课题申请书99mtc标记促凋亡蛋白smac多肽进行肿瘤显像的基础研究

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1、摘要：肿瘤的发生是细胞增殖与细胞凋亡失衡所致,凋亡抑制蛋白（IAP）是一类内源性caspases家族抑制因子,其过度表达引起的凋亡不足与肿瘤发生,治疗耐药密切相关。线粒体促凋亡蛋白Smac可通过其N端的4个氨基酸与多种IAP特异性结合，解除IAP的抑制作用。因此基于肿瘤高表达IAP, Smac多肽可特异性结合IAP这一特性，借助NHS-MAG3双功能螯合剂，99mTc标记融合细胞穿透序列的Smac 6肽，进行肿瘤显像，量化IAP表达，比较肿瘤治疗前后肿瘤摄取显像剂的差异，评估肿瘤治疗疗效。该方法的建立，不仅可丰富核医学肿瘤显像方法，还可将此多肽用治疗性核素如188Re标记，以凋亡抑制蛋白为靶点

2、进行肿瘤核素内放射治疗，具有极大的研究前景关键词：凋亡抑制蛋白；促凋亡蛋白Smac；多肽标记；肿瘤核素显像报告正文一 立项依据与研究内容立项依据 细胞凋亡是受基因调控的细胞自主死亡的过程，是一系列凋亡相关分子及其正、负调节分子相互作用的结果，这一过程对消除机体内老化细胞及具有潜在异常生长的细胞,保持机体处于稳态起着重要的作用。凋亡中, caspases家族即半胱天冬酶家族具有重要地位。caspases按其在凋亡过程中的功能分为启动酶和效应酶。启动酶包括caspase2,8,9,10；效应酶包括caspase3, 6,7。效应酶通过切断细胞间的信号传递,重组细胞骨架,关闭DNA 复制和修复,破坏

3、DNA和细胞核结构,诱导凋亡小体形成来执行凋亡功能1。 caspases家族以无活性的前体形式存在,该前体需经级联性的蛋白水解作用而被激活。而凋亡抑制蛋白( inhibitor of apoptosis proteins, IAPs)是caspases家族的内源性抑制因子，其成员包括XIAP,c-IAP1,c-IAP2,Survivin,Livin,NAIP,Apollen/Bruce,ILP2。该家族成员均含有13个杆状病毒IAP重复序列( baculoviral inhibitor of apoptosis repeats,BIR)，利用此结构区与caspase3,7, 9结合而发挥凋亡抑

4、制作用。比如XIAP含有3个BIR结构区，其中BIR1,2 连接区抑制caspase3,7，BIR3特异性地抑制caspase9。Livin含有一个BIR区，可特异性抑制caspase9;Survivin也通过其BIR区直接抑制caspase3,72,3。同样，IAPs抗凋亡的能力也受到调节。线粒体促凋亡蛋白Smac( second mitochondrial activator of caspase) /DIABLO(direct IAP binding protein with low pI) 可与多种IAPs包括XIAP,c-IAP1,c-IAP2, survivin,livin的BIR

5、区特异性结合，解除IAP的抑制作用,释放活化的caspases。Smac，25kDa大小，前体存在于正常细胞线粒体,在凋亡信号刺激下, 其N端55个氨基酸被剪切，形成成熟的Smac释放到细胞质而发挥作用4。X线晶体衍射成像显示成熟的Smac通过N端前4个氨基酸：丙氨酸缬氨酸脯氨酸异亮氨酸（AVPI）与IAP家族的BIR结构域表面凹槽结合，从而解除对caspase的抑制，发挥促凋亡作用5。（图1：caspases，IAP和Smac相互作用关系示意图，图2：Smac解除IAP抑制caspase作用示意图）利用此特性， Arnt等分别将成熟Smac 氨基端的4个氨基酸（AVPI）、6个氨基酸(AVP

6、IAQ)、8个氨基酸(AVPIAQKS)与果蝇触角转录因子穿透序列（RQIKIWFQNRRMKWKK）相连接，合成可穿透细胞的融合多肽，与一些上皮来源的肿瘤细胞如乳腺癌细胞株MCF-7,T47D孵育，通过免疫共沉淀的方法证实各种融合多肽的确能穿透细胞膜，与内源性的XIAP,cIAP1结合，并能提高化疗药物如依托泊苷、紫杉醇诱发的凋亡，其中Smac 6肽能力最强6。Vucic等也合成了含有果蝇触角转录因子穿透序列Smac 9肽（AVPIAQKSE），利用极化荧光分析技术证实Smac9肽不仅可以和XIAP的BIR3区结合，同样也可和Livin的BIR区结合7。Sun等利用核磁共振分光法证实Smac

7、多肽也可类似结合XIAP与survivn结合 8。IAP家族成员在多种人类恶性肿瘤中表达明显增高，以Survivin, XIAP，c-IAP1,c-IAP2,Livin为著。如肺癌（85.5）、胰腺癌（88）、食道癌（70%）、结肠癌（53%）、乳腺癌（60）、结肠癌（53.2）、膀胱癌（58）和胃癌（68）表达survivin，且其表达与肿瘤的恶性程度和预后显著相关 9-12 。在恶性黑色素瘤、肺癌、胃癌、膀胱癌、绒毛膜癌中有Livin表达，尤其在恶性黑色素瘤组织中的阳性率可达47.6%70.6%，明显高于黑色素细胞痣（21.4 25.0%）13。XIAP也在白血病、肝癌、肺癌、子宫颈癌等多

8、种恶性肿瘤中表达增高。本课题负责人所在之研究小组利用组织芯片及免疫组化技术对1100余例人类肿瘤中IAP家族成员的表达情况进行分析，也得到了相似结果。肿瘤治疗过程中, 许多抗肿瘤药物及放疗均是通过启动细胞凋亡机制完成的, 而凋亡过程的抑制常常导致肿瘤细胞耐药14。IAP在肿瘤细胞中过表达是肿瘤细胞逃避免疫监督的主要原因,IAP基因表达增高,细胞凋亡受抑,导致肿瘤耐药。如Kato等的研究表明,食道癌Survivin的高表达能够对抗抗癌药引起的凋亡,在化疗效果好的患者的肿瘤组织中Survivin表达水平明显低于化疗效果差的患者,提示Survivin表达量能够预测肿瘤对化疗的反应12。Li等检测了卵

