四章分子发光分析

1 第四章第四章 分子发光分析分子发光分析 分子发光包括荧光、分子发光包括荧光、磷光、化学发光、生物磷光、化学发光、生物发光和散射光谱等。发光和散射光谱等。2 分子发光分析法教学要求w掌握分子荧光、磷光和化学发光的产生机理；掌掌握分子荧光、磷光和化学发光的产生机理；掌握激发光谱和发射光谱特征。握激发光谱和发射光谱特征。w掌握荧光与分子结构的关系以及溶液的荧光（磷掌握荧光与分子结构的关系以及溶液的荧光（磷光）强度影响因素。光）强度影响因素。w了解荧光（磷光）分析法的特点及定量测定方法。了解荧光（磷光）分析法的特点及定量测定方法。w了解磷光分析法的类型。了解磷光分析法的类型。w了解荧光、磷光和化学发光分析仪器的结构。了解荧光、磷光和化学发光分析仪器的结构。3w“发光发光”w每种物质分子中都具有一系列紧密每种物质分子中都具有一系列紧密相隔的电子相隔的电子能级能级，而每个电子能级中又包含一系列的，而每个电子能级中又包含一系列的振动振动能级和转动能级能级和转动能级。w当分子当分子吸收能量吸收能量(电能、热能、光能或化学能等电能、热能、光能或化学能等)后可跃迁到后可跃迁到激发态激发态。分子在激发态是不稳定的，。分子在激发态是不稳定的，它很快跃迁回到基态。它很快跃迁回到基态。w在跃迁回到基态的过程中将多余的能量以光子在跃迁回到基态的过程中将多余的能量以光子形式辐射出来这种现象称为形式辐射出来这种现象称为“发光发光”。第一节 分子荧光和磷光分析4（一）磷光和荧光 荧光和磷光，并不是说物体自然荧光和磷光，并不是说物体自然发光。当物质吸收外界能量后，转发光。当物质吸收外界能量后，转换成为可见光，即时转换的称为荧换成为可见光，即时转换的称为荧光，如荧光笔，荧光材料；光，如荧光笔，荧光材料；如果可持续发光就称为磷光，如闹如果可持续发光就称为磷光，如闹钟晚上关灯可以看到数字及指针。钟晚上关灯可以看到数字及指针。一、基本原理5（二）荧光与磷光的产生过程（二）荧光与磷光的产生过程 luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence1.1.分子能级与跃迁分子能级与跃迁 分子能级比原子能级复杂；分子能级比原子能级复杂；在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；基态基态(S0)激发态激发态(S1、S2、激发态振动能级激发态振动能级)：吸收吸收特定频率的辐射；特定频率的辐射；激发态激发态基态：多种途径和方式基态：多种途径和方式(见能级图见能级图)；速度最；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；快、激发态寿命最短的途径占优势；第一、第二、第一、第二、电子激发单重态电子激发单重态 S1、S2；第一、第二、第一、第二、电子激发三重态电子激发三重态 T1、T2 ；62.2.电子激发态的多重度电子激发态的多重度 电子激发态的多重度：电子激发态的多重度：M=2S+1 S S为电子自旋量子数的代数和为电子自旋量子数的代数和(0(0或或1)1)；平行自旋比成对自旋稳定平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则洪特规则)，三重态能级比相应，三重态能级比相应单重态能级低；单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态；大多数有机分子的基态处于单重态；S0T1 禁阻禁阻跃迁；跃迁；通过其他途径通过其他途径进入进入(见能级图见能级图)；进入的几率小进入的几率小；7单重态与三重态 电子自旋有顺时针和反时针的两个方向，通常电子自旋有顺时针和反时针的两个方向，通常用用和和表示。表示。ms是不依赖于其它三个量子数的独是不依赖于其它三个量子数的独立量取值为立量取值为+1/2、-1/2。电子激发态的多重态用电子激发态的多重态用2s+1表示，表示，s为电为电子自旋量子数的代数和，其数值为子自旋量子数的代数和，其数值为0或或1。据泡利不相容原理，分子内同一轨道中的两个电子必须据泡利不相容原理，分子内同一轨道中的两个电子必须具有相反的旋转方向，即自旋配对，自旋量子数的代数具有相反的旋转方向，即自旋配对，自旋量子数的代数和为和为s=0，其分子态的多重性为其分子态的多重性为M=2s+1=1，该分子就该分子就处在处在单重态单重态，用符号，用符号S表示绝大多数有机分子的表示绝大多数有机分子的基态基态是单重态是单重态倘若分子吸收能量后，自旋方向不变，即分倘若分子吸收能量后，自旋方向不变，即分子处在子处在激发单重态激发单重态。8w如果在跃迁到高能级的过程中还伴随着电子如果在跃迁到高能级的过程中还伴随着电子自旋方向的改变，这时，分子便具有两个不自旋方向的改变，这时，分子便具有两个不配对的电子，配对的电子，则则s=1，M=2s+1=3，该分子处该分子处在激发的三重态，用符号在激发的三重态，用符号T表示。