苦参碱脂质体的制备

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1、苦参碱脂质体的制备方法 【摘要】探讨制备苦参碱脂质体的不同工艺。主要介绍主动载药与被动载药这两大类制备方法，根据其不同的优缺点进行比较。 【关键词】 苦参碱脂质体 主动载药 被动载药前言苦参碱脂质体（liposome）是一种人工膜。在水中磷脂分子亲水头部插入水中，苦参碱脂质体疏水尾部伸向空气，搅动后形成双层脂分子的球形苦参碱脂质体，直径251000nm不等。苦参碱脂质体可用于转基因，或制备的药物，利用苦参碱脂质体可以和细胞膜融合的特点，将药物送入细胞内部。 苦参碱脂质体作为一种重要载体，具有保护药物，提高药效，减少制剂对机体的毒性和提高药物的靶向性等方面的优越性。概述了薄膜分散法，高压乳匀法，

2、逆向蒸发法，乙醇注入法，微乳冷却法，冻融法和冷冻干燥法等几种苦参碱脂质体的制备方法，以及苦参碱脂质体的评价指标。三十年来，人们就其制备方法进行了大量的研究，苦参碱脂质体是由磷脂分子在水相中通过疏水作用形成的，因此制备苦参碱脂质体所强调的不是膜组装，而是如何形成适当大小，包封率和稳定性的囊泡。制备的方法不同，苦参碱脂质体的粒径可以从几十纳米到几微米，并且结构也不尽相同。目前，制备苦参碱脂质体的方法较多，常用的有薄膜法，反相蒸发法，溶剂注入法和复乳法等，这些方法一般称为被动载药法，而PH梯度法，硫酸铵梯度法一般被称为主动载药法。1.被动载药法苦参碱脂质体常用的制备方法主要有薄膜分散法，逆相蒸发法，

3、注入法，等。在制备含药苦参碱脂质体时，首先将药物溶于水相或有机相中，然后按适宜的方法制备含药苦参碱脂质体，该法适于脂溶性强的药物，所得苦参碱脂质体具有较高包封率。1.1薄膜分散法这是一种经典的制备方法，它可以形成多室苦参碱脂质体，经过超声处理后得到小单室苦参碱脂质体。此方法的有点是操作简便，苦参碱脂质体结构典型，但包封率较低。将磷脂，胆固醇等类脂质及脂溶性药物溶于氯仿（或其他有机溶剂中）然后将氯仿溶液在一玻璃瓶中旋转蒸发，在瓶内壁上形成一薄膜；再将水溶性药物溶于磷酸盐缓冲液中，加入烧瓶中不断搅拌，即得苦参碱脂质体。例如，氟尿嘧啶苦参碱脂质体，就是用磷脂(卵磷脂或脑磷脂)和胆固醇与磷酸二鲸蜡脂，

4、按摩尔比7：2：1或48：28：1配成氯仿溶液，真空蒸发除去氯仿，使在器壁上形成的薄膜加入等渗的缓冲液(pH为60，001molL磷酸盐)，其中含氟尿嘧啶77 mmolL，类脂质在缓冲液中的浓度为5070mmolL，加玻璃珠数枚，搅拌2min，在25放置2h，使薄膜吸胀；再在25搅拌2h，得到苦参碱脂质体，粒径为055m。 1.2冷冻干燥法将磷脂经超声处理，然后高度分散于缓冲盐溶液中，并加入冻结保护剂(如甘露醇、葡萄糖、海藻酸等)，冷冻干燥后，将干燥物分散到含药物的缓冲盐溶液或其他水性介质中，即可形成苦参碱脂质体。对遇热不稳定的药物尤为适宜。目前，该法已成为较有前途的改善苦参碱脂质体制剂长期稳

5、定性的方法之一。例如，维生素B。苦参碱脂质体的制备，取卵磷脂289分散于100mmolL磷酸盐缓冲液(pH为7)与09氯化钠溶液(1：1)的混合液中，超声处理后与甘露醇混合，于真空下冷冻干燥，随即用含l25mg维生素Bt。的上述缓冲盐溶液进行分散，进一步超声处理，即可得到均匀苦参碱脂质体混悬液。1.3超声波分散法将水溶性药物溶于磷酸盐缓冲液中，磷脂、胆固醇与脂溶性药物共溶于有机溶剂，搅拌蒸发除去有机溶剂。残液以超声波处理，然后分离出苦参碱脂质体再混悬于磷酸盐缓冲液中，制成苦参碱脂质体的混悬型注射剂。经超声波处理大多为单室苦参碱脂质体。例如，氨基酸苦参碱脂质体的制备，取氨基酸50mg溶于pH为7