9、巢癌细胞中XIAP的表达情况,发现耐药细胞株XIAP的表达水平明显强于对化疗药物敏感细胞株,敏感细胞株经顺铂处理后, XIAP的表达下降,凋亡指数上升,而对耐药细胞株, 顺铂未能影响XIAP的水平及细胞凋亡15。因此，定量分析IAP 表达对评估肿瘤的恶性程度、预后及治疗反应有极大的帮助。大多数肿瘤高表达IAP，Smac多肽可特异性结合IAP。多肽具有组织渗透迅速、血液中清除快、免疫原性低和合成方便的特性。因此, 若用某些可被探测的物质如放射性同位素标记该多肽，注射入体内，采用SPECT或PET则可进行肿瘤显像，同时还可以进行定量分析，量化IAP的表达，为临床医生评估肿瘤的恶性程度及预后，制定疾

10、病的治疗方案提供重要的帮助，同时还可为治疗药物的筛选提供有力的帮助。99mTc是目前运用广泛的纯核素，具有优良的理化性质，能标记多种化合物，在核医学临床诊断和实验研究中得到了广泛的运用。巯基乙酰三甘氨酰-N-羟基丁二酰亚胺酯(NHS-MAG3) 作为一种有效的双功能螯合剂, 在90 年代中后期被用于人多克隆免疫球蛋白、抗体、小分子肽、DNA 寡核苷酸及肽核酸等的99m Tc 标记16。通过NHS-MAG3 得到的标记产物, 血浆蛋白结合率低, 特别适合小分子物质的标记。因此本研究选择NHS-MAG3作为螯合剂，对融合了穿透序列的成熟Smac氨基端的前6个氨基酸AVPIAQ-RQIKIWFQNR

11、RMKWKK 进行99m Tc 标记, 探讨用于肿瘤诊断，预后以及肿瘤耐药评价的可行性。试图通过基于凋亡抑制基因进行的显像，扩展肿瘤核素显像方法，为临床评估肿瘤预后、治疗疗效提供有用信息。如该方法的确可行，还可对其进行188Re标记，以凋亡抑制蛋白为靶点进行肿瘤核素内放射治疗，具有极大的研究前景。图1 凋亡信号传导通路示意图（Fuentes-Prior P，2004）图2 Smac/DIABLO 解除IAP蛋白抑制caspase作用示意图（Verhagen AM ，2001）a caspase 9通过其P10 亚单位与XIAP的BIR3结构域凹槽紧密结合b capase3的催化部位同BIR2上

12、游的连接体区结合（capase7也类似）c Smac/DIABLO N端氨基酸 与caspase9 类似，可竞争性结合BIR3凹槽，解除IAP对caspase9的抑制d Smac/DIABLO 可与BIR2上游的连接体区结合，解除对caspase3，7抑制参考文献1: Jacobson MD, Weil M, Raff MC, et al. Programmed cell death in animal development. Cell. 1997;88(3):347-54. .2: Verhagen AM, Coulson EJ, Vaux DL. Inhibitor of apoptos

13、is proteins and their relatives: IAPs and other BIRPs. Genome Biol. 2001;2(7):REVIEWS3009. 3: Shi Y. Mechanisms of caspase activation and inhibition during apoptosis. Mol Cell. 2002;9(3):459-70. 4: Du C, Fang M, Li Y, et al. Smac, a mitochondrial protein that promotes cytochrome c-dependent caspase

14、activation by eliminating IAP inhibition. Cell. 2000;102(1):33-42. 5: Wu G, Chai J, Suber TL, et al. Structural basis of IAP recognition by Smac/DIABLO. Nature. 2000;408(6815):1008-12. 6: Arnt CR, Chiorean MV, Heldebrant MP, et al. Synthetic Smac/DIABLO peptides enhance the effects of chemotherapeut

15、ic agents by binding XIAP and cIAP1 in situ. J Biol Chem. 2002;277(46):44236-43. 7: Vucic D, Deshayes K, Ackerly H, et al. SMAC negatively regulates the anti-apoptotic activity of melanoma inhibitor of apoptosis (ML-IAP). J Biol Chem. 2002;277(14):12275-9. 8: Sun C, Nettesheim D, Liu Z, et al. Solut

16、ion structure of human survivin and its binding interface with Smac/Diablo. Biochemistry. 2005;44(1):11-7.9: Kennedy SM, ODriscoll L, Purcell R, et al. Prognostic importance of survivin in breast cancer. Br J Cancer. 2003;88(7):1077-83.10: Sarela AI, Verbeke CS, Ramsdale J, et al. Expression of surv

17、ivin, a novel inhibitor of apoptosis and cell cycle regulatory protein, in pancreatic adenocarcinoma. Br J Cancer. 2002;86(6):886-92.11: Ku JH, Kwak C, Lee HS, et al. Expression of survivin, a novel inhibitor of apoptosis, in superficial transitional cell carcinoma of the bladder. J Urol. 2004;171(2

18、 Pt 1):631-5. 12: Kato J, Kuwabara Y, Mitani M, et al. Expression of survivin in esophageal cancer: correlation with the prognosis and response to chemotherapy. Int J Cancer. 2001;95(2):92-5.13: Gong J, Chen N, Zhou Q, et al. Melanoma inhibitor of apoptosis protein is expressed differentially in mel

19、anoma and melanocytic naevus, but similarly in primary and metastatic melanomas. J Clin Pathol. 2005;58(10):1081-5.14: Johnstone RW, Ruefli AA, Lowe SW. et al. Apoptosis: a link between cancer genetics and chemotherapy. Cell. 2002;108(2):153-64. 15: Li J, Feng Q, Kim JM, et al. Human ovarian cancer