表示。wS0，S1和和S2分别表示分子的基态、第一和第分别表示分子的基态、第一和第二激发单重态；二激发单重态；wT1、T2则分别表示分子的第一和第二激发三则分别表示分子的第一和第二激发三重态重态;w处在分立的电子轨道的非成对的电子，平行处在分立的电子轨道的非成对的电子，平行自旋比配对自旋更稳定自旋比配对自旋更稳定(洪德规则洪德规则)，因此，三，因此，三重激发态能级总是比相应的单重态激发态的重激发态能级总是比相应的单重态激发态的能量略低些能量略低些 9w 处在激发态的分子是不稳定的，它可能通过处在激发态的分子是不稳定的，它可能通过辐射跃迁或非辐射跃迁等去激发过程回到基态，辐射跃迁或非辐射跃迁等去激发过程回到基态，当然，也可能由于分子之间的作用产生去激发当然，也可能由于分子之间的作用产生去激发过程。过程。辐射跃迁去激发过程有光子的发射时，辐射跃迁去激发过程有光子的发射时，产生荧光或磷光现象，非辐射跃迁指以热的形产生荧光或磷光现象，非辐射跃迁指以热的形式辐射多余的能量，包括振动弛豫、内部转移、式辐射多余的能量，包括振动弛豫、内部转移、系间跨越、外部转移等。系间跨越、外部转移等。各种跃迁方式发生的各种跃迁方式发生的可能性及其程度，既和物质分子结构有关，也可能性及其程度，既和物质分子结构有关，也和激发时的物理和化学环境等因素有关。和激发时的物理和化学环境等因素有关。103.激发态基态的能量传递途径 电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁射跃迁(发光发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；和无辐射跃迁等方式失去能量；传递途径传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛豫豫无辐射跃迁 激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大；发光强度相对大；荧光荧光：10-710-9 s,第一激发第一激发单重态单重态的最低振动能级的最低振动能级基态；基态；磷光磷光：10-410s；第一激发第一激发三重态三重态的最低振动能级的最低振动能级基态；基态；11非辐射能量传递过程非辐射能量传递过程 振动弛豫振动弛豫：同一：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12 s。内转换内转换：同多重度电子能级中同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。等能级间的无辐射能级交换。通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。激发单重态的最低振动能级。外转换外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭猝灭”。系间跨越系间跨越：不同多重态：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋轨道耦合进行。轨道耦合进行。12辐射能量传递过程辐射能量传递过程 荧光发射荧光发射：电子由：电子由第一激发第一激发单重态单重态的最低振动能级的最低振动能级基态（基态（多为多为 S1 S0跃迁跃迁），），发射波长为发射波长为 2的荧光；的荧光；10-710-9 s。由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；长；2 2 1；磷光发射磷光发射：电子由电子由第一激发第一激发三重态三重态的最低振动能级的最低振动能级基态（基态（T1 S0跃迁跃迁）；）；电子由电子由S0进入进入T1的可能过程：（的可能过程：（S0 T1禁阻跃迁）禁阻跃迁）S0 激发激发振动弛豫振动弛豫内转移内转移系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫 T1 发光速度很慢：发光速度很慢：10-4100 s。光照停止后，可持续一段时间。光照停止后，可持续一段时间。13振动弛豫（松弛）振动弛豫（松弛）VR内转换内转换 ic系间跨越系间跨越(窜越窜越)isc外部转移外部转移 14第一节 分子荧光和磷光分析 荧光、磷光荧光、磷光 能级图能级图 S0S2S1T1吸光2吸光1振振动弛豫在同一电子能级中，电子由高振动能级转至低振动能级，而将多余的能量以热热 的形式发出。振动弛豫振动弛豫15第一节 分子荧光和磷光分析内转移内转移 当当两个电子能级两个电子能级非常靠非常靠近以至其振动能级有近以至其振动能级有重叠重叠时，常发生电子由高能级时，常发生电子由高能级以以无辐射跃迁方式无辐射跃迁方式转移至转移至低能级。右图中指出，处低能级。右图中指出，处于于高激发单重态高激发单重态的电子，的电子，通过内转移及振动弛豫，通过内转移及振动弛豫，均跃回到均跃回到第一激发单重态第一激发单重态的最低振动能级。