6、1的磷酸盐缓冲液中，加入到由磷脂25mg、胆固醇42mg、磷酸二鲸蜡脂28mg，溶于55ml氯仿环己烷制成的溶液中，蒸发除去环己烷，残液经超声分散，分离出苦参碱脂质体，重新混悬于磷酸盐缓冲液中。该苦参碱脂质体在4能贮存一个月，可供口服或注射给药，具缓释作用。1.4冻融法采用此法制备的多相苦参碱脂质体，其物理稳定性好，可加热灭菌。此法首先制备包封有药物的苦参碱脂质体，然后冷冻。在快速冷冻过程中，由于冰晶的形成，使形成的苦参碱脂质体膜破裂，冰晶的片层与破碎的膜同时存在，此状态不稳定，在缓慢融化过程中，暴露出的脂膜互相融合重新形成苦参碱脂质体。1.5复乳法此法第1步将磷脂溶于有机溶剂，加入待包封药物

7、的溶液，乳化得到W/O 初乳，第2步将初乳加入到10倍体积的水中混合，乳化得到W/O/W乳液，然后在一定温度下去除有机溶剂即可得到苦参碱脂质体。用乳化法制得苦参碱脂质体的包封率比较高，但是粒径较大。1.6注入法将磷脂与胆固醇等类脂质及脂溶性药物溶于有机溶剂中（一般多采用乙醚），然后将此药液经注射器缓缓注入加热至50（并用磁力搅拌）的磷酸盐缓冲液（或含有水溶性药物）中，加完后，不断搅拌至乙醚除尽为止，即制得大多孔苦参碱脂质体，其粒径较大，不适宜静脉注射。再将苦参碱脂质体混悬液通过高压乳匀二次，则所得的成品。例如：亚油酸苦参碱脂质体，取磷酸盐缓冲液100ml，在磁力搅拌器上搅拌加热至约60；再称取

8、1g精制大豆磷脂、1g胆固醇、1g亚油酸及2g油酸山梨坦溶于30ml乙醚中，然后滴注于上述60缓冲盐溶液中，继续搅拌，加适量缓冲盐溶液至100ml即得。1.7逆相蒸发法将水溶性药物溶于磷酸盐缓冲液磷脂、胆固醇与脂溶性药物共溶于有机溶剂，混合，超声处理直至形成稳定的W/O乳剂减压蒸发除去有机溶剂达到胶态后，加入磷酸盐缓冲液，旋转使器壁上凝胶脱落，继续减压蒸发除去有机溶剂，得到苦参碱脂质体水性混悬液。本法特点是包封的药物量大，体积包封率可大于超声波分散法30倍，适合于包封水溶性药物及大分子生物活性物质。如各种抗生素、胰岛素、免疫球蛋白、碱性磷脂酶、核酸等。例如：超氧化物歧化酶(SOD)苦参碱脂质体

9、的制备，将卵磷脂lOOmg和胆固醇50mg溶于乙醚中，加入用4mmolL磷酸盐缓冲溶液(PBS)配成的SOD溶液，超声处理2min(每处理05min，间歇05min)，立即在水浴中减压旋转蒸发至呈现凝胶状，旋涡振荡使凝胶转相，再继续蒸发除尽乙醚，超速离心(35000rmin，30min)分离除去未包人的SOD，沉淀用水洗2次，离心，得沉淀，用10mmolL PBS稀释即得。 1.8超临界法传统的苦参碱脂质体制备方法，必须要使用氯仿，乙醚、甲醇等有机溶剂，这对环境和人体都是有害的。超临界二氧化碳是一种无毒、惰性且对环境无害的反应介质。用超临界法制备了头孢唑林钠苦参碱脂质体，将一定量的卵磷脂溶解于

10、乙醇中配得卵磷酯乙醇溶液，与头孢唑啉钠溶液一起放入加入高压釜中，将高压釜放入恒温水浴中，通入CO2。在其超临界态下孵化30min，制备苦参碱脂质体。采用超临界CO2法制备的包封率高、粒径小，稳定性增强。2.主动载药对于两亲性药物，如某些弱酸弱碱，其油水分配系数介质pH和离子强度的影响较大，用被动载药法制得的苦参碱脂质体包封率低。主动载药是利用两亲性的药物，能以电中性的形式跨越脂质双层，但其电离形式却不能跨越的原理来实现的。通过形成苦参碱脂质体膜内、外水相的pH梯度差异，使苦参碱脂质体外水相的药物自发地向苦参碱脂质体内部聚集。苦参碱脂质体主动载药法是在制备苦参碱脂质体的传统方法上引入pH梯度法等

11、而形成的一种新的制备方法,使得制备高包封率苦参碱脂质体成为可能,较好地改变了难以制备水溶性药物苦参碱脂质体的局面。2.1 pH梯度法pH梯度法通过调节苦参碱脂质体内外水相的pH值，形成一定的pH梯度差，弱酸或弱碱药物则顺着pH梯度，以分子形式跨越磷脂膜而使以离子形式被包封在内水相中。赵妍等用以pH梯度法制备硫酸长春新碱苦参碱脂质体，其包封率大于85%，而被动载药法制备的硫酸长春新碱苦参碱脂质体的包封率最高为14.4%。Jia等用pH梯度法内水相pH 0.5%外水相pH4.0制备了卡苯达唑苦参碱脂质体，包封率高于95%。杜松等用pH梯度法制备盐酸去氢骆驼蓬碱苦参碱脂质体，包封率大于80%，研究表