20、and cisplatin resistance: possible role of inhibitor of apoptosis proteins. Endocrinology. 2001;142(1):370-80.16: Winnard P Jr, Chang F, Rusckowski M, et al. Preparation and use of NHS-MAG3 for technetium-99m labeling of DNA. Nucl Med Biol. 1997;24(5):425-32.项目的研究内容、研究目标以及拟解决的关键问题研究内容 99m Tc标记MAG3-S

21、mac及其性质鉴定 人工合成融合了细胞穿透序列的Smac 6肽AVPIAQ-RQIKIWFQNRRMKWKK，对照肽为Smac N端6肽反向排列QAIPVA- RQIKIWFQNRRMKWKK；以及不含穿透序列的Smac 6肽AVPIAQ 四步法合成NHS-MAG3，偶联合成肽，99mTc标记； 标记物纯化、测定放化纯以及检测标记物的稳定性和血浆蛋白结合率。 99m Tc-Smac体外生物学性质鉴定. 检测肿瘤细胞摄取99m Tc-Smac的能力； 利用大肠杆菌表达XIAP、Survivin、Livin蛋白；表面等离子体共振技术测定标记物与XIAP、Survivin、Livin蛋白结合的Kd值

22、。 动物模型的建立与动物体内显像的研究研究99m Tc-Smac 在动物体内的生物学分布、血液清除、体内代谢；荷瘤裸鼠建立，将99m Tc-Smac注射入动物模型后SPECT显像，分析肿瘤细胞内放射性强度；通过注射显像剂后不同时间显像结果分析，确定最佳显像时间； 荷瘤裸鼠放疗或化疗后，比较肿瘤摄取显像剂的差异；评价治疗疗效；肿瘤组织XIAP、Survivin、Livin染色阳性细胞数与肿瘤摄取显像剂强度的相关性分析。研究目标 (1) 借助NHS-MAG3双功能螯合剂，使用99m Tc标记可和肿瘤高表达的凋亡抑制基因结合的Smac多肽，实现肿瘤显像的可能性，从而建立一种新型肿瘤显像方法；(2)

23、该显像方法除了可对肿瘤进行多次显像外，还能定量测定凋亡抑制基因的表达水平，对评估肿瘤预后、治疗疗效提供有用信息，充分体现分子核医学与临床应用中的价值。拟解决的关键问题 99m Tc标记MAG3-Smac，要有优良的标记特性，保持与IAP蛋白的结合力，确能进入肿瘤细胞，实现肿瘤显像、评估肿瘤预后、治疗疗效的可能性。拟采取的研究方案及可行性分析研究方案合成99m Tc-Smac，经纯化、性质鉴定后测定其与IAP蛋白亲和力、靶特异性、生物稳定性。其在动物体内生物学分布、体内代谢、血液清除速率等将通过荷瘤裸鼠加以研究。注射99m Tc-Smac后进行SPECT显像，定量分析放射性强度,并比较治疗前后放

24、射性强度变化；显像结果通过肿瘤组织免疫组化加以验证。99m Tc-Smac的合成以及性质鉴定1合成Smac多肽融合了细胞穿透序列的Smac 6肽AVPIAQRQIKIWFQNRRMKWKK（Smac A），对照肽为Smac N端6肽反向排列QAIPVA- RQIKIWFQNRRMKWKK（Smac B）；以及不含穿透序列的Smac6肽AVPIAQ（Smac C），可交于公司合成。2合成NHS-MAG3, 偶联Smac多肽 参照Hnatowich 提供方法（Nucl Med Biol. 1997）合成NHS-MAG3, 溶于无水二甲基甲酰胺，将Smac多肽分别溶于HEPES缓冲液（pH8.0），

25、边振荡边逐滴加入NHS-MAG3溶液，使NHS-MAG3和Smac的摩尔比为10201，采用不同的连接时间进行偶联，用活化的Sep-Pak C18反相柱纯化Smac-MAG3,甲醇或醋酸胺溶液洗脱，紫外分光光度计测260nm的吸光度，合并峰管，即为目的标记物，分装、冷冻干燥，-20保存。 3 放射性标记 将Smac-MAG3溶于醋酸胺溶液，用新鲜配制的0.5M酒石酸钠溶液调节pH值至7.6,使酒石酸钠最终浓度为67g/l。依次加入99mTcO4- 新鲜淋洗液74MBq和新鲜配制的1g/l氯化亚锡溶液，混匀后在室温下反应15min，依上述方法分离纯化。通过HPLC方法测定标记率。纸层析测定放射化

26、学纯度。4 99m Tc-Smac稳定性检测室温下将99m Tc-Smac洗脱液分别放置1h，2h，4h, 纸层析测定其放化纯; 将99m Tc-Smac加入2 倍体积新鲜人血清中, 37 分别孵育1h，2h，4h, 进行纸层析, 测定其放化纯。5 99m Tc-Smac 兔血浆蛋白结合实验新鲜兔血浆中分别加入37 74 kBq 99m Tc-Smac A,B,C, 37 孵育1.5h,三氯醋酸沉淀法测定血浆蛋白结合率。 99m Tc-Smac体外细胞实验1细胞摄取6 孔板接种肺癌A549细胞，前列腺癌LNCap，PC-3，DU145细胞，恶性黑色素瘤A375，A875，SK，M14细胞,子宫

27、颈癌Hela细胞,脐静脉内皮细HUVEC304细胞，常规培养24h 后吸弃培养基,每3 孔为1 组,分别加入含74 kBq 99m Tc-Smac A,B,C的无血清培养基2ml ,37 继续孵育10,20,40,60 和120min，收集、清洗细胞,分别测定细胞及清洗液中的放射性,计算摄取率= 细胞中放射性计数/(细胞中放射性计数+ 清洗液中放射性计数) 100 %。2表面等离子体共振技术测定标记物与IAP蛋白结合的Kd值利用RT-PCR法,从恶性黑色素肿瘤细胞A375，,扩增XIAP, Survivin, Livin cDNA的编码序列,克隆至pMD-T载体, DNA序列测定后再克隆到原核

