限制性内切酶酶切位点及保护碱基

寡核苷酸近末端位点的酶切(Cleavage Close to the Endof DNA Fragme nts (olig onu cleotides)为什么要添加保护碱基？在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定 的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。由于直接暴露在末端的酶切位 点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的 5端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高 将来酶切时的活性。其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点 往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边 的酶切位点切割。该如何添加保护碱基？添加保护碱基时， 最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。添加什么保护碱基，如果严格点， 是根据两条引物的 Tm值和各引物的 碱基分布及GC含量。如果某条引物 Tm值偏小，GC%较低，添加时多加 G或C，反之亦反。为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB 采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切 顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近 DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加 上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。实验方法：用丫 - 32PATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记 0.1A26。单位的寡 核苷酸。取1 yg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别 反应2小时和20小时。反应缓冲液含 70 mM Tris-HCl （pH 7.6）, 10 mM MgCl 2 , 5 mMDTT及适量的NaCI或KCl （视酶的具体要求而定）。20%勺PAGE（ 7 M尿素） 凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。 若底物有较长的回文结构，切割效率则 可能因为出现发夹结构而降低。切割率%I酶寡核苷酸序列链长2 hr 20 hrAcc IGGTCGAC C800CG GTCGAC CG1000CCG GTCGAC CGG1200Afl IIICACATGT G800CCACATGT GG10>90>90CCC ACATGT GGG12>90>90Asc IGGCGCGCC8>90>90AGGCGCGCC T10>90>90TTGGCGCGCC AA12>90>90rAva ICCCCGGG G850>90CCCCCGGG GG10>90>90TCC CCCGGG GGA12>90>90BamH ICGGATCC G81025CG GGATCC CG10>90>90CGC GGATCC GCG12>90>90Bgl IICAGATCT G800GAAGATCT TC1075>90GGA AGATCT TCC1225>90BssH IIGGCGCGC C800AG GCGCGC CT1000TTG GCGCGC CAA1250>90BstE IIGGGT(A/T)ACC C9010rBstX IAACTGCAGAA CCAATGCATTGG2200AAAACTGCAG CCAATGCATTGG AA242550CTGCAGAA CCAATGCATTGG ATGCAT2725>90Cla ICATCGAT G800GATCGAT C800CCATCGAT GG10>90>90CCC ATCGAT GGG125050EcoR IG GAATTC C8>90>90CG GAATTC CG10>90>90CCG GAATTC CGG12>90>90Hae IIIGG GGCC CC8>90>90AGC GGCC GCT10>90>90TTGC GGCC GCAA12>90>90Hind IIICAAGCTT G800CCAAGCTT GG1000CCC AAGCTT GGG121075Kpn IGGGTACC C800GG GGTACC CC10>90>90CGG GGTACC CCG12>90>90Mlu IGACGCGT C800CG ACGCGT CG102550Neo ICCCATGG G800CATG CCATGG CATG145075Nde ICCATATG G800CC CATATG GG1000CGC CATATG GCG1200GGGTTT CATATG AAACCC1800GGAATTC CATATG GAATTCC2075>90GGGAATTC CATATG GAATTCCC2275>90rNhe IGGCTAGC C800CG GCTAGC CG101025CTA GCTAGC TAG121050Not ITTGCGGCCGC AA1200ATTT GCGGCCGC TTTA161010AAATAT GCGGCCGC TATAAA201010ATAAGAAT GCGGCCGC TAAACTAT242590AAGGAAAAAA GCGGCCGC AAAAGGAAAA2825>90LNsi ITGC ATGCAT GCA1210>90CCA ATGCAT TGGTTCTGCAGTT22>90>90Pae ITTAATTAA800GTTAATTAA C10025CC TTAATTAA GG120>90Pme IGTTTAAAC800GGTTTAAAC C10025GG GTTTAAAC CC12050AGCTTT GTTTAAAC GGCGCGCCGG2475>90Pst IGCTGCAG C800TGCA CTGCAG TGCA141010AACTGCAG AACCAATGCATTGG22>90>90AAAA CTGCAG CCAATGCATTGGAA24>90>90CTGCAG AACCAATGCATTGGATGCAT2600厂Pvu ICCGATCG G800ATCGATCG AT101025TCG CGATCG CGA12010Sac ICGAGCTC G81010'sac IIGCCGCGG C800TCC CCGCGG GGA1250>90Sal IGTCGAC GTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC2800GC GTCGAC GTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG301050ACGC GTCGAC GTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA321075Sca IGAGTACT C81025AAA AGTACT TTT127575厂Sma ICCCGGG6010CCCCGGG G8010CCCCCGGG GG101050TCC CCCGGG GGA12>90>90厂Spe IGACTAGT C810>90GG ACTAGT CC1010>90CGG ACTAGT CCG12050CTAG ACTAGT CTAG14050LSph IGGCATGC C800CAT GCATGC ATG12025ACAT GCATGC ATGT141050Stu IAAGGCCT T8>90>90GAAGGCCT TC10>90>90AAAAGGCCT TTT12>90>90Xba ICTCTAGA G800GC TCTAGA GC10>90>90TGC TCTAGA GCA1275>90CTAG TCTAGA CTAG1475>90厂Xho ICCTCGAG G800CC CTCGAG GG101025CCG CTCGAG CGG121075Xma ICCCCGGG G800CCCCCGGG GG102575CCC CCCGGG GGG1250>90TCCC CCCGGG GGGA14>90>90