的最低振动能级。荧光、磷光 能级图S0S2S1T1吸光2吸光1内转移内转移16第一节 分子荧光和磷光分析荧光发射荧光发射 处于处于第一激发单重态第一激发单重态中中的电子跃回至的电子跃回至基态各振动能级基态各振动能级时，将得到最大波长为时，将得到最大波长为 3的荧的荧光。注意：光。注意：基态中也有振动驰基态中也有振动驰豫跃迁豫跃迁。很明显，。很明显，3的波长的波长较激发波长较激发波长 1或或 2都长，而都长，而且不论电子开始被激发至什么且不论电子开始被激发至什么高能级，最终将只发射出波长高能级，最终将只发射出波长 3为的荧光。荧光的产生在为的荧光。荧光的产生在10-7-10-9s内完成。内完成。荧光、磷光 能级图S0S2S1T1吸光2吸光1荧光3荧光17第一节 分子荧光和磷光分析系间窜跃系间窜跃 指指不同多重态间不同多重态间的的无无辐射跃迁辐射跃迁，例如，例如S1T1就就是一种系间窜跃。通常，是一种系间窜跃。通常，发生系间窜跃时，电子由发生系间窜跃时，电子由S1的较低振动能级转移至的较低振动能级转移至T1的较高振动能级处。有的较高振动能级处。有时，通过热激发，有可能时，通过热激发，有可能发生发生T1S1，然后由然后由S1发发生荧光。这是产生生荧光。这是产生延迟荧延迟荧光的机理光的机理。荧光、磷光 能级图S0S2S1T1吸光2吸光1荧光3系间窜跃系间窜跃18第一节 分子荧光和磷光分析磷光发射磷光发射 电子由基态单重态激发至第一激发三重态的几率很小，因为这是禁阻跃迁。但是，由第一激发单重态的最低振动能级，有可能以系间窜跃方式转至第一激发三重态，再经过振动驰豫，转至其最低振动能级，由此激发态跃回至基态时，便发射磷光，这个跃迁过程（T1S0）也是自旋禁阻的，其发光速率较慢，约为10-4-10s。因此，这种跃迁所发射的光，在光照停止后，仍可在光照停止后，仍可持续一段时间。持续一段时间。荧光、磷光 能级图S0S2S1T1吸光2吸光1荧光3磷光磷光19第一节 分子荧光和磷光分析外转移外转移 指激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用及指激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用及能量转移，使荧光或磷光强度减弱甚至消失。这一现象能量转移，使荧光或磷光强度减弱甚至消失。这一现象称为称为“熄灭熄灭”或或“猝灭猝灭”。荧光与磷光的根本区别：荧光与磷光的根本区别：荧光荧光是由激发单重态单重态最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的；而磷光磷光是由激发三重态激发三重态的最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的。20第一节 分子荧光和磷光分析（三（三）激发光谱曲线和荧光、磷光光谱曲线激发光谱曲线和荧光、磷光光谱曲线 荧光和磷光均为光致发光，因此必须选择合适的激发光波长，可根据它们的激发光谱曲线来确定。绘制激绘制激发光谱曲线时，固定测量波长为荧光（或磷光）最大发发光谱曲线时，固定测量波长为荧光（或磷光）最大发射波长，然后改变激发波长，根据所测得的荧光（磷光）射波长，然后改变激发波长，根据所测得的荧光（磷光）强度与激发光波长的关系，即可绘制强度与激发光波长的关系，即可绘制 激发光谱曲线。应该指出，激发光谱曲线与其吸收曲线可能相同，但激发光谱曲线激发光谱曲线是荧光强度与波长的关系曲线，吸收曲吸收曲线则是线则是吸光度与波长的关系曲线，两者在性质上是不同的。当然，在激发光谱曲线的最大波长处，处于激发态在激发光谱曲线的最大波长处，处于激发态的分子数的分子数21第一节 分子荧光和磷光分析目是最多的，这可说明所吸收的光能量也是最多目是最多的，这可说明所吸收的光能量也是最多的，自然能产生最强的荧光的，自然能产生最强的荧光。如果如果 固定激发光波长为其最大激发波长，固定激发光波长为其最大激发波长，然后测定不同的波长时所发射的荧光或磷光强度然后测定不同的波长时所发射的荧光或磷光强度，即可绘制即可绘制荧光或磷光光谱曲线荧光或磷光光谱曲线。在荧光和磷光的产生过程中，由于存在各种在荧光和磷光的产生过程中，由于存在各种形式的形式的无辐射跃迁无辐射跃迁，损失能量，所以它们的最大，损失能量，所以它们的最大发射波长都向长波方向移动，以发射波长都向长波方向移动，以磷光波长磷光波长的移动的移动最多，而且它的强度也相对较弱。最多，而且它的强度也相对较弱。22第一节 分子荧光和磷光分析（1）Stokes位移位移 在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长位移到较长的波长的波长，称为Stokes位移位移。这是由于受激分子通过振动弛豫而失去转动能，也由于溶液中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量的损失。