病毒感染力的滴定课件

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1、病毒感染力的滴定第三章第三章 病毒感染力的滴定病毒感染力的滴定病毒感染力的滴定半数致死量半数致死量LDLD5050（50%lethal dose50%lethal dose）半数鸡胚感染量半数鸡胚感染量EIDEID5050(egg 50%infective dose)(egg 50%infective dose)半数细胞培养物感染量半数细胞培养物感染量TCIDTCID5050（tissue culture tissue culture 50%infective dose)50%infective dose)蚀斑形成单位（蚀斑形成单位（plaque forming unitplaque form

2、ing unit，PFUPFU）u测定病毒感染力的方法测定病毒感染力的方法:病毒感染力的滴定一、病毒一、病毒TCIDTCID5050的测定的测定l操作步骤操作步骤在青霉素瓶中将病毒作连续在青霉素瓶中将病毒作连续1010倍的稀释，从倍的稀释，从1010-1-1-1010-10-10。将稀释好的病毒接种到将稀释好的病毒接种到9696孔微量培养板中，每一孔微量培养板中，每一稀释度作稀释度作8 8孔，每孔接种孔，每孔接种100100l l。在每孔加入细胞悬液在每孔加入细胞悬液100100l l，使细胞量达到，使细胞量达到3 310105 5个个/ml/ml。病毒感染力的滴定设正常细胞对照，正常细胞对照

3、作两纵排。设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。逐日观察并记录结果，一般需要观察逐日观察并记录结果，一般需要观察5-75-7天。天。结果的计算，按结果的计算，按Reed-MuenchReed-Muench两氏法或两氏法或KarberKarber法法病毒感染力的滴定TCIDTCID5050的计算方法的计算方法病毒感染力的滴定 Use of Reed&Muench method(if 50 ul of virus dilution is added to each well)病毒感染力的滴定病毒液病毒液 CPECPE孔数孔数 无无CPE CPE 累累 计计 出现出现CPECPE孔孔稀释度稀释度 孔

4、数孔数 CPECPE孔数孔数 无无CPECPE孔数孔数 所占的所占的%10 10-1-1 8 0 27 8 0 27 0 1000 100（27/2727/27）10 10-2-2 8 0 19 8 0 19 0 1000 100（19/1919/19）10 10-3-3 7 1 11 7 1 11 1 91.6 1 91.6（11/1211/12）10 10-4-4 3 5 4 3 5 4 6 406 40（4/104/10）10 10-5-5 1 7 1 1 7 1 13 0.713 0.7（1/141/14）10 10-6-6 0 8 0 0 8 0 21 021 0（0/210/21）

5、Reed-MuenchReed-Muench两氏法两氏法病毒感染力的滴定距离比例（高于距离比例（高于50%50%病变率的百分数病变率的百分数-50%-50%）/（高于（高于50%50%病变率的百分数病变率的百分数-低于低于50%50%病变率的百分数）病变率的百分数）（91.6-5091.6-50）/（91.6-4091.6-40）0.80.8病毒感染力的滴定lgTCIDlgTCID5050=距离此例距离此例稀释度对数之间的差稀释度对数之间的差+高于高于50%50%病变率的稀释度的对数病变率的稀释度的对数 =0.8=0.8(-1)+(-3)(-1)+(-3)=-3.8 =-3.8 TCID TC

6、ID5050=10=10-3.8-3.80.1ml0.1ml病毒感染力的滴定KarberKarber法法 病毒液稀释度病毒液稀释度 出现出现CPECPE孔的比率孔的比率10-1 8/8=1 10-2 8/8=110-3 7/8=0.87510-4 3/8=0.37510-5 1/8=0.125 10-6 0/8=0病毒感染力的滴定lgTCIDlgTCID5050=L-d(s-0.5)=L-d(s-0.5)L:L:最高稀释度的对数最高稀释度的对数D D：稀释度对数之间的差：稀释度对数之间的差S S：阳性孔比率总和：阳性孔比率总和lgTCIDlgTCID5050=-1-1=-1-1(3.375-0

7、.5)(3.375-0.5)=-3.875 =-3.875 TCID TCID5050=10=10-3.875-3.875/0.1ml/0.1ml 病毒感染力的滴定二、病毒蚀斑技术二、病毒蚀斑技术l病毒蚀斑（病毒蚀斑（plaque)plaque)又称空斑，指病毒在已长成的单层细胞上形又称空斑，指病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶。成的局限性病灶。病毒感染力的滴定原理：原理：适当稀释的病毒悬液接种经长成单层的敏感适当稀释的病毒悬液接种经长成单层的敏感细胞后，在覆盖的固体或半固体介质（琼脂糖、甲基细胞后，在覆盖的固体或半固体介质（琼脂糖、甲基纤维素）的作用下，病毒在最初感染的细胞内增殖后，纤

