小鼠cd40ig基因真核表达质粒的构建及鉴定

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1、【摘要】 目的:构建含小鼠cd40ig基因的真核表达载体，为诱导供体特异性移植物的免疫耐受的基因治疗作准备。方法:以小鼠脾脏总rna为模板，以rt-pcr法克隆小鼠cd40胞外段cdna及igg2a fc段cdna；另以pegfp-n1质粒为模板获得绿色荧光蛋白（gfp）基因。将所得基因片段插入真核表达载体pdc516中得到重组质粒pdc516-cd40-igg-gfp，测序鉴定正确后，用脂质体2000将其转染人胚肾上皮细胞（hek293细胞），荧光显微镜下观察融合蛋白的表达。结果:成功构建了小鼠cd40ig基因真核表达质粒pdc516-cd40-igg-gfp，并在hek293细胞中实现表达

2、。结论:小鼠cd40ig基因真核表达质粒pdc516-cd40-igg-gfp构建成功，为诱导供体特异性移植物免疫耐受的研究奠定了基础。 【关键词】 cd40ig 质粒 真核表达载体 abstract: objective: to construct a eukaryotic expression vector encoding murine cd40ig gene and make preparation for the gene therapy of induction of donor-specific immunologic tolerance. methods: the cdna o

3、f the extracellular domain of murine cd40 gene and igg2a fc gene were amplified by rt-pcr from the total rna isolated from the mouse spleen, and the green fluorescent protein(gfp) gene was amplified by pcr with the plasmid pegfp-n1 as the template. then the genes were inserted into the eukaryotic ex

4、pression vector pdc516, the resultant recombinant plasmid was confirmed by seqencing. then the recombinant plasmid was transfected into human embryonic kidney cell 293(hek293) using lipofectamine 2000,the expressed fusion protein was observed by fluorescence microscopy. results: the eukaryotic expre

5、ssion plasmid pdc516-cd40-igg-gfp was successfully constructed, and it could be correctly expressed in hek293 cells. conclusion: the successfully construction of the eukaryotic expression plasmid pdc516-cd40-igg-gfp has laid the foundation for the study of induction of donor-specific immunologic tol

6、erance. key words: cd40ig; plasmid; eukaryotic expression vector 器官移植是当今治疗终末期脏器衰竭的有效方法，但免疫排斥是器官移植后长期生存的一大难题。t细胞是介导排异反应的主要细胞，cd40/cd40l通路在t细胞的激活过程中发挥着重要作用，因此阻断cd40/cd40l间的相互作用，可以诱导宿主对移植物的低排斥反应性。由此我们克隆了小鼠cd40分子胞外区和igg2a分子fc段的cdna，并以pegfp-n1质粒为模板进行pcr，获得gfp基因，经酶切连接插入真核表达载体pdc516，制备出重组质粒pdc516-cd40-igg-

7、gfp，转染293细胞后见gfp表达，证实质粒pdc516-cd40-igg-gfp构建成功，从而为下一步构建含cd40ig基因的腺病毒载体作好了准备，为研究阻断cd40/cd40l通路诱导宿主对移植物的低排斥反应性奠定了基础。 1 材料和方法 1.1 实验动物 balb-c小鼠，6周龄, 雌性, 购自北京大学医学院实验动物部。 1.2 质粒、菌株、细胞株和主要试剂 质粒pegfp-n1、pgem-t载体质粒、e coli.dh5a（天根公司）。低代次hek293细胞株（本元正阳）。admaxtm kit e试剂盒（microbix biosystems，inc.）。taq酶、t4 dna连接

8、酶（takara公司）。限制性核酸内切酶xma?、bgl ii、hind iii（biolabs）。trizol 试剂、lipofectamine 2000（invitrogen）。逆转录试剂盒、pcr master mix（mbi）。质粒提取、胶纯化试剂盒（qiagen）。dmem高糖培养基、胎牛血清、胰酶（gibco）。引物合成由上海生工公司完成，基因测序由北京诺塞基因研究中心有限公司完成。 1.3 构建小鼠cd40ig基因真核表达质粒 1.3.1 小鼠脾脏总rna的提取：将小鼠以颈椎脱臼法处死，取出脾脏，加入液氮研磨后，用trizol试剂提取总rna，方法按产品说明进行。 1.3.2 c

9、d40、igg2a fc、gfp基因的制备：以小鼠脾脏总rna为模板，oligo-dt为引物，rt-pcr合成cdna，再以此cdna为模板，用cd40和migg fc特异引物进行pcr扩增，另以pegfp-n1质粒为模板进行pcr扩增，引物及pcr反应条件见表1，分别获得cd40、migg2a fc和gfp基因。 1.3.3 质粒pgem-igg的构建：将igg fc的pcr产物与pgem-t质粒进行ta连接反应，即10l pcr产物加2l的pgem-t载体加10 u的t4连接酶，16 过夜。取2l的连接产物以氯化钙法转化大肠杆菌dh5，用蓝白斑方法挑选含氨苄青霉素抗性的白斑克隆，在3 ml