28、表达载体pGEX-2T中,转化感受态大肠杆菌BL21后经IPTG诱导表达获得包涵体融合蛋白,并经Western印迹鉴定。通过超生雾化将80%的1,2-二油酰-sn-丙三氧基-3-磷酸-L-丝氨酸(DOPS),19%的1,2-二油酰-sn-丙三氧基-3-磷酸胆碱(DOPC)制成单层小囊泡（SUV）。SUV的结合通过表面共振仪测定。将SA芯片安装在仪器上，以5-l/分的流速将SUV均匀铺在SA上以形成磷脂膜模型。当膜表面的共振单位达到2000以上并稳定以后，磷脂膜模型即做好。将未标记的MAG3-Smac A,B,C和99m Tc标记Smac A,B,C的用HEPES-P缓冲液（0.1M的HEPES

29、,0.15MNaCl,0.005%的P20）以及5mM的CaCl2稀释成不同的浓度，然后将50l的蛋白注射到膜表面（固定相），随即用250l的缓冲液洗脱（解离相）。测量SPR角的变化监测蛋白与多肽分子间相互作用。由SPR曲线可获得哪些分子发生了相互作用,相互作用的强度,结合和解离的速度,样品中分析物浓度,是否存在异构效应,结合位点分析,复合物中不同成分对结合的影响等。 99m Tc-Smac动物体内显像的研究1动物模型的建立将1106 的人恶性黑色素细胞A375和前列腺癌DU145细胞接种于裸鼠的双侧后腿皮下。肿瘤长到直径为5-7mm大小后进行裸鼠体内分布和显像的研究。2动物体内生物学分布 尾

30、静脉注射4mg/kg的99m Tc-Smac后于不同时间将小鼠杀死，分别取出脑、心、肺、肝、肾、脾、胃、小肠、肌肉、肿瘤组织、尿、大便等，分别称重，记录60s放射性计数，计算每克组织的放射性强度，得出各器官的时间放射性曲线。3血液半清除速率 尾静脉注射4mg/kg的99m Tc-Smac 后，分别于不同时间取血，经稀释后测定放射性计数。画出时间放射性曲线，计算半清除时间。4动物体内显像 SPECT显像 尾静脉注射4mg/kg的99m Tc-Smac，注射前（本底）及注射后0，0.3，1，2，4，6，12，24小时,采集图像，窗宽15%，能量140KeV，采集像素为128128。通过注射显像剂后

31、不同时间显像结果分析，确定最佳显像时间。框画ROI，分别计算每个ROI的放射性计数。 评价肿瘤放化疗的疗效将荷恶性黑色素瘤的裸鼠用2Gy/次，共7次，3周后显像，分别比较放射治疗的肿瘤与未放射治疗肿瘤内放射性强度的差异。将荷前列腺癌LNCap、DU145的裸鼠用康士得（非甾体类的雄激素受体拮抗剂，其中LNCap为激素治疗敏感性，而DU145为激素非依赖）1mg/kg/d,治疗46周后显像，比较激素治疗前后放射性强度的差异，评价肿瘤治疗的疗效。 组织学染色显像后，将每只小鼠的脑、心、肺、肝、肾、脾、胃、小肠、肌肉、肿瘤组织取出，固定，石蜡包埋，做成组织芯片，XIAP，Survivin，Livin

32、免疫组化染色。对各组织染色阳性细胞数与体内相应组织摄取显像剂强度的相关性分析。 数据分析 采用SPSS统计分析软件分析数据。两组均数的比较用t 检验，多组间的比较用方差分析, 两两比较用LSD 法，相关性分析采用线性相关与回归法；P0.05有统计学意义 可行性分析1 课题思路是申请者对凋亡及其凋亡相关家族进行细致深入学习和研究，参阅了大量文献，并结合自己核医学专业优势提出的。Smac49肽均被证实可以和凋亡抑制蛋白中的XIAP，Survivin，Livin结合，而这些凋亡抑制蛋白又在大多数肿瘤中高表达，因此利用Smac多肽作为标记对象对肿瘤进行显像，具有很好的立论基础。加之多肽具有组织渗透迅速

33、、血液中清除快、免疫原性低、合成方便以及核素标记方法成熟的特性，技术上具有较高的可行性。 课题组成员均是具有丰富研究经验的研究者，课题组所在研究机构具有较好的研究条件与完善的研究设备，为研究工作提供了坚实的硬件基础。特色与创新 基于Smac多肽能与肿瘤中高表达的凋亡抑制蛋白结合的特性，首次提出对Smac多肽标记，针对凋亡相关家族进行肿瘤显像。不仅可以反复多次显像，还可量化凋亡抑制蛋白表达水平，评估疗效，提示预后。该方法的建立可扩展肿瘤核素显像方法，并可继续深入研究，进行肿瘤靶向治疗，因此有很好的研究前景。年度研究计划2007.1-2007.6 合成99m Tc-Smac A，B，C及其标记物放

34、化性质测定2007.6-2007.12 大肠杆菌克隆XIAP，Survivin，Livin，表面等离子体共振技术测定标记物与IAP蛋白结合的Kd值2008.1-2008.3 蛋白99m Tc-Smac A，B，C肿瘤细胞摄取2008.4-2008.12 测定99m Tc-Smac A，B，C在动物体内的生物学分布、血液清除、体内代谢。动物体内显像，研究肿瘤的最佳显像时间2009.1-2009.5 评价肿瘤治疗后的疗效2009.6-2009.12 数据处理及论文撰写与发表预期研究结果利用99m Tc标记Smac穿透肽，实现肿瘤显像，量化凋亡抑制蛋白表达水平，评估疗效，提示预后。通过理论探索和技术