8、维素）的作用下，病毒在最初感染的细胞内增殖后，只能进而感染并破坏临近的细胞，经过几个增殖周期只能进而感染并破坏临近的细胞，经过几个增殖周期后，形成一个局限性的肉眼可见的病变细胞区，即局后，形成一个局限性的肉眼可见的病变细胞区，即局限性的病灶。限性的病灶。plaques病毒感染力的滴定病毒感染力的滴定操作步骤操作步骤将敏感细胞在平皿或将敏感细胞在平皿或6 6孔板内培养成单层孔板内培养成单层吸弃培养液，加入含钙、镁的吸弃培养液，加入含钙、镁的PBSPBS（pH7.4pH7.4）洗）洗1-21-2次。次。用维持液将病毒液作连续用维持液将病毒液作连续1010倍的稀释，选择适当稀倍的稀释，选择适当稀释度

9、的病毒悬液接种培养孔内的单层细胞，接种量释度的病毒悬液接种培养孔内的单层细胞，接种量约为原培养液的约为原培养液的1/10-1/51/10-1/5，以覆盖住细胞单层为宜，以覆盖住细胞单层为宜，每个稀释度接种每个稀释度接种2-32-3孔。孔。病毒感染力的滴定将培养板置将培养板置37 5%CO37 5%CO2 2培养箱吸附培养箱吸附1h1h，吸弃病毒液，吸弃病毒液，用含钙、镁的用含钙、镁的PBSPBS（pH7.4pH7.4）洗）洗3 3次。次。取取1.6%-2%1.6%-2%的低熔点琼脂糖，融化后降温至的低熔点琼脂糖，融化后降温至38-4238-42，与等量预热至与等量预热至38-4238-42含含

10、6%-10%6%-10%犊牛血清的无酚红犊牛血清的无酚红DMEMDMEM混合，注入细胞培养板中。混合，注入细胞培养板中。病毒感染力的滴定室温放置直至琼脂糖凝固，或于室温放置直至琼脂糖凝固，或于44冰箱放置几冰箱放置几分钟至琼脂糖凝固，然后于分钟至琼脂糖凝固，然后于37 5%CO37 5%CO2 2培养箱培养箱继续培养。继续培养。每天于显微镜下观察细胞病变情况。每天于显微镜下观察细胞病变情况。出现空斑后（出现空斑后（2-32-3天），用含钙、镁的天），用含钙、镁的PBSPBS将将0.1%0.1%的中性红贮存液的中性红贮存液1010倍稀释后滴加到细胞培倍稀释后滴加到细胞培养板上。养板上。于于37

11、5%CO37 5%CO2 2培养箱中作用培养箱中作用1h1h，吸弃染液，继，吸弃染液，继续于温箱中培养续于温箱中培养2-3h2-3h。病毒感染力的滴定TKTK-突变株与野毒形成的空斑的比较突变株与野毒形成的空斑的比较病毒感染力的滴定如果是测定如果是测定PFUPFU，则直接记取一定稀释度的病，则直接记取一定稀释度的病毒所形成的空斑数，然后根据公式计算毒所形成的空斑数，然后根据公式计算PFUPFU。如果是作病毒纯化如果是作病毒纯化 挑取空斑于挑取空斑于200L200L维持液中，反复冻融维持液中，反复冻融3 3次，接次，接种于种于PK-15PK-15细胞已长成单层的细胞已长成单层的2424孔细胞培养

12、板，孔细胞培养板，再于再于37 5%CO37 5%CO2 2培养箱培养至完全发生病变。培养箱培养至完全发生病变。病毒感染力的滴定一般的毒种纯化：一般的毒种纯化：收集病变的细胞悬液，测定收集病变的细胞悬液，测定TCIDTCID5050，然后选，然后选TCIDTCID5050较高者再作几轮空斑纯化，较高者再作几轮空斑纯化，获得高滴度的病毒，扩大培养后作种用。获得高滴度的病毒，扩大培养后作种用。筛选重组病毒：筛选重组病毒：收集病变的细胞或病毒悬液，收集病变的细胞或病毒悬液，通过通过PCRPCR或其它方法进行鉴定，取阳性者再作下或其它方法进行鉴定，取阳性者再作下一轮空斑纯化。如此一轮空斑纯化。如此3-

13、53-5轮空斑纯化后即可得到轮空斑纯化后即可得到纯化的病毒粒子。纯化的病毒粒子。病毒感染力的滴定噬斑技术的应用：噬斑技术的应用：用于病毒纯化：挑选病毒的克隆株用于病毒纯化：挑选病毒的克隆株测定病毒悬液中感染病毒的含量测定病毒悬液中感染病毒的含量病毒感染力的滴定噬斑形成单位噬斑形成单位（plaque forming unit,plaque forming unit,PFUPFU）概念：概念：每毫升病毒悬液中所含的蚀斑数，即病毒悬液每毫升病毒悬液中所含的蚀斑数，即病毒悬液中的感染性病毒浓度。中的感染性病毒浓度。计算方法：计算方法：如用如用PRVPRV接种接种PK-15PK-15细胞，每孔接种了细胞，每孔接种了0.4ml0.4ml，结，结果果1010-5-5孔形成了孔形成了208208个空斑，而个空斑，而1010-6-6孔形成了孔形成了2222个空斑，个空斑，则该病毒在则该病毒在PK-15PK-15细胞上的空斑形成单位（细胞上的空斑形成单位（PFUPFU）为：）为：222210106 6/0.4ml=5.5/0.4ml=5.510107 7个个/ml/ml。病毒感染力的滴定