生物化学与分子生物学：基因诊断与基因治疗

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1、 基因诊断与基因治疗基因诊断与基因治疗Gene Diagnosis and Gene Therapy第二十八章第二十八章F第一节第一节 基因诊断学基础基因诊断学基础F第二节第二节 遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断F第三节第三节 肿瘤的基因诊断肿瘤的基因诊断F第四节第四节 基因诊断在法医学上的应用基因诊断在法医学上的应用 F第五节第五节 基因治疗的概念及策略基因治疗的概念及策略 本章内容提要本章内容提要第一节第一节 基因诊断学基础基因诊断学基础Basis of Gene Diagnostics基因诊断之父基因诊断之父简悦威简悦威 1976年加州大学华裔年加州大学华裔科学家科学家 Kan YW用核

2、酸分子用核酸分子杂交技术首次对一例杂交技术首次对一例地中地中海贫血进行诊断。海贫血进行诊断。一、一、基因诊断的概念、特点及临床意义基因诊断的概念、特点及临床意义 定义：定义： 利用分子生物学技术，通过检测基因及基利用分子生物学技术，通过检测基因及基因表达产物的存在状态，对人体疾病作出诊断因表达产物的存在状态，对人体疾病作出诊断的方法。的方法。 基因诊断检测的目标分子是基因诊断检测的目标分子是DNADNA、RNARNA，也可以是蛋白质或者多肽。也可以是蛋白质或者多肽。 诊断依据诊断依据(遗传物质改变遗传物质改变)，如病毒基因及，如病毒基因及其转录产物在体内从无到有、癌基因表达水平其转录产物在体内

3、从无到有、癌基因表达水平从低到高；从低到高；，如点突变引起基因失活、染色，如点突变引起基因失活、染色体转位引起基因异常激活或灭活。体转位引起基因异常激活或灭活。基因诊断的特点基因诊断的特点 高特异性高特异性 高灵敏性高灵敏性 早期诊断性早期诊断性 应用广泛性应用广泛性二、基因诊断中常用的分子生物学技术二、基因诊断中常用的分子生物学技术 核酸分子杂交（核酸分子杂交（Nucleic acid hybridization） 聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR) 单链构象多态性（单链构象多态性（SSCP） 限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（RFLP） DNA序列测定（序列测定（DNA se

4、quencing） 生物芯片（生物芯片（biochips） Western免疫印迹（免疫印迹（Western blotting） 免疫组织化学诊断免疫组织化学诊断 （三）（三）单链构象多态性分析单链构象多态性分析（single-strand conformation polymorphism, SSCP） DNA的突变造成的突变造成DNA片段碱基序列不同，片段碱基序列不同，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的构象变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的构象不同（单链构象多态性），利用迁移率的差别不同（单链构象多态性），利用迁移率的差别可使各种序列不同的单链分离开来。可使各种序列不同的单链分离开来。

5、PCR-SSCP分析原理示意分析原理示意正常人正常人纯合突变纯合突变杂合突变杂合突变+ + PCR-SSCP分析分析 基因诊断中常用的分子生物学方法比较基因诊断中常用的分子生物学方法比较方法方法特点特点核酸分子杂交核酸分子杂交结果可靠但操作繁琐结果可靠但操作繁琐PCRPCR灵敏度、特异性高灵敏度、特异性高SSCPSSCP操作简便、检出率不高操作简便、检出率不高RFLPRFLP结果可靠但限制较多结果可靠但限制较多DNADNA测序测序可可自动化自动化生物芯片生物芯片效率高，成本效率高，成本高高三、三、 基因诊断技术路线与方法基因诊断技术路线与方法 n直接诊断：直接分析致病基因分子结构及表直接诊断：

