内参基因的选择及数据初步分析
《内参基因的选择及数据初步分析》由会员分享,可在线阅读,更多相关《内参基因的选择及数据初步分析(37页珍藏版)》请在装配图网上搜索。
1、qRT-PCR内参基因的评价及数据分析 主要内容 内参基因的评价 qRT-PCR的引物设计及评价 qRT-PCR的数据分析 内 参 基 因 具 备 的 条 件内 参 基 因 的 评 价表 达 量 要 稳 定 ;表 达 丰 度 为 中 度 或 高 度 , 避 免 低 度 ;表 达 的 丰 度 与 目 标 基 因 接 近 ; http:/ 内 参 基 因 再 评 价 的 必 要 性内 参 基 因 的 评 价传 统 内 参 基 因 主 要 用 在 RT-PCR;评 价 的 条 件 有 限 ;大 量 芯 片 数 据 的 出 现 为 内 参 基 因 的 评 价 提 供 了 很 好 的 条 件 。 htt
2、p:/ AtCBP20 AtUBC AtACT2 ( https:/ ) 三 个 内 参 基 因 在 组 织 中 的 表 达 AtCBP20 AtUBC AtACT2三 个 内 参 基 因 在 多 数 实 验 条 件 下 表 达 稳 定 ( https:/ ) AtCBP20 AtUBC AtACT2 ( https:/ ) 三 个 内 参 基 因 在 某 些 特 定 的 实 验 条 件 下 表 达 并 不 稳 定 内 参 基 因 获 得 的 途 径内 参 基 因 的 评 价常 规 的 内 参 基 因 : ACT, TUB, UBQ, 18S-rRNA, GAPDH等 。芯 片 数 据 :Ar
3、abidopsis Genevestigator http:/www.genevestigator.ethz.ch/Generic Gene Expression Omnibus http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geoBarley Barleybase http:/www.barleybase.orgMaize Zeamage http:/www.maizearray.org Rice Rice Expression Database http:/red.dna.affrc.go.jp/REDRice NSF Rice Oligonucleotide A
4、rray Project and Database http:/www.ricearray.orgRice Virtual Center for Cellular Expression Profiling in Rice http:/130.132.8.83/rcSolanaceae Solanaceae Gene Expression Database http:/www.tigr.org/tdb/potatoSoybean Soybean Genomics and Microarray Database http:/psi081.ba.ars.usda.gov/SGMD/default.h
5、tmTomato Tomato Expression Database http:/ted.bti.cornell.edu 多 内 参 基 因 内 参 基 因 的 评 价内 参 基 因 有 其 适 合 应 用 的 实 验 条 件 常 用 的 软 件geNorm ( http:/medgen.ugent.be/jvdesomp/genorm/)NormFinder (http:/www.mdl.dk/publicationsnormfinder.htm) 1.确 定 候 选 内 参 基 因实 例 分 析 内 参 基 因 的 评 价Gene A.Locus G.Locus G.NCBI ID Un
6、igene IDACT11 AT3G12110 Glyma18g52780 BW652479 Gma.32186ACT2/7 AT5G09810 Glyma04g39380 BW677100 Gma.30938CYP AT2G21130 Glyma12g02790 CF806591 Gma.31618EF1b AT5G12110 Glyma02g44460 EV279336 Gma.2137TUA5 AT5G19780 Glyma05g29000 CA801144 Gma.13580TUB4 AT5G12250 Glyma03g27970 EV263740 Gma.31016UBQ10 AT4
7、G05320 Glyma07g32020 EH258122 Gma.17451HDC AT1G58050 Glyma08g05480 CK768960 Gma.34482SKIP16 AT1G06110 Glyma12g05510 CD397253 Gma.6079MTP AT2G41790 Glyma03g29350 CF808703 Gma.7635PEPKR1 AT1G12580 Glyma10g38460 AW396185 Gma.23799 TIP41 At4G34270 Glyma20g26690 EV263725 Gma.10647UKN1 AT3G13410 Glyma12g0
8、2310 BU578186 Gma.32694UKN2 AT4G33380 Glyma06g04180 BE330043 Gma.20882Ruibo Hu, et al., BMC Molecular Biology, 2009, 10(1) 1.确 定 候 选 内 参 基 因实 例 分 析 内 参 基 因 的 评 价 1.确 定 候 选 内 参 基 因实 例 分 析 内 参 基 因 的 评 价不 同 的 实 验 条 件 下 1.确 定 候 选 内 参 基 因实 例 分 析 内 参 基 因 的 评 价不 同 组 织 器 官 中 1.确 定 候 选 内 参 基 因实 例 分 析 内 参 基 因
9、 的 评 价 3.引 物 的 设 计 ( 见 qRT-PCR引 物 的 设 计 )实 例 分 析 内 参 基 因 的 评 价A. 候 选 内 参 基 因 的 数 目 要 大 于 5个B. 样 本 数 大 于 10个C. 常 用 的 软 件 有 : geNorm, NormFinder, BestKeeper, qBase4. 候 选 内 参 基 因 的 稳 定 性 分 析 4. 候 选 内 参 基 因 的 稳 定 性 分 析实 例 分 析 内 参 基 因 的 评 价 Ruibo Hu, et al., BMC Molecular Biology, 2009, 10(1) 2. 候 选 内 参