10、 lb培养基（含氨苄青霉素100 g/ml）中37 、80 r/min振荡培养过夜，提取质粒pgem-igg并测序。 1.3.4 质粒p516-igg的构建：用bgl ii分别消化pgem-igg和pdc516，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后进行胶纯化。将igg片段和pdc516线性载体按7:1的摩尔浓度比例加t4连接酶16 过夜进行连接反应。取5l连接产物转化感受态大肠杆菌dh5，用pdc516-f和migg-r引物组合进行菌落pcr筛选正向插入的重组子（见表2），将pcr阳性的重组子进行细菌培养，提取质粒并测序。 1.3.5 质粒p516-cd40-igg融合基因的构建：用xma i分别消

11、化cd40的pcr产物和p516-igg，将cd40片段和pdc516-igg 线性载体进行连接（方法同上）。转化大肠杆菌dh5后，用pdc516-f和cd40-r引物组合进行菌落pcr筛选（见表2），将阳性结果的重组子进行细菌培养，提取质粒并测序。 1.3.6 pdc516-cd40-igg-gfp质粒的构建：用hind ?分别消化gfp的pcr产物和pdc516-cd40-igg，将gfp片段和pdc516-cd-igg 线性载体进行连接反应（方法同上），用gfp-f和pdc516-r引物组合进行菌落pcr筛选正向插入的重组子（见表2），提取质粒并测序。 1.3.7 pdc516-cd40

12、-igg-gfp质粒的大量制备：按qiagen endofree plasmid purification试剂盒说明进行制备，产物经1%琼脂糖凝胶电泳证实（见图2），紫外分光光度仪测od值，过滤除菌后-20 保存备用。 1.3.8 重组质粒转染293细胞：在6孔板中将2.0105个细胞接种于2 ml含血清不含抗生素的dmem中，在5% co2、37 培养箱中培养24 h，使细胞在转染时铺满平板的60%70%。用lipofectamine 2000转染试剂介导重组质粒转染，在无菌ep管中准备a、b两种溶液。a液：将4.0g dna溶于250l无血清dmem中，轻轻混匀；b液：将10l lipof

13、ectamine 2 000溶于250l无血清培养液中，轻轻混匀，室温孵育5 min。将a液和b液混合并混匀，室温孵育20 min，以形成脂质体/dna复合物。换去6孔板中旧的培养液，重新加入2 ml含血清不含抗生素的dmem，逐滴加入500l脂质体/dna复合物。在5% co2、37 培养箱中培养24 h后换液。 2 结果 2.1 获得小鼠cd40胞外区、igg2a fc段及gfp基因 引物cd40-f和cd40-r经pcr扩增的小鼠cd40胞外区基因片段为572 bp；引物migg-f和migg-r经pcr扩增的小鼠igg2a fc段为700 bp；引物gfp-f和gfp-r经pcr扩增的

14、gfp基因片段为765 bp。琼脂糖凝胶电泳结果见图1。 2.2 pdc516-cd40-igg-gfp真核表达质粒的成功构建 2.2.1 pdc516-igg的构建：pgem-t载体为3 000 bp的质粒，构建的pgem-igg质粒为3 700 bp。pgem-t质粒的多克隆位点上游110 bp处含有t7 primer序列，用t7+migg-r引物组合可扩增出约810 bp的片段，用t7 primer测序证实igg序列的正确性。将igg片段和pdc516线性载体进行连接反应，用pdc516-f测序证实igg插入序列的正确性（见图3）。 2.2.2 pdc516-cd40-igg的构建：将c

15、d40片段和pdc516-igg线性载体进行连接反应，用引物pdc516-f测序证实cd40插入序列的正确性。 2.2.3 pdc516-cd40-igg-gfp质粒的构建：将gfp片段和pdc516-cd40-igg 线性载体进行连接反应，用pdc516-r测序证实gfp插入序列的正确性。cd40-igg-gfp含酶切位点的融合产物为2001bp，编码667aa（见图4）。 2.3 重组质粒在真核细胞内表达 pdc516-cd40-igg-gfp质粒抽提后在紫外分光光度计下检测到od值为0.1257。将该质粒用lipofectamine 2000转染293细胞的第4天开始可见零星的细胞上有g

16、fp表达，随着时间的延长，gfp表达的细胞量逐渐增多，第7天左右在荧光显微镜下见大量的细胞有绿色荧光发生（见图5）。 3 讨论 目前控制免疫排斥主要依靠免疫抑制剂，在临床上也取得了较好的疗效，但长期使用免疫抑制剂存在增加机会性感染和肿瘤的发生率等副作用。近年来，大量文献报道了使用多种生物制剂预防器官移植后的排斥反应的可行性，包括单克隆抗体、细胞因子、细胞因子可溶性受体等在动物体内和人体实验中均取得一定的疗效。这些制剂最大的优点是能阻断免疫反应中的特异性步骤，减少毒副作用，导致人体对外源脏器的免疫耐受，但是这些生物制剂与传统的免疫抑制剂一样需要终身用药，存在免疫移植的效果不强等问题1。 近年来，