6、直接分析致病基因分子结构及表达是否异常达是否异常n间接诊断：利用多态性遗传标志与致病基因间接诊断：利用多态性遗传标志与致病基因进行连锁分析进行连锁分析 根据对致病基因或相关基因的了解程度决根据对致病基因或相关基因的了解程度决定基因诊断的技术途径选择。定基因诊断的技术途径选择。（一）直接诊断途径（一）直接诊断途径 必要条件：必要条件： 被检测基因变化与疾病发生有直接因果关系被检测基因变化与疾病发生有直接因果关系 被检基因正常分子结构已被确定被检基因正常分子结构已被确定 被检基因致病的分子机制（突变位点或表达变被检基因致病的分子机制（突变位点或表达变化）已知化）已知5/5/3/3/RFLP1. 1

7、.点突变的检测点突变的检测（1 1）有限制性内切酶位点改变）有限制性内切酶位点改变斑点杂交、反向斑点杂交斑点杂交、反向斑点杂交AS-PCR、PCR-SSCP、 PCR-ASO、PCR产物直接测序产物直接测序5/5/3/3/（2 2）无限制性酶切位点改变）无限制性酶切位点改变 在在DNA序列上有一段较长序列的重新排布。序列上有一段较长序列的重新排布。包括数十个碱基到数千个碱基的丢失、插入、替包括数十个碱基到数千个碱基的丢失、插入、替换、重复和倒位等，以及染色体突变或畸变，包换、重复和倒位等，以及染色体突变或畸变，包括染色体的易位、缺失或染色三体（如唐氏综合括染色体的易位、缺失或染色三体（如唐氏综

8、合征）等。征）等。 2. 2. 基因重排的检测基因重排的检测核酸分子探针杂交与核酸分子探针杂交与PCR 3. 基因表达异常的检测基因表达异常的检测 mRNA的相对定量分析的相对定量分析 mRNA的绝对定量分析的绝对定量分析 mRNA长度分析长度分析（二）间接诊断途径（二）间接诊断途径1.1.采用原因采用原因致病基因未知或基因结构不确定致病基因未知或基因结构不确定致病突变机制不清致病突变机制不清致病位点不便检测致病位点不便检测 DNA多态性：多态性：指群体中的指群体中的DNA分子存分子存在至少两种不同的类型，即在至少两种不同的类型，即个体间同一染色个体间同一染色体的相同位置上核苷酸序列存在一定的

9、差异体的相同位置上核苷酸序列存在一定的差异或变异或变异。 多在进化中形成，本身并不致病，只是多在进化中形成，本身并不致病，只是与某些遗传性致病基因有一定连锁关系。与某些遗传性致病基因有一定连锁关系。2. 2. 遗传标记遗传标记间接诊断：检测与致病基因连锁的遗传标记间接诊断：检测与致病基因连锁的遗传标记三代遗传标记：三代遗传标记： RFLP（基于核酸分子杂交技术）（基于核酸分子杂交技术） VNTR (variable number of tandem repeats) ; STR (short tandem repeats) SNP(single nucleotide polymorphism)

10、第五节第五节 基因治疗的概念及策略基因治疗的概念及策略 Concept and Strategy of Gene Therapy本节内容提要本节内容提要 一、基因治疗的策略一、基因治疗的策略二、基因转移技术二、基因转移技术三、基因干预三、基因干预四、基因治疗的应用研究四、基因治疗的应用研究五、基因治疗的前景与问题五、基因治疗的前景与问题 一、基因治疗的策略一、基因治疗的策略 （一）基因置换（一）基因置换（gene replacement） 定义：定义：指将特定的目的基因导入特定细胞，通指将特定的目的基因导入特定细胞，通过定位重组，导入的正常基因，以置换基因组内过定位重组，导入的正常基因，以置换

11、基因组内原有的缺陷基因。原有的缺陷基因。 目的：目的：将缺陷基因的异常序列进行桥正。将缺陷基因的异常序列进行桥正。 对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，不涉及基因组的任何改变。不涉及基因组的任何改变。 （二）（二） 基因添加基因添加（gene augmentation） 定义定义: : 通过导入外源基因使靶细胞表达其本身通过导入外源基因使靶细胞表达其本身 不表达的基因。不表达的基因。类型类型: :n在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基因，在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基因，而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入正而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入