35、研究，使之可达到下一步开展临床应用研究的目的。显像方法可申请技术发明专利，被开发为临床应用产品。通过省部级鉴定，申请科技成果奖。在SCI收录杂志发表论文23篇，研究结果在国际、国内会议上交流。二研究基础与工作条件工作基础 本课题申请者在博士期间承担国家自然基金课题NIS和TPO基因转染肿瘤细胞介导131I靶向治疗的研究工作，具有扎实的核医学实验基础,并熟练掌握分子生物学相关技术，发表相关论文3篇 ，并参加了第八届亚太核医学和生物学大会，口头交流该课题研究结果。在前期的工作中，参加了实验室对神经系统、泌尿系统和恶性黑色素肿瘤中Caspase和IAP家族等凋亡调控蛋白的表达模式和水平及生物学意义研

36、究的工作，并独立承担构建重组人Smac基因的腺病毒载体，在恶性黑色素瘤、前列腺癌细胞株中进行生物学行为的研究，因此对凋亡信号转导机制与肿瘤发生有较深入的理解和研究。本课题申请人和研究小组成员熟悉课题相关的学术前沿和动态，具有丰富的研究工作经验和研究技术。工作条件已具备的实验条件SPECT 2台Beckman HPLC 1台超速低温离心机 1台Icon核医学专业计算机 2台超净工作台 1台质谱仪 1台表面共振仪 1台超低温冰箱 1台生物摇床 1台CO2 孵箱 1台LKB-自动层析分离仪 1台Beckman 纯水仪 1台PCR仪 1台-80超低温冰箱 1台紫外分光光度仪 1台、自动色层扫描仪 1台

37、紫外可见自动扫描分光光度计 1台登记序号： 项目编号：中医药、中西医结合科研项目课题设计书课题名称：痛痹颗粒对骨关节炎细胞凋亡和增殖的机理研究申报单位： 江苏省中医院课题负责人： 朱萱萱计划年限：邮政编码： 210029 联系电话： 8661714130306申报日期：江苏省中医药局制填写提纲一、立项依据：与选题直接相关的国内外现状、水平和发展趋势；选题的理论和实践依据；研究目的、意义；本研究达到的科学技术水平，预期社会经济效益和应用推广前景。二、科研假说或技术构思，主要研究内容、关键技术、目标（达到的主要技术指标或技术经济指标），技术特征及创新之处，开发项目应说明开发规模。三、研究试验方法及

38、技术路线（工艺路线）。四、现有工作条件和基础：开展本项研究的技术优势，现有的主要仪器设备及应用合格实验动物的基本条件等；已有工作基础，预试验情况。五、计划进度：根据总的研究期限、年度计划进度，分别列出具体的目标和进度的考核指标。六、参加（协作）单位意见及具体分工（附协议书）。七、经费概算（包括其他部门的拨款、贷款、自筹记忆取得的自主）和核算依据，以及分年度使用计划。填写说明一、内容填写自备附页，用纸大小和封页一致，字迹清楚，装订整齐后按申报要求上报。二、填写提纲所列内容，要全面详细、如实填写。三、封面上“登记序号”“项目编号”请勿填写。1、 立项依据1.1 研究目的、意义骨关节炎（osteoa

39、rthritis，OA）又称退行性关节病，以关节软骨发生弥漫性龟裂、纤维化和脱失及因骨组织增生性变化为特征的一组临床征候群，是多见于中年以后的慢性进行性关节疾患。该病发病率随年龄增长而升高，据调查，在美国目前2亿多人口中，就有骨关节炎4500万，发病率占总人口的20%，在老年人中所占比例更高，50岁以上人群中，OA的患病率仅次于心血管疾病，位居第二位。在我国，根据流行病学调查显示，5564岁的人群中发病率达40%，而65岁以上人群的患病率达60%90%。随着计划生育政策的长久实施及经济发展，我国已进入老龄化社会，OA的发病率还将越来越高，这不仅严重危害人民的生活、健康，对社会也将造成很大负担。

40、同时世界其他国家也面临着同样的问题，因而OA引起了国际、国内医学界的相当重视。近年来对OA的研究颇多，在发病机制、检测手段以及治疗方法上均取得较大进步，但总的来说还缺乏令人满意的突破性进展。西药治疗OA的主要手段是非甾体药，但存在副作用大、作用单一及有较多禁忌症等缺点。虽然中药治疗OA也取得了一些经验，但对其具体的作用机制有深入研究的却很少，因此在中医理论的指导下，运用现代科学技术，对疗效确切的中药复方进行深入的机理研究，使中药治疗OA的疗效在国际先进行列中占一席之地，是摆在我们面前非常重要的课题。1.2 国内外现状水平和发展趋势近十年来，国内外对OA进行了较深入地研究，大致归纳如下：1.2.

41、1 流行病学研究已广泛开展在近100种不同类型的关节疾病中，OA是影响人类健康最常见的关节疾患之一，没有明显的种族和地域差异，本病的患病率随年龄增加而增高，故随着人类平均寿命的延长，患病率也有增高的趋势。Felson等报道70岁以下人群膝OA患病率为7%（男6.4%，女11.4%），80岁以上为11.2%（男5.4%，女15.8%）；而放射学膝OA70岁以上为27.4%（男30.4%，女25.1%），80岁以上为43.7%。Butter等报道，44岁以下、4559岁、60岁以上人群中，放射血OA 患病率各为6.2%、21.6%和42.0%。国内陈顺乐等队13541名钢铁工人的调查结果显示，症状

42、性OA患病率2.2%；无症状性OA患病率53%，其中3039、4049、5059岁患病率各为11%、27%和62%。汕头大学医学院统计551例，结果40岁以下、4049、5059和60岁以上各占12.2%、17.4%、26.1%和44.3%。另外不同关节OA易感性不同。美国在卫生统计中心调查结果，OA患病率以手最高，以下依次为足、膝、髋。国内陈顺乐等调查结果OA是颈椎最多，以下依次为腰椎、膝、手和腕。本病性别差异在脊柱差别不大，但手、膝、髋OA均以女性较多，且女性骨关节炎的遗传易感性较男性高。在Framingham的研究中，Felaon等发现女性体重减少11磅，骨关节炎形成的风险相应减少50%

