限制性内切酶酶切位点及保护碱基

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1、寡核苷酸近末端位点的酶切(Cleavage Close to the Endof DNA Fragme nts (olig onu cleotides)为什么要添加保护碱基？在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定 的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。由于直接暴露在末端的酶切位 点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的 5端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高 将来酶切时的活性。其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点 往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边 的酶切位点切割

2、。该如何添加保护碱基？添加保护碱基时， 最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。添加什么保护碱基，如果严格点， 是根据两条引物的 Tm值和各引物的 碱基分布及GC含量。如果某条引物 Tm值偏小，GC%较低，添加时多加 G或C，反之亦反。为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB 采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切 顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近 DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加 上6个保护碱基，

3、以确保酶切反应的进行。实验方法：用丫 - 32PATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记 0.1A26。单位的寡 核苷酸。取1 yg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20C条件下分别 反应2小时和20小时。反应缓冲液含 70 mM Tris-HCl （pH 7.6）, 10 mM MgCl 2 , 5 mMDTT及适量的NaCI或KCl （视酶的具体要求而定）。20%勺PAGE（ 7 M尿素） 凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。 若底物有较长的回文结构，切割效率则 可能因为出现发夹结构而降低。切割率%I酶寡核苷酸序列链长2 hr 20 hrAcc

4、 IGGTCGAC C800CG GTCGAC CG1000CCG GTCGAC CGG1200Afl IIICACATGT G800CCACATGT GG109090CCC ACATGT GGG129090Asc IGGCGCGCC89090AGGCGCGCC T109090TTGGCGCGCC AA129090rAva ICCCCGGG G85090CCCCCGGG GG109090TCC CCCGGG GGA129090BamH ICGGATCC G81025CG GGATCC CG109090CGC GGATCC GCG129090Bgl IICAGATCT G800GAAGATCT

5、TC107590GGA AGATCT TCC122590BssH IIGGCGCGC C800AG GCGCGC CT1000TTG GCGCGC CAA125090BstE IIGGGT(A/T)ACC C9010rBstX IAACTGCAGAA CCAATGCATTGG2200AAAACTGCAG CCAATGCATTGG AA242550CTGCAGAA CCAATGCATTGG ATGCAT272590Cla ICATCGAT G800GATCGAT C800CCATCGAT GG109090CCC ATCGAT GGG125050EcoR IG GAATTC C89090CG GA

6、ATTC CG109090CCG GAATTC CGG129090Hae IIIGG GGCC CC89090AGC GGCC GCT109090TTGC GGCC GCAA129090Hind IIICAAGCTT G800CCAAGCTT GG1000CCC AAGCTT GGG121075Kpn IGGGTACC C800GG GGTACC CC109090CGG GGTACC CCG129090Mlu IGACGCGT C800CG ACGCGT CG102550Neo ICCCATGG G800CATG CCATGG CATG145075Nde ICCATATG G800CC CAT

7、ATG GG1000CGC CATATG GCG1200GGGTTT CATATG AAACCC1800GGAATTC CATATG GAATTCC207590GGGAATTC CATATG GAATTCCC227590rNhe IGGCTAGC C800CG GCTAGC CG101025CTA GCTAGC TAG121050Not ITTGCGGCCGC AA1200ATTT GCGGCCGC TTTA161010AAATAT GCGGCCGC TATAAA201010ATAAGAAT GCGGCCGC TAAACTAT242590AAGGAAAAAA GCGGCCGC AAAAGGAA

8、AA282590LNsi ITGC ATGCAT GCA121090CCA ATGCAT TGGTTCTGCAGTT229090Pae ITTAATTAA800GTTAATTAA C10025CC TTAATTAA GG12090Pme IGTTTAAAC800GGTTTAAAC C10025GG GTTTAAAC CC12050AGCTTT GTTTAAAC GGCGCGCCGG247590Pst IGCTGCAG C800TGCA CTGCAG TGCA141010AACTGCAG AACCAATGCATTGG229090AAAA CTGCAG CCAATGCATTGGAA249090CT

9、GCAG AACCAATGCATTGGATGCAT2600厂Pvu ICCGATCG G800ATCGATCG AT101025TCG CGATCG CGA12010Sac ICGAGCTC G81010sac IIGCCGCGG C800TCC CCGCGG GGA125090Sal IGTCGAC GTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC2800GC GTCGAC GTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG301050ACGC GTCGAC GTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA321075Sca IGAGTACT C81025AAA AGTACT TTT127575厂Sma

10、ICCCGGG6010CCCCGGG G8010CCCCCGGG GG101050TCC CCCGGG GGA129090厂Spe IGACTAGT C81090GG ACTAGT CC101090CGG ACTAGT CCG12050CTAG ACTAGT CTAG14050LSph IGGCATGC C800CAT GCATGC ATG12025ACAT GCATGC ATGT141050Stu IAAGGCCT T89090GAAGGCCT TC109090AAAAGGCCT TTT129090Xba ICTCTAGA G800GC TCTAGA GC109090TGC TCTAGA GCA127590CTAG TCTAGA CTAG147590厂Xho ICCTCGAG G800CC CTCGAG GG101025CCG CTCGAG CGG121075Xma ICCCCGGG G800CCCCCGGG GG102575CCC CCCGGG GGG125090TCCC CCCGGG GGGA149090