高效液相色谱测定米糠中水溶性维生素

《高效液相色谱测定米糠中水溶性维生素》由会员分享，可在线阅读，更多相关《高效液相色谱测定米糠中水溶性维生素（7页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、高效液相色谱法测定米糠中的水溶性维生素江南大学化工与材料工程学院，江苏无锡214122 摘要：高效液相色谱法同时测定米糠中四种水溶性维生素VB, VB6，烟酸，烟 酰胺的含量。在 Hypersil C8250cmx4.6 mm i.d., 5.0 pm上，以体积比为 88:12 的0.1%磷酸水溶液-甲醇为流动相，mL/min流速等度洗脱，在266nm波长下检 测。各组分在8min能基线别离。四种维生素在X 10-6g/mL8.5X 10-5g/mL范围 内呈线性关系，VB、VB6X10-6 g/m X10-6g/mX10-6 g/m X 10-6 g/mL。经简单预 处理，可以对米糠和淘米水

2、中的这四种维生素的含量进展测定，平均回收率在 96.0%99.9%之间。该法简便、快速、准确、灵敏，对复杂体系水溶性维生素 的测定具有重要的参考价值。关键词：水溶性维生素；米糠；高效液相色谱Determination of four water-soluble vitamins in rice bran by reverse-phase highperformance liquid chromatographyCAO Rui, CAO Yu-hua, LI Nan, GONG Wen-jun, KONG Ling-yao, WANG YunSchool of Chemical and Mate

3、rial Engineering, Southern Yangtze University, Wuxi 214122 Abstract:High performance liquid chromatography (HPLC) has been applied for the simultaneous determination of four kinds of water-soluble vitamins including vitamin B1, vitamin B 6, nicotinic acid, and nicotinamide in rice bran. The separati

4、on was performed on a Hypersil C18 column (250 cmx4.6mm i.d., 5.0 pm) with a mobile phase of 0.1% H 3PO4- methanol (88:12, V/V) at flow rate of 0.6 mL /min, and detection wavelength was 266 nm. Four vitamins had good linearity in the range of 6.0X10-7g/mL - 8.5X10-5g/mL, with detection limit of 4.3X

5、10-7 g/mL, 3.4X 10-6g/mL, 3.2X10-7g/mL and 3.0X10-7 mg/L for vitamin B 1, vitamin B6, nicotinic acid and nicotinamide, respectively. Baseline separation of four vitamins can be achieved within 8 minutes. Without complicated pretreatment, four analytes in rice bran samples, as well as extracts from r

6、ice with water, were successfully determined with recoveries between 96.0% and 99.9%. The approach could be applied todetermine water-soluble vitamins in complicated samples owing to simplicity,convenience, sensitivity and accuracy.Key words: water-soluble vitamins; rice bran; high performance liqui

7、d chromatography米糠是一类具有广泛开发潜力的高附加值资源，含有稻米的 64营养物质 及 90人体所需要的各种营养元素 1 ，包括维生素、氨基酸、脂肪酸、矿物质， 还有米糠多糖、二十八碳烷醇、神经酰胺等生理功能卓越的活性物质2。其中水 溶性维生素是一类重要的营养成分，在各种保健品3，功能型饮料中得到应用。 烟酸和烟酰胺可以促进头皮血液循环，防止脱发；VB6具有美发成效；VB具有 滋养与深层清洁的作用，因此化装品中也常添加微量的维生素4。淘米水中也含 有维生素，用淘米水洁肤洗发，刺激性小，有润肤护发成效。因此，测定米糠和 淘米水中的维生素含量很有必要。测定维生素的方法有紫外分光光度

8、法、荧光法和高效液相色谱法HPLC 。但HPLC技术用于米糠中水溶性维生素的测定还未见报道。本文采用HPLC 建立了米糠及淘米水中的水溶性维生素的测定方法，对样品前处理方法进展了研 究，对测定体系各影响因素进展了优化。方法简便快速，准确可靠，对复杂体系 中水溶性维生素的测定具有重要的参考价值。1 实验局部1.1仪器、试剂与样品仪器：Waters505高效液相色谱仪包括2487紫外检测器，Empower色 谱工作站。色谱柱： Hypersil C18 250 。超声波振荡器 BRANSON SB 3200 T,上海；固相萃取柱固相PT-系列，河北省津杨滤材厂等。试剂：VB6纯度N 99%、烟酰胺