12、明，虽然制得的苦参碱脂质体没有加强药物的抗癌活性，但是大大降低了其毒副作用。2.2硫酸铵梯度法硫酸铵梯度法通过游离氨扩散到苦参碱脂质体外，间接形成pH梯度，使药物积聚到苦参碱脂质体内。其方法为先将硫酸铵包与苦参碱脂质体内水相，然后通过透析、凝胶色谱或超滤的方法除去苦参碱脂质体外水相的硫酸铵。由于离子对双分子层渗透系数的不同，氨分子渗透系数（0.13 cm/s）较高，能很快扩散到外水相中；H+的渗透系数远小于氨分子，因此会使苦参碱脂质体内水相呈酸性，形成pH梯度，梯度大小由NH4+外水相/NH4+内水相比较决定，这样使药物逆硫酸铵梯度载入苦参碱脂质体。药物与SO42-形成的硫酸盐，对双分子层有很

13、低渗透系数，因而使药物具有很高的包封率。相比较于pH梯度法，硫酸铵梯度法不需要改变外水相的pH值，控制梯度也易实现，整个过程无需缓冲液或pH滴定，内水相只有pH梯度法更有利于苦参碱脂质体的稳定。2.3醋酸钙梯度法醋酸钙梯度法通过醋酸钙的跨膜运动产生的醋酸钙浓度梯度（内部的浓度高于外部），使得大量质子从苦参碱脂质体内部转运到外部产生pH梯度。醋酸的渗透参数（6.610-4cms-1)比Ca2+（2.510-11cms-1）大7个数量级，所以很少穿越双分子膜留在苦参碱脂质体内部，醋酸分子则参与了质子转运。醋酸钙跨膜运动产生的浓度梯度（内部的浓度高于外部）导致大量质子从苦参碱脂质体的内部转运到外部产

14、生pH梯度，而pH的不平衡为包载和聚集弱碱药物提供了高效驱动力。因此，在这基础上应用醋酸钙梯度法把弱酸药物萘啶酸包载入预制备好的空白苦参碱脂质体中，包封率约99%，在4下存放10个月均稳定未见泄露。3.苦参碱脂质体的质量控制与评价3.1形态、粒径及其分布采用扫描电镜、激光散射法或激光扫描法测定。根据给药途径不同要求其粒径不同。如注射给药苦参碱脂质体的粒径应小于20nm，且分布均匀，呈正态性，跨距宜小。3.2包封率和载药量 包封率：包封率（苦参碱脂质体中包封的药物/苦参碱脂质体中药物总量）100 一般采用葡聚糖凝胶、超速离心法、透析法等分离方法将溶液中游离药物和苦参碱脂质体分离，分别测定，计算包

15、封率。通常要求苦参碱脂质体的药物包封率达80%以上。 载药量：载药量苦参碱脂质体中药物量/（苦参碱脂质体中药物载体总量）100 载药量的大小直接影响到药物的临床应用剂量，故载药量愈大，愈易满足临床需要。载药量与药物的性质有关，通常亲脂性药物或亲水性药物较易制成苦参碱脂质体。 3.3苦参碱脂质体的稳定性 物理稳定性:主要用渗漏率表示渗漏率（放置前介质中药物量放置后介质中的药量）/制剂中药量x100% 胆固醇以加固脂质双分子层膜，降低膜流动，可减小渗漏率。 3.4化学稳定性： (1)磷脂氧化指数,一般规定磷脂氧化指数应小于0.2。 (2)磷脂量的测定：基于每个磷脂分子中仅含1个磷原素，采用化学法将

16、样品中磷脂转变为无机磷后测定磷摩尔量（或重量），即可推出磷脂量。 4.结语苦参碱脂质体作为一种新型的药物传递系统正越来越被人们重视。评价苦参碱脂质体质量的指标有外观、粒径分布和包封率等，其中包封率是衡量苦参碱脂质体内在质量的一个重要指标。制备方法的不同，苦参碱脂质体的粒径、结构以及包封率都不尽相同。被动载药法适于脂溶性的药物，包封率高且不易泄露。而主动载药法适于两亲性药物，其包封率一般80%，开启了制备高包封率水溶性药物苦参碱脂质体的新思路【参考文献】1丁丽燕,杨 春,李学明,等.乙醇注入法制备司帕沙星苦参碱脂质体J.南京工业大学学报,2007,1:32.2 王健松,朱家壁.乙醚注入法制备阿奇

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