《微生物的菌种选育》PPT课件.ppt
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工业微生物,5. 微生物的菌种选育,理想发酵工业用菌要求,1、遗传性状稳定; 2、生长速度快,不易被噬菌体等异种微生物污染; 3、目标产物的产量尽可能接近理想转化率; 4、最好是胞外产物; 5、尽可能减少产物类似物的生成; 6、培养基简单、来源广、价格低; 7、对T、pH、离子强度、剪切力不敏感; 8、溶氧要求低、便于培养能耗低;,5.1 从自然界中获得新菌种,5.1.1采样,5.1.2增殖,5.1.3纯化,5.1.4性能鉴定,调查研究,查阅资料,设计试验方案,确定样品的生态环境、季节选择和地点选择,采样,增殖培养,(1)控制营养成分,(2)控制pH,(3)温度控制,纯种分离,(1)稀释法,(2)划线法,(3)组织分离,原种斜面,筛选,(1)纸片培养显色法,(2)透明圈法,(3)变色圈法,(4)生长圈法,(5)抑菌圈法,复筛,再复筛,35株,性能鉴定,发酵pH、T、通风、搅拌、无菌程度、适应性、副产品和对低劣廉价原料的利用,毒性实验,菌种鉴定,5.2 基因突变和微生物菌种选育,一、3个经典实验 (一)经典转化试验,最早进行转化(transformation)实验的是F. Griffith(1928年),他以Streptococcus pneumoniae (肺炎链球菌,旧称“肺炎双球菌”)作为研究对象。,5.2.1遗传变异的物质基础,(1)动物实验,著名的肺炎球菌转化试验,S型,致病菌, 具荚膜,菌落表面光滑(smoth),R型,非致病菌, 无荚膜,菌落表面粗糙(rough),S型,R型,加热灭菌,热死S菌活R菌,(2)细菌培养试验,(3)S型菌的无细胞抽提液试验,Avery在四十年代以更精密的实验设计重复了以上实验,(1)从活的S菌中抽提各种细胞成分(DNA,蛋白质,荚膜多糖等) (2)对各组分进行转化试验,只有DNA被酶降解破坏的抽提物无转化活性,DNA是转化所必需的转化因子,(二)噬菌体感染实验,1952年,A.D.Hershey和M.Chase发表了证明DNA是噬菌体的遗传物质基础的著名实验 噬菌体感染实验,35S蛋白质外壳的噬菌体,32PDNA核心的噬菌体,在DNA中存在着包括合成蛋白质外壳在内的整套遗传信息。,(三)植物病毒的重建实验,为了证明核酸是遗传物质,H. Fraenkel-Conrat(1956)用含RNA的烟草花叶病毒(TMV)进行了著名的植物病毒重建实验。,烟草花叶病毒的核酸,抗血清处理,证明杂种病毒的蛋白质外壳来自病毒1,而非病毒2,杂种病毒的后代的蛋白质外壳表现为病毒2,而非病毒1,遗传物质是核酸(RNA)而非蛋白质,霍氏车前病毒 的蛋白质外壳,HRV,HMV,亚病毒的一种:具有传染性的蛋白质致病因子,迄今为止尚为发现该蛋白内含有核酸。,其致病作用是由于动物体内正常的蛋白质PrP c改变折叠状态为PrP sc所致,而这二种蛋白质的一级结构并没有改变。,二、朊病的发现与思考,思考,1)蛋白质是否可以作为遗传物质? prion是生命的一个特例?还是仅仅为表达调控的一种形式?,2)蛋白质折叠与功能的关系,是否存在折叠密码?,DNARNA肽链蛋白质,三、原核微生物的质粒 1. 定义和特点,质粒: 一种独立于染色体外,能进行自主复制的细胞质遗传因子,主要存在于各种微生物细胞中。,cccDNA,ocDNA,lDNA,另一类质粒的复制与核染色体的复制不同步, 在这类细胞中,一般含1015个或更多质粒。,严紧型复制控制(stringent replication control),松弛型复制控制(relaxed replication control),质粒的复制与核染色体的复制同步, 在这类细胞中,一般只含12个质粒;,质粒是一种独立存在于细胞内的复制子(replicon)。,通常以共价闭合环状(covalently closed circle,简称CCC)的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中;,也发现有线型双链DNA质粒和RNA质粒;,质粒分子的大小范围从1kb左右到1000kb; (细菌质粒多在10kb以内),2. 质粒的分子结构,提取所有胞内DNA后电镜观察;,超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察;,对于实验室常用菌,可用质粒所带的某些特点, 如抗药性初步判断。,特定的质粒提取方法和后处理使染色体和RNA均被除掉。,3. 质粒的检测,质粒的主要功能,在某些特殊条件下,质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的机能, 从而使宿主得到生长优势。