9、纯度N 99%、烟酸纯度、VB 纯度98%L均购自国药集团化学试剂上海；甲醇为色谱纯，水为超纯水， 其他试剂为分析纯。米糠样品来源于无锡秦良商贸。糯米样品产地：云南西双版纳自治州。1.2 色谱条件色谱柱：Hypersil C8柱250，流动相：A: 0.1 %磷酸水溶液,B:甲醇， 以体积比A:B=88:12等度洗脱；流速为0.6 mL/min。检测波长：266nm；进样量 20吐。试液的制备 标准溶液的制备准确称取约g的四种维生素标准品，用盐酸溶解并稀释到50 mL,摇匀，分 别得到 X10-3 g/mL, X10-3 g/mL, X 10-3g/mL 和 X 10-3.g/mL 的 VBV

10、B6，烟 酸和烟酰胺的标准储藏液，于4C冰箱中保存。储藏液用流动相稀释得所需浓度 的标准溶液。1.3.2 米糠供试品溶液的制备取米糠于100mL锥形瓶中，参加20mL混合溶剂体积比为80:20的甲醇一 盐酸溶液超声提取30min，过滤，滤渣用一样的条件重复提取两次，合并提取 液。用旋转蒸发仪蒸发浓缩，浓缩液用无水乙醚萃取两次脱脂，水相经pm滤膜 过滤，再过固相萃取柱，定容至10mL容量瓶中，即得米糠供试品溶液。1.3.3 淘米水供试品溶液的制备取100g云南产糯米加100mL自来水搅拌20min，沥出洗米水，然后定容至 100mL。过滤，将滤液在12000r/min下离心15min，取上清液，

11、经滤膜过滤，再 过固相萃取柱，即得淘米水供试品溶液。2. 结果与讨论2.1样品预处理8方法优化米糠的主要成分有蛋白质、脂肪酸、胆甾醇、多糖等。虽然VBVB6、烟 酸和烟酰胺都是水溶性物质，但采用水为提取剂，蛋白质、碳水化合物也会随之 被提取出来，干扰测定并污染色谱柱。尝试了纯甲醇以及90甲醇和10的盐 酸水溶液提取维生素，发现不能将水溶性维生素提取完全； 70的甲醇和 30 的盐酸水溶液虽能将水溶性维生素提取完全，但米糠中的蛋白质也会随之被提取 出来；用 80甲醇和 20盐酸水溶液提取，蛋白质会变性产生沉淀，碳水化合 物也不溶，而VBVB6、烟酸和烟酰胺又有较好的溶解度，因此实验采用80% 甲

12、醇的酸性水溶液提取三次，浓缩，脱脂，再过固相萃取柱去除剩余的干扰物质。糯米淘米水中也含有大量的蛋白质，脂肪酸，多糖等，尝试了用等体积的10%的三氯乙酸去蛋白，由于酸性太强，体系不稳定；用sevag法去蛋白，需要 屡次重复，才能较彻底的去除蛋白，比拟耗时；而用高转速离心机将蛋白离心下 来，别离效果良好。再过固相萃取柱以去除剩余的干扰物质，可以防止污染色谱 柱。2.2色谱条件的优化文献中测定B族维生素大多采用在流动相中加KH2PO4调节酸度或加磺酸盐 7，9 -11 等离子对试剂抑制分析物的极性，但加盐后会对高效液相色谱仪的泵头 产生一定的损伤；还有一些报道采用的是耐水色谱柱7，11，采用全水体系

13、做流动 相，但耐水色谱柱价格昂贵。本实验采用普通的C18色谱柱，在流动相中参加稀 酸调节酸度，对B族维生素进展测定。实验中首先尝试流动相为%醋酸水溶液甲醇体积比为88:12等度洗脱， 对四种水溶性维生素进展别离，发现烟酸和 VB6 在此条件下不能分开。也尝试 了%三氟乙酸甲醇体系，四种维生素同样无法得到别离。将流动相中的水相改换为磷酸水溶液，调整磷酸浓度来实现四种水溶性维生 素的别离。实验中尝试了%，%，%的磷酸水溶液进展实验。采用%磷酸水溶液 时，四种维生素混合标准溶液得到了较好的别离。但是米糠实际样品测定时，发 现VBVB6与相邻未知物质的峰未到达完全别离。改用磷酸水溶液，米糠样 品中的待

14、测维生素别离的较好；换用%磷酸水溶液时，效果与%磷酸水溶液相当。 但酸性加大会对柱子有一定的伤害，综合各种因素，选用%磷酸水溶液甲醇体系， 以体积比为88:12 等度洗脱。考察了%磷酸水溶液与甲醇不同配比时对四种维生素别离的影响，发现流动 相中水相比例降到85%时四种维生素无法到达别离，水相比例为88%时，四种 维生素在 8min 内到达基线别离。在上述优化色谱条件下得到 4 种维生素的标样图，见图 1图 1 水溶性维生素混合标准溶液色谱图峰标：1； 2.烟酰胺；3.烟酸；62. 重现性试验取 4 种维生素的标准储藏液等体积混和，然后稀释 16 倍，在上述优化实验条件下连续5次进样，测得其峰面