43、。 Saase等调查结果，膝OA患病率男、女峰值分别为24.7%和54.6%。根据1994年统计，在美国，骨关节炎的消耗为155亿美元，约为类风湿关节炎的3倍，其中一半以上消耗缘于工作丧失。在我国虽未作全国大范围的普查，但随着老龄化社会进程的不断加快，OA的发病率会越来越高，这必将给家庭、社会带来沉重负担。1.2.2 病因、发病机制有了巨大突破目前基础研究认为软骨的损伤与退变是OA的根本，随着分子生物学免疫学的发展，近年来众多学者对OA关节软骨退行性改变的原因从不同角度进行了大量研究，其发病机制仍未完全明了，又提出了许多学说，如软骨下骨内高压学说：由于骨血液动力学的改变，在骨髓腔容积不变的前提

44、下增加内容物引起压力增高，即表现为骨内压力增高。骨内高压持续增高存在下关节滑液pH值下降，成分改变，干扰并破坏了软骨细胞的正常代谢导致细胞变性坏死，胶原纤维解聚，蛋白多糖分解，软骨下骨破坏、修复，最终产生骨性关节炎。自由基学说：认为自由基对软骨细胞DNA和PG的合成具有抑制作用。自由基作用软骨细胞后，引发膜脂质过氧化，使脂质过氧化代谢产物丙二醛增多，丙二醛可与DNA发生交联，自由基也可直接攻击软骨细胞DNA即合成DNA所需的酶，使DNA链断裂、碱基损伤从而影响了DNA的合成，也造成前列腺（PG）合成障碍。骨关节炎时，滑膜、滑液、血管翳内常有中性白细胞、巨嗜细胞浸润，其表面受免疫复合物、补体等作

45、用能释放大量O2-和H2O2；细胞因子学说：细胞因子对骨关节炎的发生、发展起了重要作用，如白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子（TNF）等在OA中水平明显增高。IL-1具有刺激软骨细胞分泌一氧化氮、前列腺E和IL-6的作用，引起滑膜炎症和疼痛，同时IL-1也是软骨基质降解的主要驱动因子；软骨酶降解学说：OA软骨细胞的基质降解酶类的合成与分泌率明显增加，并与关节炎的严重程度密切相关。参与降解基质大分子的降解酶类可以增加达到几倍。酸性和中性蛋白酶可以降解蛋白多糖的核心蛋白。基质金属蛋白酶，尤其是基质溶素和胶原酶，参与关节软骨的降解过程，这些酶类可以降解细胞外基质的所

46、有成分，与循环系统中的纤维蛋白溶酶和局部合成的纤溶酶原一起，快速降解软骨。在滑膜细胞和软骨细胞产生的IL-1和TNF的作用下，软骨细胞以酶原的形式分泌大量的基质金属蛋白酶，而对金属蛋白酶组织抑制剂无影响，使二者失衡从而增加对软骨主要成分型胶原和蛋白聚糖合成的抑制作用，使软骨进行性破坏；一氧化氮学说：NO是一种细胞间信使分子，可介导许多生物学现象。NOS可催化重要炎性介质NO的产生，OA患者血清、滑液中NO含量明显高于正常。NO可通过抑制软骨细胞增殖，促进软骨细胞凋亡，改变蛋白多糖和胶原蛋白的合成与分泌功能，同时使软骨细胞分泌透明质酸减少，滑膜粘蛋白解聚，抑制软骨细胞合成软骨基质，促进软骨细胞糖

47、酵解，使软骨破坏。细胞凋亡学说：细胞凋亡是细胞死亡的形式之一，许多正常组织均可发现凋亡，但凋亡亢进与不足则会引起相关疾病，在骨关节炎患者软骨中软骨细胞的凋亡有异常表现，且凋亡细胞数目与骨关节炎严重程度明显相关。凋亡小体存在于软骨细胞小孔或间隙内，其产生的焦磷酸盐能从溶液中沉积钙，有NTPPH（nucleosid triphosphate pyrophos phohydrolase）和碱性磷酸酶作用,造成余下软骨细胞修复过程失败，而逐渐发展成关节软骨的完全丢失。OA软骨细胞凋亡主要通过两种相互独立的途径完成，一种是同滑膜炎症无关的途径,由NO介导;另一种是同滑膜炎症相关的途径,由Fas介导。典型

48、的OA不存在明显的炎症反应,此时软骨细胞凋亡以NO途径为主;当产生炎症反应时,则通过as途径加剧软骨细胞凋亡和关节破坏。NO通过两种方式造成组织及细胞损伤。一是高浓度的NO能抑制多种与线粒体呼吸传递系统及柠檬酸循环有关的酶,从而抑制线粒体呼吸,造成组织损伤;二是NO与超氧化阴离子2-反应,生成氧化亚硝基阴离子ONOO-,在酸性条件下(如病理条件)迅速分解为OH-和NO2自由基,这两种自由基具有很强的细胞毒性,可造成组织细胞损伤。在OA患者中,受损区软骨细胞的凋亡比例明显高于未受损区。Fas表达的结果与其相符,OA受损区的Fas表达远高于未受损区,提示Fas表达可诱导软骨细胞凋亡。除NO途径和F

49、as途径外,还有一些因素可导致软骨细胞凋亡、关节破坏,如IL-1、IL-8、TNF-、PGE2、Aggrecan G1区等。1.2.3 治疗方面有了不少新方法目前中西医治疗OA的药物较多，西药治疗OA主要有三大类，第一类为快作用药，即非甾体药，特点是发挥作用快，但副作用较大，对胃肠、肝肾、血小板均有较大影响，OA多为老年人，长期服用此类药尤其不能耐受，且部分药物价格不菲，而且由于过分的镇痛，导致病人失去警惕过分运动，以致出现“消炎痛髋”，从长期疗效来看反而不佳，最新观点认为乙酰氨基酚应作为治疗OA的首选药，但尚有一定争议，且同样存在上述副作用；第二类为慢作用药，发挥作用慢，疗效不确切，价格昂贵

