内参基因的选择及数据初步分析

qRT-PCR内参基因的评价及数据分析 主要内容 内参基因的评价 qRT-PCR的引物设计及评价 qRT-PCR的数据分析 内 参 基 因 具 备 的 条 件内 参 基 因 的 评 价表 达 量 要 稳 定 ；表 达 丰 度 为 中 度 或 高 度 ， 避 免 低 度 ；表 达 的 丰 度 与 目 标 基 因 接 近 ； http:/ 内 参 基 因 再 评 价 的 必 要 性内 参 基 因 的 评 价传 统 内 参 基 因 主 要 用 在 RT-PCR；评 价 的 条 件 有 限 ；大 量 芯 片 数 据 的 出 现 为 内 参 基 因 的 评 价 提 供 了 很 好 的 条 件 。 http:/ AtCBP20 AtUBC AtACT2 （ https:/ ） 三 个 内 参 基 因 在 组 织 中 的 表 达 AtCBP20 AtUBC AtACT2三 个 内 参 基 因 在 多 数 实 验 条 件 下 表 达 稳 定 （ https:/ ） AtCBP20 AtUBC AtACT2 （ https:/ ） 三 个 内 参 基 因 在 某 些 特 定 的 实 验 条 件 下 表 达 并 不 稳 定 内 参 基 因 获 得 的 途 径内 参 基 因 的 评 价常 规 的 内 参 基 因 ： ACT， TUB， UBQ， 18S-rRNA， GAPDH等 。芯 片 数 据 ：Arabidopsis Genevestigator http:/www.genevestigator.ethz.ch/Generic Gene Expression Omnibus http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geoBarley Barleybase http:/www.barleybase.orgMaize Zeamage http:/www.maizearray.org Rice Rice Expression Database http:/red.dna.affrc.go.jp/REDRice NSF Rice Oligonucleotide Array Project and Database http:/www.ricearray.orgRice Virtual Center for Cellular Expression Profiling in Rice http:/130.132.8.83/rcSolanaceae Solanaceae Gene Expression Database http:/www.tigr.org/tdb/potatoSoybean Soybean Genomics and Microarray Database http:/psi081.ba.ars.usda.gov/SGMD/default.htmTomato Tomato Expression Database http:/ted.bti.cornell.edu 多 内 参 基 因 内 参 基 因 的 评 价内 参 基 因 有 其 适 合 应 用 的 实 验 条 件 常 用 的 软 件geNorm （ http:/medgen.ugent.be/jvdesomp/genorm/）NormFinder (http:/www.mdl.dk/publicationsnormfinder.htm) 1.确 定 候 选 内 参 基 因实 例 分 析 内 参 基 因 的 评 价Gene A.Locus G.Locus G.NCBI ID Unigene IDACT11 AT3G12110 Glyma18g52780 BW652479 Gma.32186ACT2/7 AT5G09810 Glyma04g39380 BW677100 Gma.30938CYP AT2G21130 Glyma12g02790 CF806591 Gma.31618EF1b AT5G12110 Glyma02g44460 EV279336 Gma.2137TUA5 AT5G19780 Glyma05g29000 CA801144 Gma.13580TUB4 AT5G12250 Glyma03g27970 EV263740 Gma.31016UBQ10 AT4G05320 Glyma07g32020 EH258122 Gma.17451HDC AT1G58050 Glyma08g05480 CK768960 Gma.34482SKIP16 AT1G06110 Glyma12g05510 CD397253 Gma.6079MTP AT2G41790 Glyma03g29350 CF808703 Gma.7635PEPKR1 AT1G12580 Glyma10g38460 AW396185 Gma.23799 TIP41 At4G34270 Glyma20g26690 EV263725 Gma.10647UKN1 AT3G13410 Glyma12g02310 BU578186 Gma.32694UKN2 AT4G33380 Glyma06g04180 BE330043 Gma.20882Ruibo Hu， et al.， BMC Molecular Biology, 2009, 10(1) 1.确 定 候 选 内 参 基 因实 例 分 析 内 参 基 因 的 评 价 1.确 定 候 选 内 参 基 因实 例 分 析 内 参 基 因 的 评 价不 同 的 实 验 条 件 下 1.确 定 候 选 内 参 基 因实 例 分 析 内 参 基 因 的 评 价不 同 组 织 器 官 中 1.确 定 候 选 内 参 基 因实 例 分 析 内 参 基 因 的 评 价 3.