12、正常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能；常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能；n向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，利用其表达产物达到治疗疾病的目的。利用其表达产物达到治疗疾病的目的。（三）基因干预（三）基因干预（gene interference） 定义：定义： 采用特定的方式抑制某个基因的表达，采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。达，以达到治疗疾病的目的。n定义：定义：将将“自杀自杀”基因导入宿主细胞中，这基因导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性

13、的药物前体转化种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀自杀”效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。n应用：应用：是恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。是恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。（四）自杀基因治疗（四）自杀基因治疗(Suicide Gene Therapy)自杀基因的作用机制自杀基因的作用机制 （五）基因免疫治疗（五）基因免疫治疗 通过将抗癌免疫增强的细胞因子或通过将抗癌免疫增强的细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。抗癌免疫反

14、应。 二、基因转移技术二、基因转移技术 基因治疗的两种途径基因治疗的两种途径载体载体目的基因目的基因in vivoex vivo靶细胞 基因转移基因转移(gene transfer)技术技术 1.病毒介导的基因转移病毒介导的基因转移 2.非病毒介导的基因转移非病毒介导的基因转移 1. 1.病毒介导的基因转移系统病毒介导的基因转移系统 病毒载体病毒载体介导的基因转移效率较高，因介导的基因转移效率较高，因此它也是使用最多的基因治疗载体。据统计，此它也是使用最多的基因治疗载体。据统计，有有72%72%的临床实验计划和的临床实验计划和71%71%的病例使用了的病例使用了病毒载体，其中用得最多的是反转录

15、病毒载病毒载体，其中用得最多的是反转录病毒载体体。反转录病毒的结构及生活周期反转录病毒的结构及生活周期（1 1）反转录病毒）反转录病毒 反转录病毒介导的基因转移系统反转录病毒介导的基因转移系统 由两部分组成由两部分组成反转录病毒载体：反转录病毒载体：其基因组为缺陷型，保留其基因组为缺陷型，保留了病毒的包装信号了病毒的包装信号，而缺失病毒的包装蛋，而缺失病毒的包装蛋白基因白基因.辅助细胞株：辅助细胞株：能合成包装蛋白，用于反转录能合成包装蛋白，用于反转录病毒载体包装，但本身却不能包装成辅助病毒载体包装，但本身却不能包装成辅助病毒颗粒。病毒颗粒。 Retroviral packaging syst

16、em （2）腺病毒）腺病毒(adenovirus)载体载体 腺病毒是一种大分子腺病毒是一种大分子(36 kb)双链无包膜双链无包膜DNA病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。 腺病毒的优点腺病毒的优点l基因导入效率高，对人类安全；基因导入效率高，对人类安全；l宿主范围广；宿主范围广；l基因转导与细胞分裂无关；基因转导与细胞分裂无关；l重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸重组腺病毒可通过口服经肠道

17、吸收、或喷雾吸入或气管内滴注；入或气管内滴注；l腺病毒载体容量较大，可插入腺病毒载体容量较大，可插入7.5 kb外源基因。外源基因。 2.非病毒载体介导的基因转移系统非病毒载体介导的基因转移系统 （1）脂质体介导的基因转移技术）脂质体介导的基因转移技术 脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。低廉。 基本原理基本原理:利用阳离子脂质体单体与利用阳离子脂质体单体与DNA混合混合后，可以自动形成包埋外源后，可以自动形成包埋外源DNA的脂质体，然后的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源DNA（即目的

18、基因）转移至细胞内，并进行表达。即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。 脂质体介导的基因转移示意图脂质体介导的基因转移示意图 （2）受体介导转移技术）受体介导转移技术 将将DNA与细胞或组织亲和性的配体偶联，与细胞或组织亲和性的配体偶联，可使可使DNA具有靶向性。具有靶向性。 多聚阳离子与配体共价连接后，又通过多聚阳离子与配体共价连接后，又通过电荷相互作用与带负电荷的电荷相互作用与带负电荷的DNA结合，将结合，将DNA包围，只留下配体暴露于表面。这样形包围，只留下配体暴露于表面。这样形成的复合物可被带有特异性受体的靶细胞吞成的复合物可被带有特异性受体的靶细胞吞饮，从而将外源饮，从而将外源DNA

