碱性磷酸酶动力学参数的测定

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1、Beijing Institute of Petrocherriool Technology题目：碱性磷酸酶动力学参数的测定（创新实践活动论文）2015年4月24日北京不同缓冲液对碱性磷酸酶动力学参数的影响摘要酶促反应动力学主要研究酶催化的反应速率以及影响反应速率的各种因素，为了更好 的发挥酶的高效性，就必须准确把握酶促反应的条件。本文重点研究不同缓冲液所配制的 酶液对酶促反应的影响。实验利用碱性磷酸酶溶解在TRIS，碳酸钠，去离子水等缓冲液中 为酶液，磷酸苯二钠为基质，进行实验，得到去离子水为最适缓冲液的结果，表明以去离 子水为缓冲液所配制的酶液能使酶发挥最好的效果，具有研究意义。关键词：碱

2、性磷酸酶；缓冲液；动力学参数；本试验以碱性磷酸酶为催化剂，磷酸苯二钠为底物，在一定温度、pH及酶量的条件下，碱性磷酸酶 催化磷酸苯二钠转化为苯酚；利用分光光度计测定在不同底物浓度下苯酚的生成量。通过实验可以 加深对有关酶促反应动力学基本知识的理解和记忆；并熟记利用双倒数法测定酶Km值的原理，熟悉 试验方法。1实验材料、试剂与仪器1.1材料与试剂实验中使用的主要试剂有磷酸苯二钠：国药集团化学试剂有限公司分析纯醋酸镁：天津市永大化学试剂开发中心 分析纯醋酸：北京化工厂分析纯碱性磷酸酶：北京化工厂分析纯4-氨基安替比林：天津市永大化学试剂有限公司 分析纯铁氤化钾：北京化工厂分析纯硼酸：北京化工厂分析

3、纯苯酚：天津市福晨化学试剂厂分析纯三羟甲基氨基甲烷（Tris）:北京化学试剂公司 分析纯NaOH:北京化工厂分析纯碳酸钠：天津光复科技发展有限公司分析纯碳酸氢钠：天津市福晨化学试剂厂分析纯实验中使用的主要溶液有（1）0.1 mol/L碳酸盐缓冲溶液（pH=10）:碳酸钠1.5875 g，碳酸氢钠0.84 g，蒸馏 水溶解至250 mL。（2）0.04 mol/L基质溶液：磷酸苯二钠0.436 g （无结品水），用煮沸冷却的蒸馏水 溶解至50 mL，盛于棕色瓶，冰箱内保存。（3）0.1 mol/L醋酸镁溶液:醋酸镁1.0725 g，蒸馏水溶解至50 mL。（4）pH 8.8Tris缓冲溶液：Tr

4、is 1.21 g，蒸馏水溶解至100 mL，取此溶液10 mL， 加蒸馏水80 mL，再加0.1 mol/L醋酸镁10 mL，混匀后用1%的醋酸调节pH值至8.8, 用蒸馏水稀释至100 mL即可。（5）0.5 mol/L NaOH 溶液：NaOH 5 g，蒸馏水溶解至 250 mL。（6）酶液：碱性磷酸酶1.25 mg，用pH 8.8的Tris缓冲溶液配制50 mL，冰箱内保 存。碱性磷酸酶1.25 mg，用pH=10的碳酸钠缓冲溶液配制50 mL，冰箱内保存。碱性 磷酸酶1.25 mg，用去离子水为缓冲溶液配制50 mL，冰箱内保存。（7）0.3%4-氨基安替比林液：4-氨基安替比林液0

5、.3 g，碳酸氢钠4.2 g，蒸馏水溶解 至 100 mL。（8）0.3%铁氤化钾溶液：铁氤化钾1.25 g，硼酸3.75 g，各溶于100 mL蒸馏水中， 溶解后混合至250 mL，盛于棕色瓶，冰箱内保存。（9）酚标准溶液：苯酚1.5 g，溶于0.1 mol/L盐酸至1000 mL，为储备液。取此储备 液25 mL，标定后用蒸馏水稀释至0.1 mg/mL作为标准溶液。1.2仪器烧杯（100 mL）6量筒，移液管，试管，试管架分光光度计型号UV2300上海天美科学仪器有限公司电子天平型号AL204-IC梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司恒温水浴等型号DF-101S金坛市晶玻实验仪器厂2试验方法

6、与步骤2.1标准曲线的制备取酚标准液0.00、0.05、0,10、0.20、0.30、0.40 mL于6支试管中，分别加蒸馏水至 2.00 mL 后，37C水浴中保温 5 min，然后各加入 0.5 mol/L NaOH 溶液 1.00 mL、0.3%4- 氨基安替比林液1.00 mL、0.3%铁氤化钾溶液2.00 mL，混匀后室温放置17 min，510 nm波长处比色，并绘制标注准曲线。各管酚含量分别为0、5、10、20、30、40g。2.2动力学参数确定实验取干净试管9支，编号，按表1,表2,表3正确操作。表1动力学参数测定试剂用量1试管号水/mL0.04mol/L基质液 /mL碳酸盐缓

7、 冲液/mLpH8.8Tris 缓冲溶液配 制酶液/mL最终基质浓 度/（mmol/L）10.90.10.90.12.020.850.150.90.13.030.80.20.90.14.040.750.250.90.15.050.70.30.90.16.060.60.40.90.18.070.20.80.90.116.08-1.00.90.120.091.0-0.90.1-表2动力学参数测定试剂用量2试管号水/mL0.04mol/L基质液 /mL碳酸盐缓 冲液/mLpH=10碳酸 钠缓冲溶液 配制酶液/mL最终基质浓 度/（mmol/L）10.90.10.90.12.020.850.150.9