50、，临床上尚未广泛运用；第三类为软骨保护剂，尚未问世。关节清理术、膝关节置换术，适应症较少，费用高，创伤大，病人难以接受。中哦药治疗OA的研究取得了可喜的进步，但中药治疗仍存在较多共性的问题：多属临床经验，无对照组，特别是西药对照组观察，处方不固定。缺乏用客观的最新的国际公认的、量化的临床观察指标及疗效判断标准为手段来寻找治疗OA的中药。未针对OA发病机制进行临床及动物试验从生化、免疫、病理、细胞分子水平来探讨中药的药物作用机理。缺乏高效的、作用综合、副作用小的新药。中医认为OA属痹症中的痹、痛痹、骨痹，认为其病因与年老体衰、长期劳损、外感风寒湿邪有关，明确指出肝肾亏虚、气血不足、筋骨失养为OA

51、的发病基础，而寒湿、痰瘀为病理因素及病理产物。周尊谦等人在传统中医理论基础上，阐述了膝OA骨内高压血瘀证氧自由基之间的密切关系；谢林等论述了膝OA与血瘀证之间的内在联系，旨在为运用活血化淤药治疗OA提供理论依据。治疗方面从古到今绝大部分医家皆针对其病因病机采用益肝肾、强筋骨、补气血治其本；散寒通络、化痰胜湿治其标。独活寄生汤是用于治疗风寒湿痹、关节疼痛和脑血管后遗症的传统固防，具有补肝肾、活血通络之功，临床常见本方加减治疗OA，疗效比较肯定。朱健儿以本方加味治疗262例，总有效率94.7%。单文龙等用本方加减治疗骨关节炎24例，有效率为87.5%。陆智报道用本方加减治疗104例，总有效率91.

52、3%。1.2.4 实验研究方面有了较大的进展随着对OA发病机理的不断深入认识，对OA的实验研究方面也开始了向多层次多角度的方向发展。动物实验不再只局限于微循环和一般抗炎、镇痛试验，现已使用针对OA的动物实验，并采用相关的指标进行检测。目前实验研究内容主要有以下几个方面，研究最多的是OA的血液流变学、氧自由基及一氧化氮含量等，这些试验一般均可通过建立骨关节炎的模型来完成，也可通过使用其它相似的模型检测相关指标来进行，如可建立急性血淤模型来检查血液流变学指标，使用老龄动物通过检测体内SOD及MDA含量推断药物的抗氧自由基的能力等。在NO对OA影响的实验中，一般采用硝酸还原酶法来测定NO含量，运用P

53、T-PCR技术测定NOS基因表达。IL-1、IL-6、TNF等细胞因子、软骨降解酶尤其是基质金属蛋白酶、诱导关节滑膜炎症的物质如纤溶酶原/纤溶酶原激活物和前列腺素PGE2、软骨细胞的细胞凋亡及增殖情况、性激素水平等也越来越多地被作为检测指标使用到实验研究中来。1.3 选题的理论和实践依据祖国医学并无骨关节炎的病名，从历代文献来看本病应归属于“骨痹”、“痛痹”范畴。我们认为OA病人除了肝肾亏虚，寒湿痹阻外，一般OA病人体重超重较多，也即为痰湿偏盛之体，另外脾虚生湿及寒湿痹阻日久湿聚成痰，痰淤交阻是引起膝关节肿胀畸形、活动受限的重要因素，所谓顽症怪病皆质之于痰淤。基于现代医学对OA发病机理的深入研

54、究，我们在补益肝肾、活血通络基础上，结合中药对缓解软骨降解，增加软骨细胞功能，抑制滑膜增生及炎症的研究成果，于1995年即对备急千金要方中的独活寄生汤进行化裁，重用活血化淤，加用化痰清热之品，总结制定出了高效、药源广泛、安全可行的痛痹颗粒，并于1999年采用痛痹颗粒的组方治疗膝OA，方中以独活为君药，以祛下焦与筋骨间风寒湿邪；威灵仙舒筋通络止痹痛；淫羊藿、怀牛膝补肝肾，强筋骨，通经络，其中怀牛膝为引经药；当归养血柔肝、舒筋活血；川芎则通达四肢关节，为血中气药；虎杖活血清热解毒，同时防诸药辛燥太过。诸药合用共起补肝肾、祛风湿、化瘀痰之功，冀能消炎止痛，保护软骨。通过36例的临床研究、观察，结果表

55、明本方疗效显著且副作用小。因此有必要对痛痹颗粒治疗骨性关节炎的作用机制尤其是该方对软骨细胞的细胞凋亡与增殖机理做进一步的研究，冀能证实痛痹颗粒的临床疗效，明确其作用机制，并初步探讨本病发病的可能机理，为新药问世提供客观的依据，所以进行设计并立题。1.4本研究达到的科学技术水平，预期社会效益和应用推广前景1.4.1继承和发扬祖国医学，保持中医特色，以临床疗效为前提，以实验研究为基础，制造规范化大鼠的膝OA模型，从发病机理探讨本药的作用机制。本实验采用可靠地国际公认的方法复制动物模型，并采用最新的检测指标IL-1、TNF、SOD、MDA、NO等，总之本研究基于现代医学对OA发病机制的最新研究成果，

56、从生化、免疫等多个角度多个层次，系统观察并进行归纳总结，确保本课题不但可行而且先进，冀能填补省内外运用中药治疗OA的空白，并希望以此为基础，进一步从细胞水平（包括本药对软骨细胞及细胞凋亡与增殖的影响）研究中药对OA的长久作用及影响，从而达到挤身国际先进水平的目的，让中药真正走向世界。1.4.2目前，中药治疗OA的方法颇多，但大多以临床疗效研究为主，大样本、规范化的研究很少，中医中药治疗机理的研究，虽有涉及，但大多分散且存在一定的重复性，理想的治疗药物尚未问世，具有公认疗效的小儿迁延性腹泻临床治疗方案尚未确立，其疗效评价体系尚需研究确定，尤其是缺少中医药治疗学整体研究思路与方法，使中药复方治疗O