15、积及保存时间的相对标准偏向（RSD均小于2，结果说明其重现性较好。如表 1所示组分表1重现性试验RSD %（n=5）保存时间峰面积VB1 烟酸VB6烟酰胺2.标准曲线及检出限配置了一系列不同浓度的VBVB6、烟酸和烟酰胺的混合标准溶液，在优 化的实验条件下，进展了测定，得出各组分的线性回归方程、线性范围，并以3 倍信噪比得到检测限，结果如表 2 所示。结果显示线性范围宽，检测限低。表 2 回归方程及检测限组分线性范围/g/mL回归方程R2检测限/ （g/mLVB1X 10-7-8.5X10-5Y=X1074.3X10-7烟酸9.3X10-76.5X10-5Y=X1073.2X10-7VB6X1

16、0-6-7.4X10-5Y=X1073.4X10-7烟酰胺6.0X10-76.2X10-5Y=6.06X1073.0X10-72.4 样品的测定及回收率实验按方法处理好样品，在优化好的色谱条件下，进展测定。米糠样品的色谱图见图2；米糠及淘米水中维生素测定结果见表 3。图 2 米糠样品的色谱图表 3 米糠及糯米淘米水中维生素的测定结果 (n=3)样品组分含量RSDVB1X 10-6 g/g米糠烟酸X 10-6 g/gVB61.3X 10-6 g/g烟酰胺X 10-6 g/gVB10.9X10-6g/mL淘米水烟酸5.9 X 10-6 g/mLVB6未检出烟酰胺1.6 X 10-6 g/mL取米糠

17、供试液做加标回收试验。结果见表4。回收率在96.0%99.9%, 结果可靠。表 4 4 种水溶性维生素的回收率测定结果 n=3维生素试液浓度(g/mL)加标准试液(g/mL)测定含量(g/ml)平均回收率/(%)RSD/(%)VB1X10-6X10-6X10-60. 5VB5X 10-6X 10-6X 10-6VB6X 10-6X 10-6X 10-6烟酰胺X10-6X10-6X10-63. 结语：采用80%甲醇的0.01 mol/L盐酸溶液超声提取，石油醚脱脂，并经固相萃取柱除去杂质，对米糠和淘米水试样进展了提取和纯化。采用普通的C18液相色谱柱，在流动相中参加稀酸调节酸度，可以简单、快速地

18、测定米糠中的四种水溶性维生素VB, VB6，烟酸，烟酰胺。本法简便准确、可靠、重现性好，对复杂 体系中的水溶性维生素的测定具有一定的参考意义。同时本文的测定结果也为开 发天然绿色米糠化装品提供了一定的根据。参考文献毛金水，贺绪军，李翔，等米糠营养素提取的研究与消费应用J.副产物综合利用,2005,34(6):45 472刘元法,王兴国,倪伯文,等米糠活性物质二十八醇功能性研究J.中国油 脂，2001，26(5): 6365吴淑君，庄志辉,朱孟丽，等高效液相色谱法测定保健品中的6种水溶性维生素 及咖啡因J.色谱,2006,24(3):319张秀真，高素莲.RP-HPLC法测定美容液中水溶性维生素

19、的含量J.安徽大学 学报(自然科学版),2005,29(6): 7981陈恕华紫外分光光度法测定维生素B6J.理化检验一化学分 册,2005,41(7):519、 521高甲友,吴曙.荧光光度法测定维生素B1J.理化检验一化学分 册,1999,35(3):1331347贺利民，吕岱竹,苏贻娟.高效液相法同时测定多种水溶性维生素J.海南大学 学报自然科学版,2004,22(1):5456于林梁 潢晓兰,吴惠勤饲料中生物素的高效液相色谱测定J.分析测试学 报,2003,22(5):1021049 崔蓉，李皎，王洪玮水溶性维生素的高效液相色谱测定方法的研究J中国卫 生检验杂志,2005,15(1):555710 丰烨华，张萍，孔祥虹，等.高效液相色谱法同时测定扁桃仁中的水溶性维生素 C,B1,B2和 B6j.色谱,2005,23(5):53854111 蒋晔，刘红菊,郝晓花反相高效液相色谱法同时测定9种水溶性维生素J.药 物分析杂志,2005,25(3): 339341