第7章蛋白质的分离纯化与鉴定

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1、Protein Engineering南华大学生化与分子生物学教研室办公室第3教学楼315室版权声明本课件版权所有未经允许不得转载。Protein Engineering曹运长博士、副教授南华大学生化与分子生物学教研室ETel: 15886467200SeparationPurification and Identification of Proteins进行蛋白修饰时需要单一蛋白质为原料需要单一蛋白质来研究其结构与功能需要大量纯化经过改造的蛋白质作为产品开发。为什么要分离、纯化与鉴定蛋白质蛋白质分离、纯化与鉴定的理论基础分子大小带电性质变性与复性溶解特性结晶特性分子表面特性分子形状紫外吸收特

2、性颜色反应。透析、超滤、分子筛层析、PAGE等电点沉淀、等电聚焦电泳、离子交换层析用尿素变性复性从包涵体中分离蛋白盐析法分级沉淀、有机溶剂分级沉淀结晶纯化吸附层析亲和层析蛋白定量分析双缩脲反应鉴定和定量蛋白蛋白定量分析亲和层析蛋白定量分析吸附层析亲和层析蛋白定量分析吸附层析蛋白定量分析吸附层析用尿素变性复性从包涵体中分离蛋白吸附层析用尿素变性复性从包涵体中分离蛋白第一节蛋白质的分离纯化概述目的提高目标蛋白的纯度、产量、保持蛋白质的活性。实验材料的选择实验材料预处理蛋白质粗分级蛋白质细分级蛋白质的结晶蛋白质的鉴定。蛋白质分离、纯化与鉴定的主要步骤实验材料的选择选择标准目标蛋白含量高所含杂质少来源

3、广、容易获得成本低廉。实验材料有细胞、组织、器官甚至整个生物体。实验材料预处理液体材料离心、过滤后洗涤固体材料洗涤、材料破碎注意动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织油料种子等材料应先用低沸点的有机溶剂如乙醚等脱脂。洗涤顺序先自来水、后蒸馏水、蛋白质提取缓冲液。细小材料洗涤方法将洗涤液悬浮材料、离心反复几次。破碎方法组织、器官、整个生物体采用机械破碎即剪碎、研磨、匀浆、超声、酶解、溶胀等方法。细菌、单细胞超声、酶解、反复冻溶等方法。蛋白质的提取离心或过滤去除不溶物得到蛋白质粗提取物采用特定蛋白质提取缓冲液抽提溶解蛋白质实验材料破碎后要求:释放溶解目的蛋白防止其降解并保持目的蛋白的天然结构和活性。蛋

4、白质的粗分级目的:对蛋白提取液初步分离纯化去除其他糖类、脂类、核酸等杂质并初步去除其他杂蛋白得到浓缩后目标蛋白的粗制品。方法盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级沉淀、透析、超滤、超速离心等。有些蛋白质提取液体积较大又不适于用沉淀或盐析法浓缩则可采用超过滤、凝胶过滤、冷冻真空干燥或其他方法如聚乙二醇浓缩法进行浓缩。蛋白质的细分级一般使用层析法包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等。必要时还可结合电泳法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳等得到高纯度的目标蛋白样品。注用于细分级分离的方法一般规模较小但分辨率很高。结晶是蛋白质分离纯化的最后步骤。尽管结晶并不能保证蛋白质一定是均一的但只有某种蛋

5、白质在溶液中数量上占优势时才能形成结晶。结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化而重结晶又可除去少量夹杂的蛋白质。由于结晶中从未发现过变性蛋白质因此蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志也是断定制品处于天然状态的有力指标。蛋白质的鉴定目的确定蛋白质的纯度、分子质量、等电点、氨基酸组成及排列顺序、结晶特性及高级结构、免疫特性、生物学功能等。蛋白质的纯度色谱、电泳、结晶。分子质量、等电点聚丙烯酰胺凝胶电泳、质谱IEF。氨基酸组成及排列顺序高效液相色谱、Edman降解法。结晶特性及高级结构射线晶体衍射法、核磁共振法。免疫特性蛋白质免疫印迹分析。生物学功能基因工程方法如转基因、基因敲除、基因沉默等。第二节蛋白质的