因此，在激发和发射之间产生了能量损失。（2）荧光发射光谱的形状与激发波长无关）荧光发射光谱的形状与激发波长无关 因为分子吸收了不同能量的光子可以由基态激发到几个不同的电子激发态不同的电子激发态，而具有几个吸收带。由于较高激发态通过内转换及转动弛豫回到第一电子激发态的几率较高，荧光发射光谱的普遍特性：荧光发射光谱的普遍特性：23第一节 分子荧光和磷光分析远大于由高能激发态直接发射光子的速度，故在荧光发射时，不论用哪一个波长的光辐射激发，电子都从第一从第一电子激发态的最低振动能层返回到基态的各个振动能层电子激发态的最低振动能层返回到基态的各个振动能层，所以荧光发射光谱与激发波长无关。（3）镜像规则）镜像规则 通常荧光发射光谱荧光发射光谱和它的吸收光谱吸收光谱呈镜像对称关系。吸收光谱吸收光谱是物质分子由基态激发至第一电子激发态的各振动能层形成的。其形状决定于第一电子激发态第一电子激发态中各 振动能层的分布情况振动能层的分布情况。荧光光谱荧光光谱是激发分子从第一电子激发态的最低振动24第一节 分子荧光和磷光分析能层回到基态中各不同能层形成的。所以荧光光谱的形荧光光谱的形状状决定于基态中各振动能层的分布情况基态中各振动能层的分布情况。基态中振动能层的分布和第一电子激发态中振动能基态中振动能层的分布和第一电子激发态中振动能层的分布情况是类似的。层的分布情况是类似的。因此荧光光谱的形状和吸收光谱的形状极为相似。由基态最低振动能层跃迁到 第一电子激发态各个振第一电子激发态各个振动能层的吸收过程中，振动能层越高动能层的吸收过程中，振动能层越高，两个能层之间的能量差越大，即激发所需的能量越高，所以吸收峰的波长越短。反之，由 第一电子激发态的最低振动能层降落第一电子激发态的最低振动能层降落到基态各个振动能层的荧光发射过程中，基态振动能层到基态各个振动能层的荧光发射过程中，基态振动能层越高越高，25第一节 分子荧光和磷光分析两个能层之间的能量差越小，荧光峰的波长越长。另外，也可以从位能曲线解释镜像规则。由于光吸收在大约10-15的短时间内发生，原子核没有发生明显的位移，即电子与核之间的位移没有发生变化。假如在吸收过程中，基态的零振动能层与激发态的第二振动能层之间的跃迁几率跃迁几率最大，那么，在荧光发射过程中，其相反跃迁的几率跃迁的几率也应该最大。也就是说，吸收和发射的能量都最大。26第一节 分子荧光和磷光分析（四）荧光和分子结构的关系（四）荧光和分子结构的关系分子产生荧光必须具备两个条件：分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构，才 能吸收激发光；吸收了与其本身特征频率相同的能量之后，必须具有 一定的荧光量子产率。27第一节 分子荧光和磷光分析1.量子产率量子产率 荧光量子产率也叫荧光效率或量子效率，它表示物表示物质发射荧光的能力质发射荧光的能力，通常用下式表示 =发射荧光分子数发射荧光分子数/激发分子总数激发分子总数 或或 =发射荧光量子数发射荧光量子数/吸收光量子数吸收光量子数 在产生荧光的过程中，涉及到许多辐射辐射和无辐射跃无辐射跃迁迁过程，如荧光发射、内转移，系间窜跃和外转移等。很明显，荧光的量子产率，将与上述每一个过程的速率常数有关。28第一节 分子荧光和磷光分析 若用数学式来表达这些关系，得到若用数学式来表达这些关系，得到 =kf /（kf+ki）式中式中kf为荧光发射过程的速率常数，为荧光发射过程的速率常数，ki为为其它有关其它有关过程的速率常数的总和过程的速率常数的总和。凡是能使凡是能使kf 值升高而使其它值升高而使其它ki值降低的因素，都可增值降低的因素，都可增强荧光。强荧光。实际上，对于高荧光分子，例如荧光素，其量子产率实际上，对于高荧光分子，例如荧光素，其量子产率在某些情况下接近在某些情况下接近1，说明，说明 kI很小，可以忽略不计。一很小，可以忽略不计。一般来说，般来说，kf主要取决于化学结构，而主要取决于化学结构，而 ki则主要取决于化则主要取决于化学环境，同时也与化学结构有关。学环境，同时也与化学结构有关。29第一节 分子荧光和磷光分析 磷光的量子产率与此类似。2.荧光与有机化合物的结构荧光与有机化合物的结构（1）跃迁类型）跃迁类型 实验证明，对于大多数荧光物质，首先经历或n（非键电子轨道）激发，然后经过振动弛豫或其他无辐射跃迁，再发生或n跃迁而得到荧光。在这两种跃迁类型中，跃迁常能发出较强的荧光跃迁常能发出较强的荧光（较大的量子产率）。这是由于跃迁具有较大的摩尔吸光系数（一般比n大100-1000倍），其次，跃迁的寿命约为10-710-9s，比n跃迁的寿命10-510-7s要短。30第一节 分子荧光和磷光分析在各种跃迁过程的竞争中，它是有利于发射荧光的。此外，在跃迁过程中，通过系间窜跃至三重态的速率常数也较小（S1T!能级差较大），这也有利于荧光的发射，总之，跃迁是产生荧光的主要跃迁类型。