8、0.13.030.80.20.90.14.040.750.250.90.15.050.70.30.90.16.060.60.40.90.18.070.20.80.90.116.08-1.00.90.120.091.0-0.90.1-表3动力学参数测定试剂用量3试管号水/mL0.04mol/L基质液 /mL碳酸盐缓 冲液/mL去离子水为缓冲溶液配制酶液/mL最终基质浓 度/（mmol/L）10.90.10.90.12.020.850.150.90.13.030.80.20.90.14.040.750.250.90.15.050.70.30.90.16.060.60.40.90.18.070.20

9、.80.90.116.08-1.00.90.120.091.0-0.90.1-加入酶液后，立即计时37C水浴中保温15min。保温结束后，立即加入0.5 mol/L NaOH 溶液1.00 mL以终止反应。各管分别加入0.3%4-氨基安替比林液1.0 mL及0.3%铁氤化钾溶液2.0 mL,充分混匀， 放置10 min以9号管为对照，在510 nm处比色，并计算各管的酶活性。用双倒数作图 法，在坐标纸上作图，求该酶的Km值。3结果与讨论3.1标准曲线的绘制用分光光度计测量每个试管的透光率，再依据公式-logT计算吸光度的值，具体数值见 表4表4标准曲线参数值酚含量（Mg）透光率T%吸光度（AB

10、S）01000538.60.4131030.20.522018.90.7243011.20.951407.91.102依据表4的数据绘制标准曲线见图1y = 0. 0312kK2 = 0. 8217 ABS一线性(ABS)20304050酚的含量PS图1标准曲线图得到公式y=0.0312x。相关系数较小的可能原因为：标准样受到污损，人为操作有误，一起不稳定等。3.1.2动力学参数确定实验按照2.2进行动力学参数测定试验，实验结果见表5,并依据表5的结果进行数据处理， 处理结果见表6,7,8。利用表6,7,8的数据，以底物浓度的倒数为横坐标，酶促反应速 率的倒数为纵坐标作图，见图2,3,4。计算

11、出动力学参数，得到动力学方程1/V=Km/（Vmax*Cs） +1/Vmax。表5不同酶液的T%pH 8.8 Tris缓冲溶液配制 的酶液的T%pH=10的碳酸钠缓冲溶液配 制的酶液的T%去离子水为缓冲溶液配制的 酶液的T%0.7110.6910.7200.7020.6820.7090.6750.6580.7060.6670.6470.7050.6770.6360.6850.640.6230.6660.6290.5910.6550.6170.5840.645111表6 pH 8.8 Tris缓冲溶液配制的酶液的数据TABSDC1/Cs1/V0.7110.1484.7400.7900.518.9

12、0.7020.1544.9260.8230.3318.20.6750.1715.4810.9140.2516.40.6670.1765.6410.9400.215.90.6770.1695.4170.9030.1616.70.640.1946.2181.0360.12514.50.6290.2016.4421.0740.063140.6170.2106.7311.1220.0513.3100-让 y=0,则 x=-1.085, Km=0.9217mmol/l。表7 pH=10的碳酸钠缓冲溶液配制的酶液的数据TABSDC1/Cs1/V0.6910.1615.1600.8600.517.50.68

13、20.1665.3210.8870.3316.90.6580.1825.8330.9720.2515.40.6470.1896.0581.0100.214.90.6360.1976.3141.0520.1614.30.6230.2066.6031.1010.12513.70.5910.2297.3401.2230.06312.20.5840.2347.5001.2500.0512.0100-图3 pH=10的碳酸钠缓冲溶液配制的酶液的双倒数图让 y=0,则 x=-0.935, Km=1.0695mmol/l。表8去离子水为缓冲溶液配制的酶液的数据TABSDC1/Cs1/V0.7200.1434

14、.5830.7640.519.60.7090.1494.7760.7960.3318.90.7060.1514.8400.8070.2518.50.7050.1524.8720.8120.218.50.6850.1645.2560.8760.1617.20.6660.1775.6730.9460.12515.90.6550.1845.8970.9830.06315.20.6450.1906.0901.0150.0514.7100-图4去离子水为缓冲溶液配制的酶液的双倒数图让 y=0，则 x=-1.3504，Km=0.7405mmol/l。3.2动力学参数测定实验结果与讨论以上结果表明：用去离子

15、水为缓冲溶液配制的酶液最合适，用pH 8.8的Tris缓冲溶液 配制的酶液次之，用pH=10的碳酸钠缓冲溶液配制的酶液最不合适。此次实验，受限于 实验环境，设备条件，人为操作等因素的影响，对于这三种酶液的具体情况还有待研。3.3体会通过这次试验，我更加深入的了解了不同缓冲液配置的酶液对于酶促反应速率的影响， 且对于反应操作也更加得心应手，不足之处在于酶液的配置及保存都有很严格的要求， 受外界环境因素的影响较大，导致实验结果出现偏差，希望之后通过文献的查阅，实 验条件的改善，人员操作的谨慎能更加准确的测定其效果。参考文献1 史凌云，周婷，徐成，张媛媛，赵小峰，高梦，於露，贺玲.正交实验法对碱性磷酸酶活性测 定的优化J.生物学通报，2014，49（7）： 50-522 洪新，唐克，牟晓刚，朱海燕.耐酸性a-淀粉酶酶促反应动力学研究J.辽宁工业大学学报，2010， 30 （2） :116-1183 周毅.浅谈酶促反应方法与影响酶促反应速率的因素J.中国卫生标准管理2014, 5（23）：71-724 王秋颖.碱性磷酸酶特性及其应用的研究进展J.中国畜牧兽医，2011,38（1）： 157-1605 陈银霞.影响酶促反应速度的外因研究J.现代农业科技,2008,18： 238-239