6、提取目标保证蛋白质溶解和维持天然的结构和活性。条件选择合适的蛋白质提取缓冲液。缓冲液的成分控制溶液pH的缓冲对控制溶液离子强度的无机盐控制溶液氧化还原状态的还原剂蛋白酶抑制剂金属离子螯合剂标准牛血清白蛋白去污剂水和防腐剂甘油。控制溶液pH的缓冲对: 蛋白质的两性电离及等电点蛋白质含有酸/碱AA残基具有两性?决多数蛋白质pI通常在6.0 左右。常用的缓冲对Na2K2HPO4/ NaKH2PO4Trisbase / HClTrisbase /Gly巴比妥钠/ HCl柠檬酸钠/ 柠檬酸乙酸钠/ 乙酸。溶液pH处在蛋白质等电点时蛋白质的溶解度最低。因此溶液pH应尽量远离其等电点并接近其生理pH。控制溶

7、液离子强度的无机盐: 原理蛋白质在生理环境中都处在一定离子强度的溶液中如动物和人体液的离子强度相当于0.9的生理盐水。处于高渗或低渗的溶液中蛋白质的结构会发生改变甚至失去活性。目的有助于维持蛋白质的结构与功能还有助于增加蛋白质的溶解度。常用的无机盐动物蛋白抽提用NaCl植物蛋白使用KCl。控制溶液氧化还原状态的还原剂: 原理细胞内氧浓度细胞外大气的氧浓度。蛋白质提取出来后处于高浓度的氧环境易氧化。氧化的基团巯基。结果蛋白质结构发生变化或失活。措施加入还原剂如-巯基乙醇、DTT二硫苏糖醇。蛋白酶抑制剂: 原理在细胞内蛋白酶处于特定的区域植物细胞液泡动物细胞溶酶体。细胞破碎后目标蛋白质与蛋白酶直接

8、接触导致降解。措施加入蛋白酶抑制剂。金属离子螯合剂: 原理金属离子对目标蛋白具有一定影响。措施加入金属离子螯合剂如乙二胺四乙酸EDTA同时也是金属蛋白酶的强烈抑制剂。标准牛血清白蛋白: 原理蛋白质在高浓度条件下蛋白质之间会发生相互作用可减少溶剂对蛋白质的影响维持蛋白质的稳定。措施加入一定浓度的BSA。去污剂: 原理去污剂易使细胞破碎有利于提取膜蛋白。常用的去污剂Triton X-100Tween-20 80SDSCHAPS3-3-胆酰胺丙基-二乙胺-丙磺酸用途两性表面活性剂CHAPS是一种非变性的zwitterionic去垢剂、蛋白质裂解液用于增溶膜蛋白和裂解蛋白-蛋白之间的相互作用。原理CH

9、APS保护蛋白质的天然状态可溶解膜蛋白从而解除蛋白与蛋白质间的相互作用。透析可除去等。注意低浓度去污剂利于蛋白质溶解高浓度的去污剂会导致蛋白质变性。水和防腐剂: 甘油: 原理为避免细菌和其它杂质污染配制缓冲液通常选用蒸馏水、双蒸水、三蒸水、去离子水使用时高压灭菌。有时还需加防腐剂如NaN3等。原理甘油利于维持蛋白质的结构和活性。通常加入2050终浓度的甘油。举例酶试剂常用50的甘油保存于-20。第三节蛋白质的粗分级目的得到蛋白粗提取液后浓缩目标蛋白去除部分杂质。硫酸铵分级沉淀盐析法有机溶剂分级沉淀超速离心等电点沉淀透析超滤蛋白质结晶。粗分级方法一、硫酸铵分级沉淀: 蛋白质的胶体性质colloi

10、dal system胶体溶液的特点分子直径在1-100 nm内、溶于水、不易聚集沉淀。蛋白质胶体溶液的稳定因素1.同种蛋白带同种电荷相互排斥。2.表面有水化膜。蛋白质分子表面的亲水基团如一NH2-COOH -OH以及CO-NH-等在水溶液中能与水分子起水化作用使蛋白质分子表面形成一个水化层每克蛋白质分子能结合0.30.5克水。盐析蛋白质在高浓度的中性盐溶液中会沉淀析出。原理破坏水化膜、中和表面电荷。盐通常为硫酸铵。硫酸铵分级沉淀由于不同蛋白质沉淀所需的盐离子浓度不同因此调节硫酸铵浓度可使不同的蛋白质分阶段沉淀下来。优点硫酸铵溶解度高、溶解过程发热少、蛋白沉淀完全、价格便宜。注盐析沉淀一般不引起