跃迁是产生荧光的主要跃迁类型。（2）共轭效应）共轭效应 实验证明，容易实现激发 的芳香族化合物容易发生荧光，能发生荧光的脂肪族和脂环族化合物极少（仅少数高度共轭体系化合物除外）。此外，增加体系增加体系的共轭度的共轭度，荧光效率一般也将增大荧光效率一般也将增大。例如，在多烯结构中，ph（CH=CH）3 ph和ph（CH=CH）2 ph在苯中的荧光效率31第一节 分子荧光和磷光分析分别为0.68和0.28。共轭效应使荧光增强的原因共轭效应使荧光增强的原因：主要是由于增大荧光物质的摩尔吸光系数，有利于产生更多的激发态分子，从而有利于荧光的发生。(3)(3)刚性平面结构刚性平面结构 实验发现，多数具有刚性平面结构的有机分子具有强烈的荧光。因为这种结构可以减少分子的振动，使分因为这种结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用减少，也就减少了子与溶剂或其它溶质分子的相互作用减少，也就减少了碰撞去活的可能性。碰撞去活的可能性。32第一节 分子荧光和磷光分析（4）取代基效应）取代基效应 芳香族化合物苯环上的不同取代基对该化合物的荧光强度和荧光光谱有很大的影响。给电子基团，如-OH、-OR、-CN、-NH2、-NR2等，使荧光增强。因为产生了p-共轭作用，增强了电子共轭程度，使最低激发单重态与基态之间的跃迁几率增大。吸电子基团，如-COOH、-NO、-C O、卤素等，会减弱甚至会猝灭荧光。卤素取代基随原子序数的增加而荧光降低。这可能是卤素取代基随原子序数的增加而荧光降低。这可能是由所谓由所谓“重原子效应重原子效应”使系间跨越速率增加所致。在重使系间跨越速率增加所致。在重33第一节 分子荧光和磷光分析原子中，能级之间的交叉现象比较严重，因此容易发生原子中，能级之间的交叉现象比较严重，因此容易发生自旋轨道的相互作用，增加了由单重态转化为三重态的自旋轨道的相互作用，增加了由单重态转化为三重态的速率。速率。取代基的空间障碍对荧光也有影响。取代基的空间障碍对荧光也有影响。立体异构现象对荧光强度有显著的影响。立体异构现象对荧光强度有显著的影响。3.金属螯合物的荧光金属螯合物的荧光 除过渡元素的顺磁性原子会发生线状荧光光谱外，大多数无机盐类金属离子，在溶液中只能发生无辐射跃迁，因而不产生荧光。但是，在某些情况下，金属螯合物却能产生很强的荧光，并可用于痕量金属元素分析。34第一节 分子荧光和磷光分析（1）螯合物中配位体的发光）螯合物中配位体的发光 不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于不是刚性结构，分子处于非同一平面，因而不发生荧光。若这些化合物和金属离子形成螯合物，随着分子的刚性增强，平面结构的增大，常会发生荧光。如8-羟基喹啉本身有很弱的荧光，但其金属螯合物具有很强的荧光。（2）螯合物中金属离子的特征荧光）螯合物中金属离子的特征荧光 这类发光过程通常是螯合物首先通过配位体的跃迁激发，接着配位体把能量转给金属离子，导致dd35第一节 分子荧光和磷光分析 跃迁和ff跃迁，最终发射的是dd跃迁和ff跃迁光谱。36第一节 分子荧光和磷光分析（四）溶液的荧光（或磷光）强度（四）溶液的荧光（或磷光）强度1.荧光强度与溶液浓度的关系荧光强度与溶液浓度的关系 荧光强度If正比于吸收的光量Ia与荧光量子产率。If =Ia 式中为荧光量子效率，又根据Beer定律 Ia=I0-It=I0(1-e-l C)I0和It分别是入射光强度和透射光强度。代入上式得 If=I0(1-10-l c)=I0(1-e-2.3 l c)37第一节 分子荧光和磷光分析整理得：If =2.3 I0 lc 当入射光强度当入射光强度I0 和和l l一定时一定时，上式为：If =K c 即荧光强度与荧光物质的浓度成之正比，但这种线性关系只有在极稀的溶液中，当当 l lc 0.050.05时才成立时才成立。对于较浓溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因，使荧光强度和浓度不呈线性关系。38第一节 分子荧光和磷光分析（2）影响荧光强度的因素）影响荧光强度的因素 溶剂溶剂对荧光强度的影响对荧光强度的影响。溶剂的影响可分为一般溶剂效应一般溶剂效应和特殊溶剂效应特殊溶剂效应。一般溶剂效应一般溶剂效应指的是溶剂的折射率和介电常数的影响。特殊溶剂效应特殊溶剂效应指的是荧光体和溶剂分子间的特殊化学作用，如氢键的生成和化合作用。一般溶剂效应是普遍的，而特殊溶剂效应则决定于溶剂和荧光体的化学结构。特殊溶剂效应所引起荧光光谱的移动值，往往大于一般溶剂效应所引起的影响。由于溶质分子与溶剂分子间的作用，使同一种荧光物质在不同的39第一节 分子荧光和磷光分析溶剂中的荧光光谱可能会有显著不同。有的情况，增大溶剂的极性，将使n跃迁的能量增大，跃迁的能量减小，而导致荧光增强，荧光峰红移。