引 物 的 设 计 （ 见 qRT-PCR引 物 的 设 计 ）实 例 分 析 内 参 基 因 的 评 价A. 候 选 内 参 基 因 的 数 目 要 大 于 5个B. 样 本 数 大 于 10个C. 常 用 的 软 件 有 ： geNorm, NormFinder, BestKeeper, qBase4. 候 选 内 参 基 因 的 稳 定 性 分 析 4. 候 选 内 参 基 因 的 稳 定 性 分 析实 例 分 析 内 参 基 因 的 评 价 Ruibo Hu， et al.， BMC Molecular Biology, 2009, 10(1) 2. 候 选 内 参 基 因 的 稳 定 性 分 析实 例 分 析 内 参 基 因 的 评 价 Ruibo Hu， et al.， BMC Molecular Biology, 2009, 10(1) M 0.15 3. 多 内 参 基 因 的 评 价 体 系 优 于 单 内 参 基 因实 例 分 析 内 参 基 因 的 评 价 Qing Li, et al.， Plant Cell Report， 2012不 同 的 内 参 基 因 评 价 GmIFS2种 子 发 育 过 程 过 程 表 达 qRT-PCR 芯 片 数 据 qPCR引 物 的 要 求qPCR引 物 的 设 计 及 评 价； 基 因 家 族； 90%-110% 常 用 的 软 件 实 例 分 析 qPCR引 物 的 设 计 及 评 价 大 豆 的 PHT1基 因 家 族 1. 下 载 GmPHT1家 族 成 员 的 转 录 序 列 ； 对 于 没 有 UTR区 的 ， 用 softberry （ FGENESH， http:/ ） 预 测 ， 并 将 其 做 成fasta格 式 的 文 件 。2. 用 Bioedit做 成 本 地 数 据 库 ；3. 序 列 比 对 分 析 ，实 例 分 析 qPCR引 物 的 设 计 及 评 价找 出 差 异 区 域 ； 实 例 分 析 qPCR引 物 的 设 计 及 评 价 4. 用 Primer5.0或 其 他 软 件 ， 在 差 异 区 域 设 计引 物 ；实 例 分 析 qPCR引 物 的 设 计 及 评 价每 条 引 物 最 好 跨 在 两 个 外 显 子 上 ；引 物 的 退 火 温 度 在 60 左 右 ；两 条 引 物 中 至 少 有 一 条 是 特 异 的 。5. 引 物 设 计 完 成 之 后 ， 要 再 通 过 blast， 分 析引 物 的 特 异 。 6.Beacon Designer7 实 例 分 析 qPCR引 物 的 设 计 及 评 价7.PerlPrimer1.1.21 http:/ 实 例 分 析 qPCR引 物 的 设 计 及 评 价限 定 引 物 在 外 显 子 上 的 位 置引 物 跨 外 显 子 的 长 度 8. 检 测 引 物 的 特 异 性 及 扩 增 效 率 ；实 例 分 析 qPCR引 物 的 设 计 及 评 价特 异 性 可 以 通 过 电 泳 检 查 ， 或 通 过 qPCR的 溶 解 曲 线 来 检 测 。扩 增 效 率 ：A . 通 过 梯 度 稀 释 的 方 式 来 检 测 ；B. LinRegPCR12.x 可 以 对 每 对 引 物 在 每 个 样 本 中 的 扩 增 效 率 进 行 检 测 。 8.检 测 引 物 的 特 异 性 及 扩 增 效 率实 例 分 析 qPCR引 物 的 设 计 及 评 价B1.数 据 的 导 出 为 Component B2. 打 开 导 出 文 件 8.检 测 引 物 的 特 异 性 及 扩 增 效 率实 例 分 析 qPCR引 物 的 设 计 及 评 价B3. 打 开 LinRegPCR 8.检 测 引 物 的 特 异 性 及 扩 增 效 率实 例 分 析 qPCR引 物 的 设 计 及 评 价B4. 得 到 扩 增 效 率 及 R值 实 例 分 析 qPCR引 物 的 设 计 及 评 价14个 GmPHT1家 族 成 员 在 开 花 期 不 同 组 织 中 的 表 达 变 化R U S F T R 根 ； U 单 叶 ； S 茎 ； F 花 ； T 复 叶 实 例 分 析 qPCR引 物 的 设 计 及 评 价 主 根 根 尖 qPCR的 数 据 分 析 及 作 图 参 照 geNorm的 应 用 手 册 。 1、 多 内 参 基 因 的 数 据 分 析多 内 参 基 因 SD的 计 算多 内 参 基 因 的 标 准 化目 标 基 因 SD的 计 算 qPCR的 数 据 分 析 及 作 图2、 基 因 家 族 的 作 图A. 将 相 对 表 达 量 做 到 一 个 表 中B. 拷 贝 到 TXT文 件 中 Gensis qPCR的 数 据 分 析 及 作 图2、 Gensis分 析 数 据 及 作 图 总 结1、 根 据 自 己 的 实 验 条 件 ， 对 所 选 用 的 内 参 基 因 做 稳 定 性 评 价 ；2、 评 价 内 参 基 因 时 ， 要 保 证 模 板 浓 度 一 致 ；3、 在 试 验 过 程 中 ， 最 好 选 用 1个 以 上 的 内 参 基 因 ；4、 选 用 内 参 基 因 的 表 达 丰 度 要 和 目 的 基 因 接 近 ；5、 引 物 设 计 时 ， 保 证 引 物 的 特 异 性 、 扩 增 的 高 效 性 ；6、 在 qRT-PCR时 ， 溶 解 曲 线 的 设 定 非 常 必 要 ；7、 模 板 浓 度 不 宜 稀 释 太 低 ；8、 对 PCR反 应 体 系 进 行 必 要 的 优 化 ； 敬 请 批 评 指 正敬 请 批 评 指 正