11、蛋白质变性。当除去盐后复可溶解。?向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质会沉淀析出?原因盐析注意事项硫酸铵溶解度和溶液温度的关系。解决方法提取一般在低温下进行。添加固体硫酸铵时会造成局部浓度过大而导致蛋白质不可逆变性。解决方法边加边搅拌或加饱和硫酸铵溶液。实例25下往蛋白粗提液中加入20硫酸铵搅拌溶解3060min蛋白质沉淀离心回收继续提高上清液中硫酸铵浓度至40 搅拌溶解3060min蛋白质沉淀离心回收继续提高硫酸铵浓度至55 搅拌溶解3060min蛋白质沉淀离心回收共得到A、B、C和上清液四部分。优点使蛋白得到初步纯化并使蛋白得到了浓缩。缺陷分辨率不高蛋白质中含高盐需脱盐使用透析、超滤、凝胶

12、过滤等。二、有机溶剂分级沉淀: 原理原理一是有机溶剂会降低水的介电常数导致一是有机溶剂会降低水的介电常数导致降低降低蛋白质颗蛋白质颗粒之间的相互排斥作用。二是会与蛋白争夺水分子粒之间的相互排斥作用。二是会与蛋白争夺水分子破坏水化破坏水化膜膜。常用的有机溶剂常用的有机溶剂甲醇、乙醇、丙酮。甲醇、乙醇、丙酮。有机溶剂分级沉淀有机溶剂分级沉淀不同蛋白质分子表面的极性与非极性氨不同蛋白质分子表面的极性与非极性氨基酸比例不同沉淀所需有机溶剂的浓度也不同。从而将不同基酸比例不同沉淀所需有机溶剂的浓度也不同。从而将不同的蛋白质分离。的蛋白质分离。优点优点分辨能力高、蛋白沉淀后无需脱盐、有机溶剂易去除。分辨能

13、力高、蛋白沉淀后无需脱盐、有机溶剂易去除。缺点缺点易引起蛋白质变性。易引起蛋白质变性。严格控制在低温下操作、并尽量缩严格控制在低温下操作、并尽量缩短处理时间则可使变性速度减慢。短处理时间则可使变性速度减慢。三、超速离心法centrifugation: 在离心力作用下溶液中不溶颗粒物会沉淀析出进而分离。离心力表示方法相对离心力RCF离心力常用地球引力的倍数来表示。用数字g0.98m/s2来表示。如1 000g。每分钟转数rpm与RCF之间的换算用公式RCF1.119105rpm2R R 为离心机转头半径注意相对离心力RCF与离心机转头半径无关。每分钟转数rpm与离心机转头半径有关。离心沉降速率与

14、物质颗粒大小关系颗粒越小需要的离心力越大离心时间越长。离心机型号的分类根据转速普通离心机最大离心力小于50006000g. 用于组织碎片、细胞的沉淀。高速冷冻离心机小于8000090000g有制冷和真空系统。用于亚细胞器的沉淀。超速离心机50万60万g。用于病毒、核酸、蛋白的沉淀。使用前应平衡普通离心机对称两管误差小于0.1g高速冷冻和超速离心机误差应小于0.01g。实例采用有机溶剂分级沉淀后得到的肌肉丙酮粉采用超速离心分离肌动蛋白。四、等电点沉淀法: 不同蛋白其pI不同。调整溶液pH不同蛋白在各自pI处依次沉淀分子间相互排斥作用力消失导致易聚集而沉淀。可再结合离心法或凝胶电泳分离。等电点沉淀

15、法的优缺点优点:沉淀分离得到的蛋白质不会发生变性可浓缩蛋白。缺点生物体内大多数蛋白质的等电点相差不大如人体蛋白pI大多数为6.8一个pH 条件下沉淀得到的蛋白往往不只有一种蛋白。只能用于蛋白质的粗分级。五、透析法dialysis: 利用蛋白质分子不能透过半透膜将其与小分子物质分开半透膜为玻璃纸或纤维素材料。优点不仅用于蛋白粗分级还可用于蛋白浓缩。六、超滤法super-filteration: 利用压力、抽滤或离心力等使水和其它小分子溶质通过半透膜而蛋白质被截留在膜上以达到浓缩和脱盐目的。滤膜有多种规格可选择性的截留相对分子量不同的蛋白质。七、结晶法: 天然蛋白质在一定条件下浓度达到过饱和状态时