但也有相反的情况，例如，苯胺奈磺酸类化合物在戊醇、丁醇、丙醇、乙醇和甲醇中，随着醇的极性增大，荧光强度减小，荧光峰蓝移。因此荧光光谱的位置和强度与溶剂极性之间的关系，应根据荧光物质与溶剂的不同而异。如果溶剂和荧光物质形成了化合物，或溶剂使荧光物质的电力状态改变，则荧光峰位和强度都会发生较大的变化。40第一节 分子荧光和磷光分析 温度对荧光强度的影响温度对荧光强度的影响 温度上升使荧光强度下降。其中一个原因是分子的内分子的内部能量转化作用部能量转化作用。当激发分子接受额外热能时，有可能使激发能转换为基态的振动能量，随后迅速振动弛豫而丧失振动能量。另一个原因是碰撞频率增加碰撞频率增加，使外转换的去活几率增加。溶液溶液pH值对荧光强度的影响值对荧光强度的影响 带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化合物的荧光与溶液的pH有关。不同的pH值，化合物所处状态不同，不同的化合物或化合物的分子与其离子在电子构型上有所41第一节 分子荧光和磷光分析 不同，因此，它们的荧光强度和荧光光谱就有一定的差别。对于金属离子与有机试剂形成的发光鏊合物，一方面pH会影响鏊合物的形成，另一方面还会影响鏊合物的组成，因而影响它们的荧光性质。内滤光作用和自吸收现象内滤光作用和自吸收现象 溶液中若存在能吸收激发或荧光物质所发射光能的溶液中若存在能吸收激发或荧光物质所发射光能的物质，就会使荧光减弱，这种现象称为物质，就会使荧光减弱，这种现象称为“内滤光作用内滤光作用”。内滤光作用的另一种情况是荧光物质的荧光发射光的短波长的一端与该物质的吸收光谱的长波长一端有重叠。42第一节 分子荧光和磷光分析在溶液浓度较大时，一部分荧光发射被自身吸收，产生“自吸收”现象而降低了溶液的荧光强度。（3）溶液荧光猝灭）溶液荧光猝灭 荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象称为用引起荧光强度降低的现象称为荧光猝灭荧光猝灭。能引起荧光强度降低的物质称为猝灭剂。导致荧光猝灭的主要类型：碰撞猝灭碰撞猝灭 碰撞猝灭碰撞猝灭是指处于激发单重态的荧光分子与猝灭剂分子相碰撞，使激发单重态的荧光分子以无辐射跃迁的方式43第一节 分子荧光和磷光分析回到基态，产生猝灭作用。静态猝灭（组成化合物的猝灭）静态猝灭（组成化合物的猝灭）由于部分荧光物质分子与猝灭剂分子生成非荧光的配合物而产生的。此过程往往还会引起溶液吸收光谱的改变。转入三重态的猝灭转入三重态的猝灭 分子由于系间的跨越跃迁，由单重态跃迁到三重态。转入三重态的分子在常温下不发光，它们在与其它分子的碰撞中消耗能量而使荧光猝灭。溶液中的溶解氧对有机化合物的荧光产生猝灭效应是44第一节 分子荧光和磷光分析由于三重态基态的氧分子和单重激发态的荧光物质分子碰撞，形成了单重激发态的氧分子和三重态的荧光物质分子，使荧光猝灭。发生电子转移反应的猝灭发生电子转移反应的猝灭 某些猝灭剂分子与荧光物质分子相互作用时，发生了电子转移反应，因而引起荧光猝灭。荧光物质的自猝灭荧光物质的自猝灭 在浓度较高的荧光物质溶液中，单重激发态的分子在发生荧光之前和未激发的荧光物质分子碰撞而引起的自猝灭。有些荧光物质分子在溶液浓度较高时会形成二聚体或多聚体，使它们的吸收光谱发生变化，也引起溶液荧光强度的降低或消失。45第一节 分子荧光和磷光分析二、荧光分析仪二、荧光分析仪 用于测量荧光的仪器由激发光源、样品池、用于选择激发光波长和荧光波长的单色器以及检测器四部分组成。（荧光分析仪器基本部件示意图见教材（荧光分析仪器基本部件示意图见教材P.92）由光源发射的光经第一单色器得到所需的激发光波长，通过样品池后，一部分光能被荧光物质所吸收，荧光物质被激发后，发射荧光。为了为了消除入射光和散射光的影响，消除入射光和散射光的影响，46第一节 分子荧光和磷光分析荧光的测量通常在与激发光成直角的方向上进行荧光的测量通常在与激发光成直角的方向上进行。为消除可能共存的其它光线的干扰，如由激发所产生的反射光、Raman光以及为将溶液中杂质滤去，以获得所需的荧光，在样品池和检测器之间设置了第二单色器第二单色器。荧光作用于检测器上，得到响应的电信号。（1）激发光源）激发光源 在紫外-可见区范围，通常的光源是氙灯和高压汞灯。（2）样品池）样品池 荧光用的样品池须用低荧光的材料制成，通常用石英，形状以方形和长方形为宜。47第一节 分子荧光和磷光分析（3）单色器）单色器 光栅（4）检测器）检测器 48 测量荧光的仪器主要由测量荧光的仪器主要由四个部分四个部分组成：激发光源、样品组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。池、双单色器系统、检测器。特殊点特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。