《组织培养技术》PPT课件

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1、组织培养 Tissue Culture 一、组织培养的定义 组织培养： 细胞、组织或器官 离体 合适的培养液、 温度、无菌 使之生存和生长 根据培养物的不同，组织培养又可分： 细胞培养、组织培养 和 器官培养 。 二、组织培养的应用 1. 优点： （ 1）研究对象是活细胞，可长时间动态观察细胞的形 态结构和生命活动。 （ 2）研究对象广泛，包括各种组织细胞。 （ 3）可研究各种理化因素 （温度、药物、毒素等） 对 细胞代谢、增殖、分化的影响。 （ 4）研究方法多样，如倒置、荧光、电子显微镜、组 织化学、同位素标记等，研究结果便于观察记录。 应用： 病毒学：细胞培养是分离培养病毒的重要手段， 用

2、于病毒感染的诊断，生产病毒疫苗。 免疫学：杂交瘤 -单克隆抗体技术。 遗传学：从子宫取得胎儿细胞做染色体分析， 进行遗传学诊断，试管婴儿等。 肿瘤学：抗肿瘤药物筛选。 2. 不足之处： 体外与体内培养条件不完全相同，失去神经内 分泌系统的调节作用，培养的细胞存在一定的 差异 ，故对结果的判断应慎重。 二、组织培养的应用 三、培养细胞的特性 1. 培养细胞的分型 （按生长方式分） （ 1）贴附型： （ 2）悬浮型： 1. 培养细胞的分型 （按生长方式分） （ 1）贴附型： 大部分细胞附着于支持物表面生长， 分化不明显，形态单一， 常反映其胚层起源。 如 上皮细胞型，成纤维细胞型，多形细胞型。 上

3、皮细胞型 成纤维细胞型 （ 2）悬浮型： 不贴附于支持物上，而呈悬浮状 态生长，细胞呈圆形，单个或细胞团排列；见 于血、脾、骨髓细胞、部分肿瘤细胞。 悬浮型细胞 三、培养细胞的特性 2. 培养细胞的生长和增殖 原代培养 （ Primary Culture） ： 从体内取出组织开 始在体外培养，在其传代之前。 传代培养 （ Subculture） : 将细胞分离成两部分获 更多至新的培养器皿中，并补充更新培养液 。 细胞系 （ Cell line）： 原代培养细胞一经传代后便 称为细胞系 。 细胞系的生长过程 有限细胞系 无限细胞系 二倍体细胞大多可传 30-50代，相当于 150-300个细胞

4、周期， 维待一年左右的生存时间。 细胞系的生长过程 原代培养期 ： 1-4周，与体内细胞相似，但分裂不 旺盛，含细胞类型较多。 传代期 ： 持续时间最长，细胞分裂增殖旺盛，保 留原组织细胞的很多特征，一般传代 30-50次后， 细胞增殖逐渐缓慢。 衰退期 ： 细胞增殖缓慢，并逐渐停止，细胞形态 轮廓增强，最后衰退、死亡。 实验研究的最佳时期： 传代期（ 10代以内） 三、培养细胞的特性 1. 营养需要： 碳水化合物、氨基酸、维生素、无机离子、促生长因子和激素 2. 生存环境： 温度： PH值： 气相： 渗透压： 3. 无污染 及无毒： 35 -37 耐低温不耐高温 7.2-7.4 宁酸勿碱 O

5、2、 CO2（ 5% ） NaHCO3-CO2 260-320 mmol/L 3. 培养细胞的生长条件 防止污染 要注意防止微生物（细菌、病毒、真菌、支原体等） 的污染、不同细胞类型的交叉污染。 出现以下情况时培养细胞可能有污染： 1) 培养液的酸碱度异常改变，如短期内颜色变黄 ； 2) 培养液出现混浊； 3) 光镜观察到大量颗粒或菌丝； 4) 细胞生长停止或出现死亡。 四、组织培养的常用设备 1. 仪器 包括各种无菌操作、消毒灭菌、细胞培养和保 存的设备，如无菌室、 超净工作台 、 CO2培养 箱 、高压蒸汽灭菌器、滤器、水纯化装置、倒 置显微镜、离心机、液氮容器等。 超净工作台 CO2培养

6、箱 四、组织培养的常用设备 2. 器皿 培养瓶 培养皿 培养板 四、组织培养的常用设备 3. 试剂 （ 1） 天然培养基： 动物血清（如胎牛血清、小牛血清）。 （ 2）合成培养基： 如 RPMI1640、 DMEM、 199等。 多采用合成培养基 +天然培养基（ 5-20%）。 （ 3）平衡盐溶液： 由无机盐和葡萄糖组成，用于洗涤、配 液、维持渗透压，调节 PH值等，如 PBS、 Hanks等。 （ 4） 消化液： 用于消化解离组织块，使贴壁细胞从附着物 脱离。如胰酶、 EDTA、胶原酶等。 五、基本培养技术 1. 无菌操作 2. 取材 3. 组织分离 4. 原代培养 5. 传代培养 6. 细

7、胞冻存与复苏 五、基本培养技术 1. 无菌操作： 防止污染是决定组织培养成败的关键，必须 无菌操作 ！ （ 1）培养前的消毒灭菌 待用物品：洗涤、消毒灭菌。 无菌室：紫外线照射 30-50min，新洁尔灭拖地。 超净台： 75%酒精擦洗，紫外线灭菌等照射 30min。 （ 2）洗手和着装 彻底洗手，着清洁工作服，酒精消毒手。 （ 3）无菌培养操作 超净台内操作，点燃酒精灯，火焰附近操作，在安装吸头、打开或封闭瓶口时均应过火烧灼。 不直接用手触及器皿的无菌部分，如瓶口、瓶塞内侧，必要时借助镊子。 吸取培养液、平衡盐溶液、细胞悬液的吸管不能混用。 转移液体时，吸管口不能触及瓶口，以防交叉污染。 饭