57、A的疗效机理尚未能全面揭示，影响了该领域研究的深入。而痛痹颗粒是在中医理论指导下选用千金要方中独活寄生汤进行加减所得，并采用可靠的实验模型及最新的国际公认的相关指标进行实验研究，观察其对OA的确切疗效及作用机理，这必将对OA的中医理论产生较大影响，同时对临床治疗也起到更好的指导作用，从而产生较好的社会经济效益。随着改革开放的形势发展，以及中国加入WTO与国际接轨的进程的不断完善，祖国医学国际地位不断的提高，我们将从祖国医学宝库中发掘出的治疗OA的高效药物与现代新技术、新方法进行研究总结，从而为人类造福，为振兴中医事业做出应有的贡献。2.科研假说或技术构想：主要内容、技术关键目的，技术特征及创新

58、之处，开发项目应说明开发规模。2.1主要内容2.1.1探讨OA的病因病机，提出新见解，发展中医理论。2.1.2运用现代科学技术，开展实验研究，从分子生物学、免疫学、生理生化学等多方面来探讨“痛痹颗粒”治疗膝OA的疗效机制及药理毒理作用。2.2主要技术关键2.2.1膝OA模型的复制目前所使用的OA动物模型一般可分为两大类，其一是诱发模型，即通过各种操作方法如制动、手术、关节内注药、关节内植入软骨碎片或微粒等诱导OA产生；另一类为自发模型，即不用任何外界干预，动物自发OA，如C57黑鼠等。在选择动物模型时一般应考虑动物的种属（包括其生活习性、关节结构、组织学及病理学特征）、不同方法的造模机制和OA

59、模型的特点，并应参照研究目的加以选择。在诱发模型中，常用的方法是手术造成关节的应力改变及关节腔内注入木瓜蛋白酶， 这两种方法都能复制出较成功较高的OA模型，且操作较为简单。具体的造模机制在于低应力可以造成软骨厚度减少，SO染色变淡，水分增加，蛋白聚糖聚集度损伤等变化，木瓜蛋白酶作为一种蛋白水解酶会引起关节软骨的退行性改变。在具体的造模过程中我们选用以上两种方法来分别复制动物模型。用于动物模型的动物一般有狗、兔、鼠等，我们选用大鼠做OA模型，因为该模型关节软骨退变的组织学特征与人类相似，且动物来源较广泛，且经济。2.2.2关节软骨细胞的获取和培养基于来源广泛，操作可行的原则，目前用于体外培养的软

60、骨细胞一般均为兔关节软骨细胞原代培养所得。软骨需在严格无菌的条件下分离，经过一系列的漂洗、消化等工作后获取软骨细胞。目前还没有专门用于软骨细胞培养的培养液，国外采用的培养液种类繁多，有199、1640、F12、改良Eagle等，国内的有199、1640、DMEM（高糖）等，其中加入胎牛血清（占15%），一般以使用DMEM培养液居多。在培养液中还含有一些辅助添加剂，包括25mmol/L Hepes、1mmol/L 丙酮酸钠、2mmol/L 谷氨酰胺、50umol/L 二硫基乙醇以及10万单位/L的青霉素和10万单位/L的链霉素，PH7.4。培养过程中一般使用5%CO237的恒温培养箱。2.2.3

61、采用的检测手段及指标在病理组织形态学的检查中，一般采用以下几个观察指标：大体肉眼观察软骨及滑膜表面情况；HE染色观察有关的形态变化；Masson三色染色观察胶原的变化；Sanfranin-O即沙红O染色用于组织学评分，评分方法按Mankin法；电镜下观察软骨细胞内结构形态变化及其周围胶原纤维的变化。在细胞培养的相关检测中，我们采用MTT法检测软骨细胞的增殖能力，用全自动生化分析仪对检测总蛋白含量，使用细胞流式仪进行细胞凋亡的测定，对iNOS、NO含量的测定则使用分型NOS试剂盒和NO试剂盒。2.3目标（达到的主要技术指标或技术经济指标）、技术特征及创新之处。现代科学技术与中医药理论相结合，深入

62、研究中医药治疗OA的作用机制，为临床应用提供更加科学有利的客观依据，发挥中医药治疗OA的特色和优势，为临床常见、严重影响人类健康的OA研究出有效、安全、便于推广应用的中医药治疗方法，使能迅速缓解症状，大大减轻病人痛苦，降低膝骨关节炎的致残率和复发率，且副作用小的简、便、廉、验的中药制剂问世。治疗膝OA的新药生产及对其在治疗中所起作用机制的深入探讨，既符合国情又能够走向世界，产生较大的社会和经济效益，这必然形成高新技术产业进入高新领域，对促进科技进步，发展中医药，有着积极的作用，同时这也是中药现代化研究的发展方向和新的探索。3.实验研究方法及技术路线。3.1对实验性大鼠骨性关节炎的防治作用 OA模型的制备：（1）取SD雄性大鼠50只，体重200220g，固定，常规备皮消毒，沿髌韧带内侧缘切口，切断双后肢内侧副韧带及膝前内侧筋膜扩张部，并在断端处修剪去除约2mm，造成双后肢膝外翻畸形。术后第二天放造模大鼠于拖箱内每天赶其行走30m。（2）取SD雄性大鼠50只，体重200220g，4%木瓜蛋白酶溶液与0.03mol/L半胱氨酸溶液1：1混置0.5小时后，分别在第1、3、5、7天于实验大鼠膝关节腔内注入混合液20ul。方法：将造模后的大鼠随机分为模型组、阳性对照组（维骨力组）、治疗组，另设正常对照组，分别灌胃给药或蒸馏水，连续7周。七周后将动物麻醉后，立即将大鼠以仰卧位固定，颈总