 次 划 线 后 可 以 分 离 到 由 一 个 细 胞 繁 殖而 来 的 肉 眼 可 见 的 子 细 胞 群 体 称 菌 落 。 1、 为 什 么 在 操 作 的 第 一 步 以 及 划 线 之 前 都 要 灼 烧 接 种环 ？ 在 划 线 操 作 结 束 时 ， 仍 然 需 要 灼 烧 接 种 环 ？ 第

12、一 步 灼 烧 接 种 环 是 为 了 避 免 接 种 环 上 可 能 存 在的 微 生 物 污 染 培 养 物 ；平板划线法的讨论 每 次 划 线 前 灼 烧 接 种 环 是 为 了 杀 死 上 次 划 线 结 束后 ， 接 种 环 上 残 留 的 菌 种 ， 使 下 一 次 划 线 时 ， 接 种 环上 的 菌 种 直 接 来 源 于 上 次 划 线 的 末 端 ， 从 而 通 过 划 线次 数 的 增 加 ， 使 每 次 划 线 时 菌 种 的 数 目 逐 渐 减 少 ， 以便 得 到 菌 落 。 划 线 结 束 后 仍 然 要 灼 烧 接 种 环 ， 能 及 时 杀 死 接 种环 上

13、残 留 的 菌 种 ， 避 免 细 菌 污 染 环 境 和 感 染 操 作 者 。 2.在 灼 烧 接 种 环 之 后 ， 为 什 么 要 等 其 冷 却 后 再进 行 划 线 ？平板划线法的讨论3.在 作 第 二 次 以 及 其 后 的 划 线 操 作 时 ， 为 什 么总 是 从 上 一 次 划 线 的 末 端 开 始 划 线 ？ 以 免 接 种 环 温 度 太 高 ， 杀 死 菌 种 。 划 线 后 ， 线 条 末 端 细 菌 数 比 线 条 起 始 处要 少 ， 每 次 从 上 一 次 划 线 末 端 开 始 ， 能 使 细菌 的 数 目 随 着 划 线 次 数 的 增 加 而 逐 步

14、 减 少 ，最 终 能 得 到 由 单 个 细 菌 繁 殖 而 来 的 菌 落 。 2.稀 释 涂 布 平 板 法 2.稀 释 涂 布 平 板 法 将 菌 液 进 行 一 系 列 的 梯 度 稀 释 ， 然 后 将 不同 稀 释 度 的 菌 液 分 别 涂 布 到 琼 脂 固 体 培 养 基 的表 面 进 行 培 养 。 在 稀 释 度 足 够 高 的 菌 液 里 ， 聚 集 在 一 起 的微 生 物 将 分 散 成 单 个 细 胞 ， 从 而 能 在 培 养 基 表面 形 成 单 个 的 菌 落 。稀 释 涂 布 平 板 法 操 作 过 程 分 两 个 步 骤 :系 列 稀 释 操 作涂 布

15、 平 板 操 作 系列稀释操作10 1 102 103 104 105 106 (1)将 分 别 盛 有 9mL水 的 试 管 灭 菌 并 编 号 。(2)用 移 液 管 吸 取 1mL培 养 的 菌 液 ， 注 入 第 二 支 试 管 中 ，轻 压 橡 皮 头 ， 吹 吸 三 次 使 之 充 分 混 匀 。(3)从 101倍 稀 释 的 试 管 中 吸 取 1mL稀 释 液 ， 注 入 第 三 支试 管 中 ， 重 复 步 骤 2， 直 至 到 第 六 支 试 管 。 涂 布 平 板 操 作(1)将 涂 布 器 浸 在 盛 有 70 的 酒 精 的 烧 杯 中 。(2)取 少 量 菌 液 （

16、 不 超 0.1mL） ， 滴 加 到 培 养 基 表面 。(3)将 沾 有 酒 精 的 涂 布 器在 火 焰 上 引 燃 ， 火 熄后 冷 却 8 10s。(4)用 涂 布 器 将 菌 液 均 匀地 涂 布 在 培 养 基 表 面 。 2.稀 释 涂 布 平 板 法 涂布平板操作讨论 涂 布 平 板 的 所 有 操 作 都 应 在 火 焰 附 近 进 行 。结 合 平 板 划 线 与 系 列 稀 释 的 无 菌 操 作 要 求 ， 想一 想 ， 第 二 步 应 如 何 进 行 无 菌 操 作 ？ 将 接 种 后 和 未 接 种 （ 作 为 对 照 组 ） 的 培 养 基均 放 到 37 的

17、恒 温 箱 中 ， 培 养 12 24h后 观 察 并记 录 结 果 。 应 从 操 作 的 各 个 细 节 保 证 “ 无 菌 ” 。 如 :酒精 灯 与 培 养 皿 的 距 离 要 合 适 、 吸 管 头 不 要 接 触任 何 其 他 物 体 、 吸 管 要 在 酒 精 灯 火 焰 周 围 等 等 。 1.未 接 种 的 培 养 基 表 面 是 否 有 菌 落 生 长 ？ 如 果 有菌 落 生 长 ， 说 明 了 什 么 ？ 2.在 接 种 大 肠 杆 菌 的 培 养 基 上 ， 能 否 观 察 到 独 立的 菌 落 ？ 它 们 的 大 小 、 形 状 、 颜 色 相 似 ？ 未 接 种

18、的 培 养 基 在 恒 温 箱 中 保 温 1 2d后 无菌 落 生 长 ， 说 明 培 养 基 的 制 备 是 成 功 的 ， 否 则需 要 重 新 制 备 。 如 果 接 种 成 功 的 话 ， 在 培 养 基 的 表 面 可 观察 到 大 小 、 形 状 、 颜 色 相 似 的 菌 落 。 3.培 养 12h和 24h后 ， 观 察 到 的 实 验 结 果 相 同 吗 ？如 果 不 同 ， 请 分 析 产 生 差 异 的 原 因 ？ 4.如 果 在 培 养 基 上 观 察 到 不 同 形 态 的 菌 落 ， 请 分析 其 可 能 的 原 因 。 培 养 12h与 24h后 的 大 肠 杆

19、 菌 菌 落 的 大 小 会有 明 显 不 同 。 随 着 时 间 的 延 长 、 菌 落 的 不 断 生长 ， 使 菌 落 不 断 增 大 。 无 菌 操 作 未 达 到 要 求 ： 可 能 是 培 养 基 灭 菌不 彻 底 ； 可 能 是 接 种 时 发 生 了 污 染 ； 也 可 能 是在 培 养 的 过 程 中 受 到 了 污 染 。 1.试 管 低 温 临 时 保 存 2.甘 油 管 长 期 保 存 将 菌 种 接 种 到 试 管 的 固 体 斜 面 培 养 基 上 ，培 养 成 菌 落 后 ， 置 于 4 的 冰 箱 中 保 存 （ 每 隔3 6个 月 要 重 新 接 种 培 养 后 再 保 存 ） 。 在 3mL的 甘 油 瓶 中 加 入 1mL的 甘 油 ， 高 压灭 菌 。 将 1mL培 养 的 菌 液 转 移 到 甘 油 瓶 中 ， 充分 混 合 后 ， 置 于 20 的 冷 冻 箱 中 保 存 。