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1、DOC2抑制对宫颈癌 SiHa细胞系的生长 (一)作者：李萍，辛晓燕，刘淑娟，宋庆贺，毛敬【关键词】宫颈癌InhibitoryeffectofDOC2geneongrowthofhumancervicalcancerSiHacells【Abstract】AIM:ToexploretheinhibitoryeffectofDOC2geneonthegrowthofhumancervicalcancercelllineSiHa.METHODS:RecombinanteukaryoticexpressionvectorpcDNA3.1p93(containingexogenoushumanDOC2c
2、DNA)andvectorpcDNA3.1(withneomycinresistancegeneonly)weretransfectedintohumancervicalcancerSiHacells(noDOC2geneexpression)withlipofectaminerespectively.Thegrowthrate,cellcycleandcolonyformationrateoftransfectedcellswereobservedbyMTTassayandFCMassayrespectively.RESULTS:ThegrowthofSiHatransfectedwithD
3、OC2genewasmarkedlysuppressed（ P0.05 ） .Colonyformationrateinsoftagarwasalsodecreasedsignificantly（P0.05）.CellcycleanalysisshowedthatthepercentageofcellsinG1phaseofSiHap93cellswassignificiantlyincreasedwhilethatofcellsinSphasewasdecreased.Thepercentageofcellsinthedifferentphasesofthecycledidnotsignif
4、icantlyvheproliferationandDNAsynthesisofhumancervicalcancer.【Keywords】cervixneoplasms;DOC2;genetherapy【摘要】目的：探讨卵巢癌缺失2(DOC2)基因对宫颈癌SiHa 细胞系生长的抑制作用 .方法：采用基因转染技术，将含有全长DOC2cDNA的真核重组表达质粒和空载体质粒(pcDNA3.1)转染到人宫颈癌SiHa 细胞系（无 DOC2基因的表达）中，了解其对细胞增殖能力及细胞周期的影响 . 结果：转染 DOC2基因的宫颈癌细胞生长受到抑制（ P0.05），其在软琼脂克隆形成能力明显降低（P0.0
5、5）.DOC2有使 G1 期细胞比例增高、 S期细胞比例下降的趋势 ,但 SiHa 细胞和 SiHapcDNA3.1细胞之间无显著差异 .结论： DOC2 基因能抑制宫颈癌细胞系的增殖.【关键词】宫颈肿瘤； DOC2；基因疗法0 引言卵巢癌缺失 2（differentiallyexpressedinovariancancer2,DOC2）基因能抑制多种肿瘤细胞系的生长，是一个新的候选的肿瘤抑制基因.为探讨DOC2基因对人宫颈癌细胞的抑制作用，我们采用基因转染技术研究其对宫颈癌细胞增殖的影响，为宫颈癌的治疗提供思路.1 材料和方法1.1 材料无 DOC2基因表达的人源性宫颈癌细胞系SiHa由西京
6、医院妇产科实验室提供，常规方法复苏细胞并在37 ,50mL/LCO2标准条件下培养.真核表达载体质粒 pCDNA3.1p93(含有人 DOC2cDNA)、空载体质粒pCDNA3.1和免疫组化试剂 DOC2抗体均由刘淑娟博士惠赠 1-2.DMEM，质粒转染试剂盒（ Lipofectamine2000）及胰蛋白酶购自GIBCO 公司；胎牛血清购自杭州四季青;MTT 购自华美生物工程公司； SABC试剂盒与DAB 显色剂均购自武汉博士德生物技术有限公司,G418 购自 Sigma 公司.1.2 方法取L（2.0 g）与无血清 DMEM250L 混匀得 A 液，另取 Lipofectamin20005
7、 L和无血清 DMEM250L 混匀得 B 液.A与 B 两液混匀，室温放置 20min 形成脂质体 pCDNA3.1p93 复合物 (C1液)；同法制备脂质pCDNA3.1复合物 (C2 液).用 C1 液和 C2 液分别转染SiHa细胞，同时设未转染的SiHa作对照 .转染 48h 后，向培养基中加入G418 进行筛选，瓶中G418 终浓度由 100mg/L 逐渐升至 400mg/L，每3d 提高 1 次浓度，筛选抗G418 克隆，挑选阳性克隆并扩大培养.转染克隆采用 ABC免疫酶染色法检测DOC2蛋白的表达 .取处于对数生长期的 SiHap93 细胞，常规胰酶消化并制备SiHap93 单
8、细胞悬液，以每孔1 104个细胞接种于 24 孔培养板，每孔加 1mL 培养基，于接种后 24h 开 始 加 入 MTT, 每 次 6 个 复 孔 , 每 孔 加 入 75LMTT （ 20g/L ） ,37,50mL/LCO2 孵箱孵育 4h 后弃去上清 ，每 孔加 入0.5mLDMSO，振荡 15min，再孵育 1h，使结合的 MTT 充分溶解，选择490nm 波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔 A 值，每日测量 1 次，连续 7d,并绘制 A 值时间曲线 .测量期间每 23d 换液 1 次.同法绘制 SiHa和 SiHapcDNA3.1细胞的 A 值时间曲线 ,作为对照 .用去离子水配制
9、7g/L和 12g/L 琼脂溶液，高温高压灭菌后，于45水浴保温备用.配制2 DMEM培养液，高温高压灭菌后 45水浴保温 .将 2 DMEM与 12g/L 琼脂溶液等体积混匀后，按 1mL/孔加入 24 孔培养板， 4放置 30min 使之凝固 .再将 2DMEM与 7g/L 琼脂溶液等体积混匀，之后加入 SiHap93单细胞悬液并调整细胞终浓度为1106/L，此混悬液按每孔0.5mL 加入上述 24 孔板，铺平后室温放置使琼脂凝固，之后置于 37,50mL/LCO2孵箱中培养2wk，观察细胞克隆形成情况并计算克隆形成率.同时设SiHa和 SiHapcDNA3.1对照 .克隆形成率（%）克隆数 接种细胞数 100.取 SiHa，SiHapcDNA3.1 和 SiHap93 细胞分别接种于培养瓶，培养至80%90%融合状态时，用250g/L胰酶消化并收集细胞;PBS洗涤2 次后900mL/L乙醇固定过夜. 次日再次以PBS洗涤，并调整细胞浓度1 1081 109/L，碘化丙锭染色 30min 后，应用 FCM检测，计算出各期细胞百分比 ,每组重复 3 次.统计学处理：用 SPSS13.0统计软件进行统计分析，组间比较采用完全随机设计的方差分析，两两比较采用LSD法,P0.05 表示具有统计学差异 .
DOC2抑制对宫颈癌SiHa细胞系的生长(一)