10、基 因 的 稳 定 性 分 析实 例 分 析 内 参 基 因 的 评 价 Ruibo Hu, et al., BMC Molecular Biology, 2009, 10(1) M 0.15 3. 多 内 参 基 因 的 评 价 体 系 优 于 单 内 参 基 因实 例 分 析 内 参 基 因 的 评 价 Qing Li, et al., Plant Cell Report, 2012不 同 的 内 参 基 因 评 价 GmIFS2种 子 发 育 过 程 过 程 表 达 qRT-PCR 芯 片 数 据 qPCR引 物 的 要 求qPCR引 物 的 设 计 及 评 价; 基 因 家 族; 90
11、%-110% 常 用 的 软 件 实 例 分 析 qPCR引 物 的 设 计 及 评 价 大 豆 的 PHT1基 因 家 族 1. 下 载 GmPHT1家 族 成 员 的 转 录 序 列 ; 对 于 没 有 UTR区 的 , 用 softberry ( FGENESH, http:/ ) 预 测 , 并 将 其 做 成fasta格 式 的 文 件 。2. 用 Bioedit做 成 本 地 数 据 库 ;3. 序 列 比 对 分 析 ,实 例 分 析 qPCR引 物 的 设 计 及 评 价找 出 差 异 区 域 ; 实 例 分 析 qPCR引 物 的 设 计 及 评 价 4. 用 Primer5
12、.0或 其 他 软 件 , 在 差 异 区 域 设 计引 物 ;实 例 分 析 qPCR引 物 的 设 计 及 评 价每 条 引 物 最 好 跨 在 两 个 外 显 子 上 ;引 物 的 退 火 温 度 在 60 左 右 ;两 条 引 物 中 至 少 有 一 条 是 特 异 的 。5. 引 物 设 计 完 成 之 后 , 要 再 通 过 blast, 分 析引 物 的 特 异 。 6.Beacon Designer7 实 例 分 析 qPCR引 物 的 设 计 及 评 价7.PerlPrimer1.1.21 http:/ 实 例 分 析 qPCR引 物 的 设 计 及 评 价限 定 引 物 在
13、 外 显 子 上 的 位 置引 物 跨 外 显 子 的 长 度 8. 检 测 引 物 的 特 异 性 及 扩 增 效 率 ;实 例 分 析 qPCR引 物 的 设 计 及 评 价特 异 性 可 以 通 过 电 泳 检 查 , 或 通 过 qPCR的 溶 解 曲 线 来 检 测 。扩 增 效 率 :A . 通 过 梯 度 稀 释 的 方 式 来 检 测 ;B. LinRegPCR12.x 可 以 对 每 对 引 物 在 每 个 样 本 中 的 扩 增 效 率 进 行 检 测 。 8.检 测 引 物 的 特 异 性 及 扩 增 效 率实 例 分 析 qPCR引 物 的 设 计 及 评 价B1.数
14、据 的 导 出 为 Component B2. 打 开 导 出 文 件 8.检 测 引 物 的 特 异 性 及 扩 增 效 率实 例 分 析 qPCR引 物 的 设 计 及 评 价B3. 打 开 LinRegPCR 8.检 测 引 物 的 特 异 性 及 扩 增 效 率实 例 分 析 qPCR引 物 的 设 计 及 评 价B4. 得 到 扩 增 效 率 及 R值 实 例 分 析 qPCR引 物 的 设 计 及 评 价14个 GmPHT1家 族 成 员 在 开 花 期 不 同 组 织 中 的 表 达 变 化R U S F T R 根 ; U 单 叶 ; S 茎 ; F 花 ; T 复 叶 实 例
15、 分 析 qPCR引 物 的 设 计 及 评 价 主 根 根 尖 qPCR的 数 据 分 析 及 作 图 参 照 geNorm的 应 用 手 册 。 1、 多 内 参 基 因 的 数 据 分 析多 内 参 基 因 SD的 计 算多 内 参 基 因 的 标 准 化目 标 基 因 SD的 计 算 qPCR的 数 据 分 析 及 作 图2、 基 因 家 族 的 作 图A. 将 相 对 表 达 量 做 到 一 个 表 中B. 拷 贝 到 TXT文 件 中 Gensis qPCR的 数 据 分 析 及 作 图2、 Gensis分 析 数 据 及 作 图 总 结1、 根 据 自 己 的 实 验 条 件 ,
16、 对 所 选 用 的 内 参 基 因 做 稳 定 性 评 价 ;2、 评 价 内 参 基 因 时 , 要 保 证 模 板 浓 度 一 致 ;3、 在 试 验 过 程 中 , 最 好 选 用 1个 以 上 的 内 参 基 因 ;4、 选 用 内 参 基 因 的 表 达 丰 度 要 和 目 的 基 因 接 近 ;5、 引 物 设 计 时 , 保 证 引 物 的 特 异 性 、 扩 增 的 高 效 性 ;6、 在 qRT-PCR时 , 溶 解 曲 线 的 设 定 非 常 必 要 ;7、 模 板 浓 度 不 宜 稀 释 太 低 ;8、 对 PCR反 应 体 系 进 行 必 要 的 优 化 ; 敬 请 批 评 指 正敬 请 批 评 指 正
- 温馨提示:
1: 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
2: 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等,如果需要附件,请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
3.本站RAR压缩包中若带图纸,网页内容里面会有图纸预览,若没有图纸预览就没有图纸。
4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
5. 装配图网仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑,并不能对任何下载内容负责。
6. 下载文件中如有侵权或不适当内容,请与我们联系,我们立即纠正。
7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。