19、导入靶细胞。导入靶细胞。受体介导受体介导转移技术转移技术示意图示意图 （3）基因直接注射技术）基因直接注射技术 不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露DNA注入动物肌肉或某些器官组织内。注入动物肌肉或某些器官组织内。 动物实验表明：接受注射外源动物实验表明：接受注射外源DNA的小鼠能够按的小鼠能够按其基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。其基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。 n将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的心脏，可使其将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加心脏壁内毛细血管增加30%40%；n将

20、胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺少将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺少的胰岛素；的胰岛素；n肌内注射凝血因子肌内注射凝血因子基因，可产生血友病所需的凝血因子基因，可产生血友病所需的凝血因子 。三、基因干预三、基因干预 （gene interference） （一）反义（一）反义RNA（antisense RNA） 1. 反义反义RNA与基因表达调控与基因表达调控 利用反义利用反义RNA对体外培养的细胞进行基因对体外培养的细胞进行基因表达调控，通常采用的方法有两种：表达调控，通常采用的方法有两种： （1）体外合成反义）体外合成反义RNA，直接作用于培养细胞，直接作

21、用于培养细胞，细胞吸收细胞吸收RNA后，发挥作用。后，发挥作用。 （2）构建一些能转录反义）构建一些能转录反义RNA的重组质粒，将这的重组质粒，将这些质粒转入细胞中，转录出反义些质粒转入细胞中，转录出反义RNA而发挥作用。而发挥作用。2.受体介导反义受体介导反义RNA转移技术转移技术 受体介导的受体介导的RNA转移十分专一，而且效率高；转移十分专一，而且效率高；被转移的被转移的RNA是被保护的，与周围环境之间是被保护的，与周围环境之间存在多聚赖氨酸的保护层存在多聚赖氨酸的保护层, 可以抵抗环境中可以抵抗环境中的核酸酶的降解作用。的核酸酶的降解作用。 借助前述的受体介导基因转移方法借助前述的受体

22、介导基因转移方法，可可以实现受体介导的反义以实现受体介导的反义RNA转移。转移。（二）核酶（二）核酶 (ribozyme) 在基因治疗时，利用核酶分子结合到靶在基因治疗时，利用核酶分子结合到靶RNA分子中适当的部位，形成锤头状核酶结构，分子中适当的部位，形成锤头状核酶结构，将靶将靶RNA分子切断，通过破坏靶分子切断，通过破坏靶RNA分子而达分子而达到治疗疾病的目的。到治疗疾病的目的。 1.核酶的设计核酶的设计 （1 1）选择合适的靶部位，该部位具有核酶切割位点，）选择合适的靶部位，该部位具有核酶切割位点，能与核酶分子结合并组成酶活性结构域。能与核酶分子结合并组成酶活性结构域。 （2）核酶的基本

23、组成：用于基因治疗的核酶分子由）核酶的基本组成：用于基因治疗的核酶分子由三个部分组成，中间是保守序列（能够组成酶活性结三个部分组成，中间是保守序列（能够组成酶活性结构域），两端是引导序列构域），两端是引导序列。 核酶的作用机制核酶的作用机制 2.核酶的应用核酶的应用 与一般的反义与一般的反义RNA相比，核酶具有较稳定的空相比，核酶具有较稳定的空间结构，不易受到间结构，不易受到RNA酶的攻击。更重要的是，酶的攻击。更重要的是，核酶在切断核酶在切断mRNA后，又可从杂交链上解脱下来，后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合和切割其它的重新结合和切割其它的mRNA分子。分子。 （三）（三）RNA干扰干扰

24、 1.RNA干扰现象干扰现象 RNA干扰干扰（RNA interference， RNAi）是一种由双是一种由双链链RNA诱发的基因沉默现象。在此过程中，与双链诱发的基因沉默现象。在此过程中，与双链RNA有同源序列的信使有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，从被降解，从而抑制该基因的表达。而抑制该基因的表达。RNA干扰机制示意图干扰机制示意图 四、基因治疗的应用研究四、基因治疗的应用研究 （一）遗传病的基因治疗研究（一）遗传病的基因治疗研究 ( (一一) )遗传病基因治疗必须符合以下要求遗传病基因治疗必须符合以下要求1.在在DNA水平明确其发病原因及机制；水平明确其发病原因及机制；2.必须