基本流程如图：基本流程如图：单色器：单色器：选择激发光波选择激发光波长的第一单色器和选择长的第一单色器和选择发射光发射光(测量测量)波长的第波长的第二单色器；二单色器；光源：光源：灯和高压汞灯，灯和高压汞灯，染料激光器染料激光器(可见与紫可见与紫外区外区)检测器：检测器：光电倍增管光电倍增管。仪器结构流程图仪器结构流程图49第一节 分子荧光和磷光分析三、分子荧光分析法及其应用三、分子荧光分析法及其应用1.荧光分析方法的特点（1）灵敏度高 （2）选择性强（3）试样量少和方法简单 （4）提供比较多的物理参数50第一节 分子荧光和磷光分析 荧光分析法的弱点是它的应用范围小。因为本身能发荧光的物质相对较少，用加入某种试剂的方法将非荧光物质转化为荧光物质进行分析，其数量也不多；另一方面，由于荧光分析的灵敏度高，测定对环境因素敏感，干扰因素较多。2.定量分析方法定量分析方法（1）校准曲线法 （2）比较法3.应用应用（1）元素的荧光测定 （2）有机化合物的荧光测定。51第一节 分子荧光和磷光分析四、磷光分析法四、磷光分析法 分子磷光与分子荧光光谱的主要差别是磷光是第一激发单重态的最低能层，经系间跨越系间跨越跃迁到第一激发三重态，并经振动弛豫振动弛豫至最低振动能层，然后跃迁回到基态发生的。与荧光相比，磷光具有如下三个特点：（1）磷光辐射的波长比荧光长）磷光辐射的波长比荧光长 分子的T1态能量比S1态低。（2）磷光的寿命比荧光长）磷光的寿命比荧光长 由于荧光是S1 S0跃迁产生的，这种跃迁是自旋许52第一节 分子荧光和磷光分析可的跃迁，因而S1态的辐射寿命通常在10-7 10-9s，磷光是T1 S0跃迁产生的，这种跃迁属自旋禁阻的跃迁，其速率常数要小，因而辐射寿命要长，大约为10-4 10s，（3）磷光的寿命和辐射强度对于重原子和顺磁性离子敏磷光的寿命和辐射强度对于重原子和顺磁性离子敏 感。感。1.低温磷光低温磷光 由于激发三重态的寿命长，使激发态分子发生 T1 S0这种分子内部的内转化非辐射去活化过程以及激发态分子与周围的溶剂分子间发生碰撞和能量转移过程，或发生某些光化学反应的几率增大，这些都将使磷光强度53第一节 分子荧光和磷光分析减弱，甚至完全消失。为减少这些去活化过程的影响，通常应在低温下测量磷光。低温磷光分析中，液氮液氮是最常用的合适的冷却剂。是最常用的合适的冷却剂。因此要求所使用的溶剂，在液氮温度（77K）下应具有足够的粘度粘度并能形成透明的刚性玻璃体形成透明的刚性玻璃体，对所分析的试样应具有良好的溶解特性良好的溶解特性。试样的刚性可减少荧光的碰撞猝灭。溶剂应易于提纯，以除去芳香族和杂环化合物等杂质。溶剂应在所研究的光谱区域内没有很强的吸收和发射。最常用的溶剂是EPA，它由乙醇、异戊烷和二乙醚按体积比为2：5：5混合而成。使用含有重原子的混合溶含有重原子的混合溶54第一节 分子荧光和磷光分析剂剂IEPA（由EPA：碘甲烷=10：1组成），有利于系间跨越跃迁，可以增加磷光效应。含重原子的溶剂，由于重原子的高核电荷引起或增强了溶质分子的自旋-轨函耦合作用，从而增大了 S0 T1吸收跃迁和S1T1系间跨越跃迁的几率，有利于磷光的发生和增大磷光的量子产率。这种作用称为外部重原子外部重原子效应效应。当分子中引入重原子取代基，例如，当芳烃分子中引入杂原子或重原子取代基时，也会发生内部重原子效应，导致磷光量子效率的提高。55第一节 分子荧光和磷光分析2.2.室温磷光室温磷光 由于低温磷光需要低温实验装置，溶剂选择的限制等因素，从而发展了多种室温磷光法（RTP）。（1 1）固体基质室温磷光法（固体基质室温磷光法（SS-RTPSS-RTP）此法基于测量室温下吸附于固体基质上吸附于固体基质上的有机化合物所发射的磷光。所用的载体种类较多，有纤维素载体（如滤纸、玻璃纤维）、无机载体（如硅胶、氧化铝）以及有机载体（如乙酸钠、聚合物、纤维素膜）等。理理想的载体想的载体是既能将分析物质牢固地束缚在表面或基质中以56第一节 分子荧光和磷光分析增加其刚性，并能减小三重态的碰撞猝灭等非辐射去活化过程，而本身又不产生磷光背景。（2 2）胶束增稳的溶液室温磷光法（）胶束增稳的溶液室温磷光法（MS-RTPMS-RTP）当溶液中表面活性剂的浓度达到临界胶束浓度后，便相互聚集形成胶束。由于这种胶束的多相性，改变了磷光团的微环境和定向的约束力，从而强烈影响了磷光团的物理性质，减小了内转化和碰撞能量损失减小了内转化和碰撞能量损失等非辐射去活化过程的趋势，明显增加了三重态的稳定性，从而可以实现在溶液中测量室温磷光。利用胶束稳定的因素，利用胶束稳定的因素，结合重原子效应，并对溶液除氧，是结合重原子效应，并对溶液除氧，是MS-RTP MS-RTP 的三个要素。的三个要素。57第一节 分子荧光和磷光分析（3 3）敏化溶液室温磷光法（）敏化溶液室温磷光法（SS-RTPSS-RTP）该法在没有表面活性剂存在没有表面活性剂存在的情况下获得溶液的室温磷光。分析物质被激发后并不发射荧光，而是经过系系间跨越间跨越过程衰减变至最低激发三重态。