16、就会结天然蛋白质在一定条件下浓度达到过饱和状态时就会结晶析出。有时由于沉淀剂的作用而聚集沉淀也可能形成结晶晶析出。有时由于沉淀剂的作用而聚集沉淀也可能形成结晶析出。如在高浓度硫酸铵作用下溶菌酶会形成晶体。析出。如在高浓度硫酸铵作用下溶菌酶会形成晶体。尽管结晶并不能保证蛋白质一定是均一的但只有某种蛋尽管结晶并不能保证蛋白质一定是均一的但只有某种蛋白质在溶液中数量上占优势时才能形成结晶。白质在溶液中数量上占优势时才能形成结晶。通常只有高活性、高纯度、高浓度的蛋白质才能结晶由于通常只有高活性、高纯度、高浓度的蛋白质才能结晶由于结晶中从未发现过变性蛋白质结晶中从未发现过变性蛋白质因此蛋白质的结晶不仅是

17、因此蛋白质的结晶不仅是纯纯度度的一个标志也是断定制品处于的一个标志也是断定制品处于天然状态天然状态的有力指标。的有力指标。意义意义蛋白质晶体是蛋白质三维结构分析的重要材料。蛋白质晶体是蛋白质三维结构分析的重要材料。八、其它方法: 重金属盐沉淀法蛋白质颗粒如带负电荷这样它就容易与重金属离子结合成不溶性盐而沉淀。生物碱试剂和某些酸类沉淀法蛋白质颗粒如带正电荷容易与生物碱试剂和酸类如三氯乙酸沉淀法的酸根负离子发生反应生成不溶性盐而沉淀。加热变性沉淀法所有蛋白质加热后会发生变性而凝固。注意注意以上方法常能使蛋白质发生变性。只有在纯化变性以上方法常能使蛋白质发生变性。只有在纯化变性蛋白时才可使用这些分离

18、方法。蛋白时才可使用这些分离方法。问答题以螺旋藻为材料从中分离纯化藻胆蛋白。请简要叙述其实验技术路线或实验方案。1. 实验材料的选择2. 实验材料的预处理3. 藻胆蛋白的粗分级。第四节蛋白质的细分级目的目的粗分级的蛋白产品的浓度、纯度还需进一步提高。粗分级的蛋白产品的浓度、纯度还需进一步提高。方法方法一般使用一般使用层析法层析法和和电泳法。层析法层析法又称之为色谱法。包括凝胶过滤、离子交换层析、又称之为色谱法。包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等。吸附层析以及亲和层析等。电泳法电泳法包括区带电泳、等电聚焦电泳、双向凝胶电泳等包括区带电泳、等电聚焦电泳、双向凝胶电泳等作为最后的纯化

19、步骤。作为最后的纯化步骤。注注用于细分级分离的材料一般规模较小但分辨率很高。用于细分级分离的材料一般规模较小但分辨率很高。一原理一原理凝胶层析也称为排阻凝胶层析、凝胶过滤和分凝胶层析也称为排阻凝胶层析、凝胶过滤和分子筛层析。子筛层析。它是利用凝胶把物质按它是利用凝胶把物质按分子大小不同进行分离分子大小不同进行分离的一种方法。的一种方法。洗脱时洗脱时大分子物质大分子物质由于直径大于凝胶网孔不能进入凝胶由于直径大于凝胶网孔不能进入凝胶内部只能沿着凝胶颗粒间的孔隙随溶剂向下移动因此内部只能沿着凝胶颗粒间的孔隙随溶剂向下移动因此流程短首先流出层析柱流程短首先流出层析柱而小分子物质而小分子物质由于直径小

20、于凝胶网孔能自由进出胶粒网由于直径小于凝胶网孔能自由进出胶粒网孔使之洗脱时流程增长移动速度慢而后流出层析柱。孔使之洗脱时流程增长移动速度慢而后流出层析柱。一、凝胶层析分子筛层析: 分子筛层析二凝胶介质1. 葡聚糖凝胶凝胶过滤常用的凝胶是交联葡聚糖。为环氧丙烷交联右旋糖苷制成。商品名为Sephadex G。不同规格型号用英文字母G和数值表示有G-10G-15G-25G-50G-75G-100G-150和G-200。G后面数值为1克干胶吸水值的10倍。例如G-200为每克干胶吸水20克。G后面数值越大凝胶孔径越大适于分离蛋白的质量越大。此外还有Sephadex LH-20LH-60是Sephade