,质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的;,质粒所编码 的功能和赋 予宿主的表 型效应,致育因子(Fertility factor,F因子) 抗性因子(Resistance factor,R因子) 产细菌素的质粒(Bacteriocin production plasmid) 毒性质粒(virulence plasmid) 代谢质粒(Metabolic plasmid) 隐秘质粒(cryptic plasmid),4. 质粒的主要类型,(1)F质粒(F plasmid),又称F因子、致育因子(fertility factor)或性因子(sex factor),其大小约100kb,为cccDNA,这是最早发现的一种与大肠杆菌的有性生殖现象(接合作用)有关的质粒。,携带F质粒的菌株称为F+菌株(相当于雄性), 无F质粒的菌株称为F-菌株(相当于雌性)。,(2)R质粒(R plasmid),包括抗药性和抗重金属二大类。,又称R因子(R factor)、抗性因子( resisitrance plasmid )。,含调节DNA复制和拷贝数的基因以及转移基因,相对分子量约11107,具有转移功能;,抗性转移因子(resistance transfer factor,RTF),抗性决定因子(r-determinant),大小不很固定,相对分子量从几百万至11108以上,无转移功能,含各种抗性基因,如抗青霉素、氨苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素和磺胺等基因。,R质粒一般由两个相连的DNA片段组成,由RTF和r决定子结合而形成R质粒的过程:,抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。,R100质粒(89kb)可使宿主对下列药物及重金属具有抗性: 汞(mercuric ion ,mer) 四环素(tetracycline,tet ) 链霉素(Streptomycin, Str)、 磺胺(Sulfonamide, Su)、 氯霉素(Chlorampenicol, Cm) 夫西地酸(fusidic acid,fus) 并且负责这些抗性的基因是成簇地存在于抗性质粒上。,R质粒的种类很多, 例如,R1(94kb)和R100(89.3kb)等。,(3)Col质粒(colicin plasmid,col plasmid),又称大肠杆菌素质粒或产大肠杆菌素因子(colicinogenic factor,col factor)。,细菌素(bacteriocin)是质粒编码的蛋白质,一般由细菌产生,可抑制或杀死其他近缘细菌或同种不同菌株的代谢产物,但不具有很广的杀菌谱。,细菌素结构基因、 涉及细菌素运输及发挥作用(processing)的蛋白质的基因、 赋予宿主对该细菌素具有“免疫力”的相关产物的基因,一般都位于质粒或转座子上, 细菌素可以杀死同种但不携带该质粒的菌株。,细菌素一般根据产生菌的种类进行命名:,大肠杆菌(E. coli)产生的细菌素为colicins(大肠杆菌素), 而质粒被称为Col质粒。,Col E1质粒:相对分子量小(9kb,约5106),无接合作用,是松弛性控制、多拷贝的; Colb质粒:相对分子量大(94kb,约8107 ),具有通过接合而转移的功能,属严紧型控制,只有12个拷贝。,(4)Ti质粒(tumor inducing plasmid),即诱癌质粒或冠瘿质粒(crown gall plasmid)。 Ti质粒是一种200kb的环状质粒,包括毒性区(vir)、接合转移(con)、复制起始区(ori)和T-DNA区4部分。,T-DNA区可携带任何外源基因整合到植物基因组中, Ti质粒是植物基因工程中使用最广、效果最佳的克隆载体。,Agrobacterium tumefaciens(根癌土壤杆菌或根癌农杆菌)释放出的Ti质粒上的T-DNA片断与植物细胞的核基因组整合,合成冠瘿碱类(opines),破坏控制细胞分裂的激素调节系统,使之变成癌细胞。,(5)Ri质粒(root inducing plasmid),250kb的Ri质粒中的一段T-DNA整合到宿主根部细胞的核基因组中,可发生转化。,Agrobacterium rhizogenes(发根土壤杆菌或发根农杆菌)可侵染双子叶植物的根部,并诱发大量称为毛状根的不定根。,Ri质粒是外源基因的良好载体!,(6)mega质粒(megaplasmid),即巨大质粒,其相对分子量比一般质粒大几十倍至几百倍,存在于Rhizobium(根瘤菌属)中, 其上有一系列与共生固氮相关的基因。,(7)降解质粒,这类质粒是由降解一系列复杂有机物的酶编码,所以在污水处理、环境保护等方面发挥作用。,只在假单胞菌属(Pseudomonas)中发现降解质粒。,降解质粒以其所分解的底物命名, 例如, CAM(樟脑)质粒, OCT(辛烷)质粒, XYL(二甲苯)质粒, SAL(水杨酸)质粒, MDL(扁桃酸)质粒, NAP(萘)质粒, TOL(甲苯)质粒等,“超级菌” 通过遗传工程手段构建具有数种降解质粒的菌株,具有广谱降解能力的工程菌。,- 配套讲稿:
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