25、是单基因遗传病，而且属隐性遗传；必须是单基因遗传病，而且属隐性遗传；3.该基因的表达不需要精确调控；该基因的表达不需要精确调控；4.该基因能在一种便于临床操作的组织细胞中表该基因能在一种便于临床操作的组织细胞中表达并发挥其生理作用；达并发挥其生理作用；5.该遗传病不经治疗将有严重后果该遗传病不经治疗将有严重后果(如不治疗难以如不治疗难以存活等存活等)。可供选择并符合上述。可供选择并符合上述4条以上要求的条以上要求的不过只有不过只有30余种遗传病。余种遗传病。n腺苷脱氨酶腺苷脱氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶 (PNP)缺乏症缺乏症 n珠蛋白生成障碍性贫血和血红蛋白病珠蛋白生成

26、障碍性贫血和血红蛋白病 n血友病和其他血浆蛋白缺乏症血友病和其他血浆蛋白缺乏症 n苯丙酮酸尿症和其他先天性代谢缺陷病苯丙酮酸尿症和其他先天性代谢缺陷病 n莱莱-纳纳(Lesch-Nyhan)综合征综合征 n家族性高胆固醇血症家族性高胆固醇血症 n囊性纤维化病囊性纤维化病 （二）恶性肿瘤基因治疗研究（二）恶性肿瘤基因治疗研究 （1 1）通过基因置换和基因补充，导入多种抑癌基因以抑）通过基因置换和基因补充，导入多种抑癌基因以抑制癌症的发生、发展和转移；制癌症的发生、发展和转移； 肿瘤发生是一个极为复杂的过程，许多基因的突变肿瘤发生是一个极为复杂的过程，许多基因的突变会导致肿瘤的发生。会导致肿瘤的发

27、生。（2 2）抑制癌基因的活性，通过干扰癌基因的转录和翻译，）抑制癌基因的活性，通过干扰癌基因的转录和翻译，发挥抑癌作用；发挥抑癌作用；（3 3）增强肿瘤细胞的免疫原性，通过对肿瘤组织进行细）增强肿瘤细胞的免疫原性，通过对肿瘤组织进行细胞因子修饰，刺激机体免疫系统产生对肿瘤细胞的胞因子修饰，刺激机体免疫系统产生对肿瘤细胞的溶解和排斥反应；溶解和排斥反应；（4 4）通过导入）通过导入“自杀基因自杀基因”杀伤癌细胞。杀伤癌细胞。自杀基因治疗自杀基因治疗 基本原理：基本原理：向肿瘤细胞内导入某些真核向肿瘤细胞内导入某些真核细胞中不存在的酶基因（自杀基因），这些细胞中不存在的酶基因（自杀基因），这些基

28、因表达的特异性酶可以催化对真核细胞无基因表达的特异性酶可以催化对真核细胞无毒或低毒的药物前体，转变为具有抑制核酸毒或低毒的药物前体，转变为具有抑制核酸合成效应的抗代谢药物，进而选择性地使转合成效应的抗代谢药物，进而选择性地使转染了染了“自杀基因自杀基因”的肿瘤细胞的肿瘤细胞“自杀自杀”。 自杀基因治疗是目前肿瘤基因治疗领域自杀基因治疗是目前肿瘤基因治疗领域中的研究热点之一。中的研究热点之一。 肿瘤的免疫基因治疗肿瘤的免疫基因治疗 激发机体肿瘤免疫效应或提高免疫效应激发机体肿瘤免疫效应或提高免疫效应细胞功能为目的的一种肿瘤基因治疗方法。细胞功能为目的的一种肿瘤基因治疗方法。 主要包括：主要包括： 细胞因子（或受体）基因治疗；细胞因子（或受体）基因治疗； 抗原抗体基因治疗。抗原抗体基因治疗。