《微生物的菌种选育》PPT课件.ppt

工业微生物,5. 微生物的菌种选育,理想发酵工业用菌要求,1、遗传性状稳定； 2、生长速度快，不易被噬菌体等异种微生物污染； 3、目标产物的产量尽可能接近理想转化率； 4、最好是胞外产物； 5、尽可能减少产物类似物的生成； 6、培养基简单、来源广、价格低； 7、对T、pH、离子强度、剪切力不敏感； 8、溶氧要求低、便于培养能耗低；,5.1 从自然界中获得新菌种,5.1.1采样,5.1.2增殖,5.1.3纯化,5.1.4性能鉴定,调查研究，查阅资料,设计试验方案,确定样品的生态环境、季节选择和地点选择,采样,增殖培养,(1)控制营养成分,(2)控制pH,(3)温度控制,纯种分离,(1)稀释法,(2)划线法,(3)组织分离,原种斜面,筛选,(1)纸片培养显色法,(2)透明圈法,(3)变色圈法,(4)生长圈法,(5)抑菌圈法,复筛,再复筛,35株,性能鉴定,发酵pH、T、通风、搅拌、无菌程度、适应性、副产品和对低劣廉价原料的利用,毒性实验,菌种鉴定,5.2 基因突变和微生物菌种选育,一、3个经典实验 （一）经典转化试验,最早进行转化（transformation）实验的是F. Griffith（1928年），他以Streptococcus pneumoniae （肺炎链球菌，旧称“肺炎双球菌”）作为研究对象。,5.2.1遗传变异的物质基础,（1）动物实验,著名的肺炎球菌转化试验,S型，致病菌， 具荚膜，菌落表面光滑（smoth）,R型，非致病菌， 无荚膜，菌落表面粗糙（rough）,S型,R型,加热灭菌,热死S菌活R菌,（2）细菌培养试验,（3）S型菌的无细胞抽提液试验,Avery在四十年代以更精密的实验设计重复了以上实验,（1）从活的S菌中抽提各种细胞成分（DNA，蛋白质，荚膜多糖等） （2）对各组分进行转化试验,只有DNA被酶降解破坏的抽提物无转化活性,DNA是转化所必需的转化因子,（二）噬菌体感染实验,1952年，A.D.Hershey和M.Chase发表了证明DNA是噬菌体的遗传物质基础的著名实验 噬菌体感染实验,35S蛋白质外壳的噬菌体,32PDNA核心的噬菌体,在DNA中存在着包括合成蛋白质外壳在内的整套遗传信息。,（三）植物病毒的重建实验,为了证明核酸是遗传物质，H. Fraenkel-Conrat（1956）用含RNA的烟草花叶病毒（TMV）进行了著名的植物病毒重建实验。,烟草花叶病毒的核酸,抗血清处理，证明杂种病毒的蛋白质外壳来自病毒1，而非病毒2,杂种病毒的后代的蛋白质外壳表现为病毒2，而非病毒1,遗传物质是核酸（RNA）而非蛋白质,霍氏车前病毒 的蛋白质外壳,HRV,HMV,亚病毒的一种：具有传染性的蛋白质致病因子，迄今为止尚为发现该蛋白内含有核酸。,其致病作用是由于动物体内正常的蛋白质PrP c改变折叠状态为PrP sc所致，而这二种蛋白质的一级结构并没有改变。,二、朊病的发现与思考,思考,1）蛋白质是否可以作为遗传物质？ prion是生命的一个特例？还是仅仅为表达调控的一种形式？,2）蛋白质折叠与功能的关系，是否存在折叠密码？,DNARNA肽链蛋白质,三、原核微生物的质粒 1. 定义和特点,质粒： 一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。,cccDNA,ocDNA,lDNA,另一类质粒的复制与核染色体的复制不同步， 在这类细胞中，一般含1015个或更多质粒。,严紧型复制控制（stringent replication control）,松弛型复制控制（relaxed replication control）,质粒的复制与核染色体的复制同步， 在这类细胞中，一般只含12个质粒；,质粒是一种独立存在于细胞内的复制子（replicon）。,通常以共价闭合环状（covalently closed circle，简称CCC）的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中；,也发现有线型双链DNA质粒和RNA质粒；,质粒分子的大小范围从1kb左右到1000kb； （细菌质粒多在10kb以内）,2. 质粒的分子结构,提取所有胞内DNA后电镜观察；,超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察；,对于实验室常用菌，可用质粒所带的某些特点， 如抗药性初步判断。,特定的质粒提取方法和后处理使染色体和RNA均被除掉。,3. 质粒的检测,质粒的主要功能,在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的机能， 从而使宿主得到生长优势。