21、x G-25的羧丙基衍生物能溶于水及亲脂溶剂用于分离脂溶性物质。2. 琼脂糖凝胶琼脂糖是琼脂中不带电荷的中性组成成份为半乳糖及其衍生物以氢键方式相互连接凝聚而成网状结构网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。商品名因生产厂家而异如Agarose Sigma Sepharose Pharmacia Bio-Gel-A Bio-Rad。把琼脂糖溶于热水冷却后制成凝胶。制成的小颗粒用于凝胶过滤。适于用sephadex不能分级分离的大分子的凝胶过滤。琼脂糖凝胶应用于分子筛层析的不多主要作为凝胶基质在其上连接其它分子制成离子交换层析、亲和层析等介质。3.聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺Acr和甲叉双丙烯酰胺Bis交联

22、而成。调节Acr 和Bis的浓度可制成孔径大小不同的凝胶。交联剂越多孔隙越小。商品名为Bio-Gel P主要由Bio-Rad公司生产适合蛋白和多糖的纯化。4. Sephacryl凝胶:由葡聚糖和甲叉双丙烯酰胺组成为葡聚糖凝胶的改进型。特点是机械强度大、洗脱速度快。5. Superdex凝胶由葡聚糖和琼脂糖交联而成。由Pharmacia生产。有较好的物理化学稳定性和高的分辨率。6. Superose凝胶由琼脂糖交叉连接而成。由Pharmacia生产。具有洗脱速度快、分辨率高、样品容量大等优点。1. 凝胶的预处理凝胶颗粒的溶胀。2. 装凝胶层析柱:无断层、无气泡、床面平整。3. 平衡、上样、洗脱、

23、检测与收集。平衡先蒸馏水洗脱平衡、后洗脱液洗脱平衡。4. 层析柱再生35体积的洗脱液洗脱平衡或用23倍体积的非离子去垢剂洗脱或用NaOH浸泡再用蒸馏水清洗。5. 层析柱拆卸6. 凝胶的保存。加入20乙醇或NaN3在4长期保存。三实验方法二、离子交换层析: 一原理是用离子交换剂作固定相利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的层析方法。即溶液中的离子同离子交换剂上功能基团交换反应的过程。带电荷量少亲和力小的先被洗脱下来带电荷量多亲和力大的后被洗脱下来。阴离子交换层析凝胶本身带正电荷带负电荷越多的蛋白质与凝胶的相互作用越大越难被洗脱。阳离子交换层析凝胶本身带负电荷带正电荷越多的

24、蛋白质与凝胶的相互作用越大越难被洗脱。凝胶介质的分类按功能基团带电荷性质阳离子交换剂带负电荷与阳离子交换。如CM羧甲基P磷酸基 S磺甲基 SE磺乙基 SP磺丙基等。阴离子交换剂带正电荷与阴离子交换。如AE氨基乙基DEAE二乙基氨基乙基QAE等。二凝胶介质离子交换层析介质由三部分组成1.惰性支持物。如纤维素、葡聚糖、琼脂糖或它们的衍生物。2.带电基团。与惰性支持物共价连接。3.平衡离子。-为NaH为OH-Cl-。离子交换剂可电离基团可电离基团结构CM-纤维素弱酸型羧甲基P-纤维素中酸型磷酸基SE-纤维素强酸型磺乙基SP-纤维素强酸型磺丙基常用的阳离子交换剂AE-纤维素弱碱型氨基乙基离子交换剂可电

25、离基团可电离基团结构PAB-纤维素弱碱型对氨基苯甲酸DEAE-纤维素二乙基氨基乙基DEAE -Sephadex 二乙基氨基乙基DEAE -纤维素强碱型二乙基氨基乙基QAE-纤维素强碱型二乙基2-羟丙基-氨基乙基中弱碱型中弱碱型常用的阴离子交换剂三实验方法1.凝胶的预处理凝胶颗粒的溶胀和活化。用水充分溶胀后阳离子交换剂需经过“碱-酸-碱”活化阴离子交换剂需经过“酸-碱-酸”活化2.装层析柱柱子短而粗。3.平衡、上样、洗脱、检测与收集。平衡阶段:离子交换剂与反离子平衡离子结合吸附阶段样品与反离子进行交换解吸附阶段用梯度缓冲溶液洗脱先洗下弱吸附物质后洗下强吸附物质再生阶段用原始平衡液进行充分洗涤既可重复使用。