基因敲除方法的比较

方法 原理 优点 不足 应用 利用同源重组进 行基因敲除 利用DNA转化技术， 将含有目的基因和靶 基因同源片段的重组 载体导入靶细胞，通 过载体与靶细胞染色 体上同源序列间的重 组，将外源基因整合 入内源基因组内，使 外源基因得以表达。 通过研究靶细胞或者 个体在目的基因插入 前后遗传特性的改 变,达到研究基因功 能的目的。 具有咼度特 异性和方向 性，外源片 段也具有可 操作性 1)操作复杂,实验周期长,费用 偏咼;(2)在敲除过程中，被破坏 的常常只是靶基因的部分外显 子而并不是整个编码区，残留 的编码序列有可能组合出新的 未知的功能,这将给表型分析 带来麻烦；(3)对于某些必需基 因，敲除后会造成细胞死亡,也 就无法研究这些必需基因的功 能;⑷由于基因功能上的冗余， 敲掉一个基因并不能造成容易 识别的表型；(5)同一个打靶载 体在不同遗传背景下进行基因 敲除，获得的表型差异很大。 噬菌体的 Cre/Loxp 系统 和酿酒质粒的 FLP/FRT 系统 利用随机插入突 变进行基因敲除 利用某些能随机插入 基因序列的病毒，细 菌或其他基因载体， 在目标细胞基因组中 进行随机插入突变， 建立一个携带随机插 入突变的细胞库，然 后通过相应的标记进 行筛选获得相应的基 因敲除细胞 效率咼、基 因完全失 活、容易分 离鉴定被插 入引起失活 的目的基因 等 1以农杆菌介导的T-DNA插入 突变只适用于那些容易被 T-DNA转化的植物，且常常会引 起的染色体重排现象，使突变 体表型与T-DNA插入无关而难 以进行遗传学分析。 2转座子插入突变要求转座子 本身较短，容易操作，且对任何 拟敲除区域有较高转座效率等 以农杆菌介导 的T-DNA插入 突变 转座子插入突 变 RNA干扰引起的 基因敲除 是由与生物体内源 靶基因mRNA同 源的双链RNA 特异性引发的靶m RNA降解，导致目 的基因表达沉默的一 种反向遗传学技术。 1)特异性强， 针对同源基 因共有序列 的RNAi贝9 只能导致同 源基因失 活,不影响 其他内源性 mRNA的表 达；(2)效率 高;⑶穿透 性强 1缺之有效的siRNA载体 2无法彻底去除目的基因 3在哺乳动物中的应用还处于 探索阶段,实验方法不够成熟。 1对于一些敲 除后小鼠在胚 胎时就会死亡 的基因，可以 在体外培养的 细胞中利用 RNAi技术研究 它的功能。 2由于RNAi能 咼效特异的阻 断基因的表 达，它成为研 究信号传导通 路的良好工 具。 3RNAi还被用 来研究在发育 过程中起作用 的基因，如可 用RNAi来阻断 某些基因的表 达，来研究他 们是否在胚胎 干细胞的增殖 和分化过程中 其起着关键作 用。