,质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的；,质粒所编码 的功能和赋 予宿主的表 型效应,致育因子（Fertility factor，F因子） 抗性因子（Resistance factor，R因子） 产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid） 毒性质粒（virulence plasmid） 代谢质粒（Metabolic plasmid） 隐秘质粒（cryptic plasmid）,4. 质粒的主要类型,（1）F质粒（F plasmid）,又称F因子、致育因子（fertility factor）或性因子（sex factor），其大小约100kb，为cccDNA，这是最早发现的一种与大肠杆菌的有性生殖现象（接合作用）有关的质粒。,携带F质粒的菌株称为F+菌株（相当于雄性）， 无F质粒的菌株称为F-菌株（相当于雌性）。,（2）R质粒（R plasmid）,包括抗药性和抗重金属二大类。,又称R因子（R factor）、抗性因子（ resisitrance plasmid ）。,含调节DNA复制和拷贝数的基因以及转移基因，相对分子量约11107，具有转移功能；,抗性转移因子（resistance transfer factor，RTF）,抗性决定因子（r-determinant）,大小不很固定，相对分子量从几百万至11108以上，无转移功能，含各种抗性基因，如抗青霉素、氨苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素和磺胺等基因。,R质粒一般由两个相连的DNA片段组成,由RTF和r决定子结合而形成R质粒的过程：,抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。,R100质粒（89kb）可使宿主对下列药物及重金属具有抗性： 汞（mercuric ion ，mer） 四环素（tetracycline，tet ） 链霉素（Streptomycin, Str）、 磺胺（Sulfonamide, Su）、 氯霉素（Chlorampenicol, Cm） 夫西地酸（fusidic acid，fus） 并且负责这些抗性的基因是成簇地存在于抗性质粒上。,R质粒的种类很多， 例如，R1（94kb）和R100（89.3kb）等。,（3）Col质粒（colicin plasmid，col plasmid）,又称大肠杆菌素质粒或产大肠杆菌素因子（colicinogenic factor，col factor）。,细菌素（bacteriocin）是质粒编码的蛋白质，一般由细菌产生，可抑制或杀死其他近缘细菌或同种不同菌株的代谢产物，但不具有很广的杀菌谱。,细菌素结构基因、 涉及细菌素运输及发挥作用（processing）的蛋白质的基因、 赋予宿主对该细菌素具有“免疫力”的相关产物的基因,一般都位于质粒或转座子上， 细菌素可以杀死同种但不携带该质粒的菌株。,细菌素一般根据产生菌的种类进行命名：,大肠杆菌（E. coli）产生的细菌素为colicins（大肠杆菌素）， 而质粒被称为Col质粒。,Col E1质粒：相对分子量小（9kb，约5106），无接合作用，是松弛性控制、多拷贝的； Colb质粒：相对分子量大（94kb，约8107 ），具有通过接合而转移的功能，属严紧型控制，只有12个拷贝。,（4）Ti质粒（tumor inducing plasmid）,即诱癌质粒或冠瘿质粒（crown gall plasmid）。 Ti质粒是一种200kb的环状质粒，包括毒性区（vir）、接合转移（con）、复制起始区（ori）和T-DNA区4部分。,T-DNA区可携带任何外源基因整合到植物基因组中， Ti质粒是植物基因工程中使用最广、效果最佳的克隆载体。,Agrobacterium tumefaciens（根癌土壤杆菌或根癌农杆菌）释放出的Ti质粒上的T-DNA片断与植物细胞的核基因组整合，合成冠瘿碱类（opines）,破坏控制细胞分裂的激素调节系统，使之变成癌细胞。,（5）Ri质粒（root inducing plasmid）,250kb的Ri质粒中的一段T-DNA整合到宿主根部细胞的核基因组中，可发生转化。,Agrobacterium rhizogenes（发根土壤杆菌或发根农杆菌）可侵染双子叶植物的根部，并诱发大量称为毛状根的不定根。,Ri质粒是外源基因的良好载体！,（6）mega质粒（megaplasmid）,即巨大质粒，其相对分子量比一般质粒大几十倍至几百倍，存在于Rhizobium（根瘤菌属）中， 其上有一系列与共生固氮相关的基因。,（7）降解质粒,这类质粒是由降解一系列复杂有机物的酶编码，所以在污水处理、环境保护等方面发挥作用。,只在假单胞菌属（Pseudomonas）中发现降解质粒。,降解质粒以其所分解的底物命名， 例如， CAM（樟脑）质粒， OCT（辛烷）质粒， XYL（二甲苯）质粒， SAL（水杨酸）质粒， MDL（扁桃酸）质粒， NAP（萘）质粒， TOL（甲苯）质粒等,“超级菌” 通过遗传工程手段构建具有数种降解质粒的菌株，具有广谱降解能力的工程菌。,