17、国内外许多学者已经尝试采用基因治疗的方法来预防移植后的排斥反应3-5。他们认为，细胞免疫应答是移植排斥的主要机制，而t细胞的有效活化除了需要抗原信号（第一信号）外，同时也需要第二信号的协同作用，否则t细胞将表现为无反应或凋亡。因此阻断共刺激信号途径，防止t细胞活化，可以诱导免疫无能（immune anergy）。研究表明，作为共刺激通路之一的cd40/cd40l通路与b7/cd28共刺激通路相比可能起着更关键的作用6。 cd40为i型跨膜糖蛋白,主要表达于b细胞、树突状细胞、巨噬细胞、内皮细胞等；cd40l为33kd的ii型跨膜糖蛋白，主要表达于活化的cd4+t淋巴细胞，部分活化的cd8+t细

18、胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、血小板和巨噬细胞1。研究认为，cd40/cd40l交联不仅能调节b细胞的活化，还能够促进apc细胞表达cd80、cd86等共刺激分子，这些分子与t细胞表面的配体cd28、ctla-4结合，形成对t细胞刺激的第二信号，从而使t细胞完全活化。 因此，我们可以通过阻断cd40/cd40l共刺激通路从而诱导宿主对移植物的低反应性。 动物实验显示，用抗cd40l单克隆抗体阻断cd40/cd40l之间的相互作用可以延长移植物的存活时间7,8，但需要反复给药以维持有效血药浓度，并有引起血栓合并症的危险9。nomura等10在大鼠模型中单次注入cd40ig重组腺病毒，观察到移植肝存

19、活时间超过300 d，并出现了供体特异性耐受现象；刘荷中等11人在移植物抗宿主病（gvhd）小鼠中注入纯化的cd40ig融合蛋白，显著延长了小鼠的平均存活时间，提示应用基因治疗的方法阻断cd40/cd40l通路在移植领域有巨大的开发前景。 我们克隆了小鼠cd40分子胞外区和igg2a分子fc段的cdna，成功构建了重组质粒pdc516-cd40-igg-gfp。其真核表达载体pdc516来源于admax腺病毒载体包装系统，该系统与目前使用最普及的adeasy系统相比，具有效率高、有助于重组腺病毒的基因组完整性等特点。本质粒的成功构建为下一步构建腺病毒载体奠定了基础，在后续的实验中，我们将构建含

20、小鼠cd40ig的腺病毒注入到动物移植模型中，使移植动物能够持续表达cd40ig，从而观察阻断cd40/cd40l通路与诱导移植免疫耐受的关系，探索其潜在的临床应用价值。 【参考文献】 1 guillot c, guillonneau c, mathieu p,et al. prolonged block-ade of cd40-cd40 ligand interactions by gene transfer of cd40ig results in long-term heart allograft survival and donor-specific hyporesponsivenes

21、s, but does not preventchronic rejectionj.j immunol,2002, 168(4): 1600-1609.2 guillot c, mauff b, cuturi mc, et al. gene therapy in transplantation in the year 2000: moving towards clinical applicationsj. gene ther,2000, 7(1):14-19.3 qin l, ding y, pahud dr, et al. adenovirus-mediated gene transfer

22、of viral interleukin-10 inhibits the immune response to both alloantigen and adenoviral antigenj. hum gene ther,1997,8(11):1365-1374.4 olthoff km,judge ta,gelman ae,et al. adenovirus-medi-ated gene transfer into cold-preserved liver allografts: sur-vival pattern and unresponsiveness following transd

23、uction with ctla4igj. nat med, 1998,4(2):194-200.5 guillot c, mathieu p, coathalem h, et al. tolerance to cardiac allografts via local and systemic mechanisms afteradenovirus-mediated ctla4ig expressionj. j immunol,2000,164(10):5258-5268.6 yamada aa, sayegh mh. the cd154-cd40 costimulatory pathway i

24、n transplantationj. transplantation, 2002;73(l):36-39.7 kirk ad, burkly lc,batty ds, et al.treatment with human-ized monoclonal antibody against cd154 prevents acute renal allograft rejection in nonhuman primatesj. nat med,1999,5(6):686-693.8 kenyon ns, chatzipetrou m, masetti m, et al. long-term su

25、rvival and function of intrahepatic islet allografts in rhesus monkeys treated with humanized anti-cd154 j. proc natl acad sci usa, 1999,96(14):8132-8137.9 kawai t,andrew d,colvin rb,et al.thromboembolic com-plications after treatment with monoclonal antibody against cd40 med, 2000,6(2):114.10 nomura m,yamashita k,murakami m,et al.induction of do-nor-specific tolerance by adenovirus-mediated cd40ig gene therapy in rat liver transplantationj.transplantation,2002,73(9):1403-1410.11 刘荷中,毛宁,侯春梅,等.阻断cd40/cd40l相互作用延长移植物抗宿主病小鼠存活时间j.中国临床药理学与治疗学,2003,8(1):6-10.