8、盒、瓶子不要过早打开，使用后及时盖好，瓶塞倒置在桌面。 面向操作台时勿大声讲话、咳嗽，以免喷出唾沫，污染工作台面。 操作完毕，整理台面，酒精擦拭。 五 、基本培养技术 2. 取材： 新鲜、无菌、避免有害因素损伤。 五、基本培养技术 3. 组织分离 （ 1）离心分离： 用于血液、羊水、胸水、腹水等悬液， 500-1000 rpm低速离心 5-10 min。 （ 2）机械分离： 用剪刀 将组织剪切成小块，也可再挤压 通过筛网，用于纤维成分少的组织，如脑、胚胎、一 些肿瘤组织。 （ 3）消化分离： 用消化液使组织松散、细胞分开，获得 细胞悬液。常用消化液胰酶、 EDTA、胶原酶。 六、基本培养技术

9、4. 原代培养： （ 1）组织块法： 将组织剪切成小块后，接种于培养 瓶底部，培养后细胞从组织块边沿移出生长。简 便易行，适用于组织量少培养。 （ 2）消化法： 将消化分离法获得的细胞悬液，接种 培养瓶。在短时间内生长成片，适用于大量组织 的培养，但步骤繁琐、易污染、成本高。 五、基本培养技术 5. 传代培养： 贴附型细胞： 加入消化液，镜下观察，见胞质回缩、 细胞间隙增大，终止消化，吹打为单细胞悬液， 计数后接种新的培养瓶。 悬浮型细胞： 直接吹打或离心沉淀后再分离传代。 注意： 1）贴壁细胞覆盖瓶底大部分（ 80%）方可传代， 不要急于传代； 2）传代时不同细胞有不同的消化时间，要根据需要

10、 注意观察及时处理。 六、基本培养技术 6. 细胞冻存和复苏 目的：保存和利用细胞。 短期保存： -70 低温冰箱，长期保存： -196 液氮罐。 为保证细胞最大存活率，采用 慢冻快融 的原则 。 冻存： 收集对数生长细胞，加入保护剂和培养液，调细胞密度 5-10 106/ml， 分装入冻存管，逐渐降温， -1 -2 /min，到 -25 时，下降率增至 -5 - 10 /min，到 -100 迅速浸入液氮罐。 （ 4 30min -70 24h -196 液氮）。 复苏： 取出冻存管，直接投入 37 水浴中，快速摇动，直至完全融化，吸出 细胞，加入 10倍以上培养液，离心，调整细胞密度 5

11、105/ml，接种培养瓶。 细胞冻存于液氮中（ -196 ）理论上储存时间是无限的。一 般冻存一年后，应复苏一次，继续冻存。 低温冰箱 液氮罐 冻存管 冻存管 实验操作：小鼠肝组织培养 （一）实验材料 1.器材： 手术剪、手术镊 （大） 剪鼠开皮肤、肌肉层 眼科镊、眼科剪 （小） 剪碎鼠肝脏 培养皿 盖和底分别用于清洗、剪碎鼠肝脏 培养瓶 培养肝组织 2.试剂：洗液 PBS、小牛血清、 培养液 1640 3.仪器：超净工作台、 CO2培养箱 4.动物：小白鼠 1只 /2人 实验操作：小鼠肝组织培养 （二）实验方法 1. 处死消毒小鼠：引颈法处死小鼠，在 75%酒精缸中浸泡数 秒取出，滴去酒精，

12、腹部向上放进白瓷盘，拿入超净台。 2. 准备工作：点燃酒精灯，酒精棉球擦手， 取 3支滴管分别放入洗液、血清、培养液中。 （第一组放，最后一组收） 3. 取肝脏：用 手术剪、镊剪开腹部 皮肤、肌肉层，暴露腹腔， 从腹腔右侧取一小块肝组织，放入培养皿中。 4. 洗涤：加入洗液，用 眼科镊 夹住肝组织清洗，共洗 2遍。 实验操作：小鼠肝组织培养 （二）实验方法 5. 剪碎：在培养皿中加入 1滴小牛血清，将肝组织放入其中， 用 眼科剪 剪碎成 1mm3左右小块。 6. 准备培养瓶：吸 1滴血清，滴在培养瓶 底面 ，来回涂抹。 7.接种肝组织：用滴管吸取肝组织，贴于培养瓶底面中， 3-4块即可，分开排

13、列。 8.加培养液： 翻转培养瓶 ，加入培养液 2滴管， 轻旋 瓶盖。 9.培养：将培养瓶放入 CO2培养箱， 2h后翻转。 10.整理台面，清洗器材。 实验操作：小鼠肝组织培养 注意事项： 无菌操作 试剂中的滴管第一组放，最后一组收 加培养液时，要翻转培养瓶 2人一组，相互配合 实验结束后： 器材 C409清洗 小鼠 C409垃圾桶 实验操作：小鼠肝组织培养 （三）实验结果 培养一周左右 ， 倒置显微镜 下 ， 可见肝细胞贴壁 ， 以组织块 为中心 ， 向四周放射状分布 。 肝 细胞呈多边形 ， 胞体饱满 ， 折光 性强 ， 中央有一圆形细胞核 。 实验操作：小鼠肝组织培养 （四）实验地点和分组 D306 无菌室 实验操作 C409 准备室 清洗实验器材 2人一组， 10人一批 （第 1批操作，第 2批准备，请班长协调安排） 实验报告： 小鼠肝组织培养 一、目的 二、材料 三、方法 四、结果 五、 讨论： 注意事项，分析试验中遇到的问题