当有某种合适的能量受体存在时，发生了由分析物质到受体分析物质到受体的三重态能量转移转移，最后通过测量受体所发射的室温磷光强度受体所发射的室温磷光强度而间接测定该分析物质。在这种方法中，分析物质本身并不发磷光，而是引发受体发磷光。58第一节 分子荧光和磷光分析3.磷光分析仪磷光分析仪 在荧光分光光度计上配上磷光配件后，即可用于磷光测定。如将样品放在盛有液氮的石英杜瓦瓶内，即可用于低温磷光测定。4.应用应用 磷光分析主要用于测定有机化合物，如石油产品、多环芳烃、农药、药物等方面。（教材列出了一些有机。（教材列出了一些有机化合物的磷光分析实例）化合物的磷光分析实例）59第二节 化学发光分析 某些物质在进行化学反应时，由于吸收了反应时产吸收了反应时产生的化学能生的化学能，而使反应产物分子激发至激发态反应产物分子激发至激发态，受激分子由激发态回到基态时，便发出一定波长的光。这种吸收化学能使分子发光的过程称为化学发光。利用化学发利用化学发光反应而建立起来的分析方法称为化学发光分析法光反应而建立起来的分析方法称为化学发光分析法。化学发光也发生于生命体系，这种发光称为生物发光。一、化学发光分析的基本原理一、化学发光分析的基本原理 化学发光是吸收化学反应过程产生的化学能，而使反应产物分子激发所发射的光。任何一个化学发光反应都应包括化学激发和发光两个步骤，必须满足如下条件：60第二节 化学发光分析（1）化学反应必须提供足够的激发能，激发能主要来源 于反应焓。（2）要有有利的化学反应历程，使化学反应的能量至少 能被一种物质所接受并生成激发态。（3）激发态能释放光子或能够转移它的能量给另一个分 子，而使该分子激发，然后以辐射光子的形式回到 基态。化学发光反应效率cl，又称化学发光的总量子产率。它决定于生成激发态产物分子的化学激发效率ce和激发61第二节 化学发光分析态分子的发射效率em。定义为：clcl=发射光子的分子数发射光子的分子数/参加反应的分子数参加反应的分子数=cece emem 化学反应的发光效率、光辐射的能量大小以及光谱范围，完全由参加反应物质的化学反应所决定。每个化学发光反应都有其特征的化学发光光谱及不同的化学发光效率。化学发光反应的发光强度Icl以单位时间内发射的光子数表示。它与化学发光反应的速率有关化学发光反应的速率有关，而反应速率又与反应分子浓度反应分子浓度有关。即 Icl（t）=cl dc/dt62第二节 化学发光分析式中 Icl（t）表示t时刻的化学发光强度，是与分析物有关的化学发光效率dc/dt是分析物参加反应的速率。二、化学发光反应类型二、化学发光反应类型1.1.直接化学发光和间接化学发光直接化学发光和间接化学发光 直接发光直接发光是被测物作为反应物直接参加化学发光反应，生成电子激发态产物分子，此初始激发态能辐射光子。A+B C*+D C*C+h 式中A或B是被测物，通过反应生成电子激发态产物C*，63第二节 化学发光分析当C*跃迁回基态时，辐射光子。间接发光间接发光是被测物A或B，通过化学反应生成初始激发态产物C*，C*不直接发光，而是将其能量转移给F，使F跃迁回基态，产生发光。A+B C*+D C*+F F*+E F*F+h 式中C*为能量给予体，而F为能量接受体2.气相化学发光和液相化学发光气相化学发光和液相化学发光64第二节 化学发光分析 按反应体系的状态分类，如化学发光反应在气相中进行称为气相化学发光；在液相或固相中进行称为液相或固相化学发光；在两个不同相中进行则称为异相化学发光。（1）气相化学发光）气相化学发光 主要有O3、NO、S的化学发光反应，可用于监测空气中的O3、NO、SO2、H2S、CO、NO2等。臭氧与乙烯的化学发光反应；一氧化氮与臭氧的化学发光反应。（教材教材P.99）（2）液相化学发光液相化学发光 用于此类化学发光分析的发光物质有鲁米诺、光泽碱、65第二节 化学发光分析洛粉碱等。例如，利用发光物质鲁米诺，可测定痕量的H2O2以及Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce等金属离子。三、化学发光的测量装置三、化学发光的测量装置 化学发光分析法的测量仪器主要包括 样品室、光检样品室、光检测器、放大器和信号输出装置。测器、放大器和信号输出装置。化学发光反应在样品室中进行，样品和试剂混合的方式有不连续取样体系不连续取样体系，加样是间歇的。将试剂先加到光电倍增管前面的反应池内，然后用进样器加入分析物。另一种方法是连续流动体系连续流动体系，反应试剂和分析物是定时在样品池中汇合反应，且在载流推动下向前移动，被检测66第二节 化学发光分析的光信号只是整个发光动力学曲线的一部分，而以峰高进行定量测量。67作业w1、简述有机分子中存在几种价电子及其能级轨道、能级跃迁的类型及其特点w2、某酮类化合物分别溶于极性溶剂和非极性溶剂，其吸收波长有什么差异?w3、简述给电子取代基、得电子取代基和重原子取代基对荧光产率的影响w4、哪类无机盐会产生荧光?哪些金属化合物的晶体会产生磷光?w5、简述化学发光的基本条件，哪类化学反应可能产生化学发光?68