工业发酵染菌的防治l

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1、 第 七 章 染 菌 的 防 治 1、 染 菌 对 不 同 产 品 发 酵 的 影 响放 线 菌 由 于 生 长 的 最 适 pH为 7左 右 ， 染 细 菌 较 多 ； 霉 菌 生 长 pH为 5左 右 ， 因 此 染 酵 母 菌 为 多 。青 霉 素 发 酵 染 菌 ， 绝 大 多 数 杂 菌 都 能 直 接 产 生 青 霉 素 酶 ， 另 一些 杂 菌 则 可 被 青 霉 素 诱 导 而 产 生 青 霉 素 酶 。 不 论 在 发 酵 前 期 、中 期 或 后 期 ， 染 有 能 产 生 青 霉 素 酶 的 杂 菌 ， 都 能 使 青 霉 素 迅 速破 坏 。链 霉 素 、 四 环 素

2、、 红 霉 素 、 卡 那 霉 素 等 发 酵 染 菌 也 会 造 成 不 同程 度 的 危 害 。 如 杂 菌 大 量 消 耗 营 养 干 扰 生 产 菌 的 正 常 代 谢 ； 改变 pH， 降 低 产 量 。疫 苗 生 产 危 害 很 大 。 现 在 疫 苗 多 采 用 深 层 培 养 ， 有 些 疫 苗 是 不加 提 纯 而 直 接 使 用 的 产 品 ， 在 其 深 层 培 养 过 程 中 ， 一 旦 污 染 杂菌 ， 不 论 死 菌 、 活 菌 或 内 外 毒 素 ， 都 应 全 部 废 弃 。 因 此 ， 发 酵罐 容 积 越 大 ， 污 染 杂 菌 后 的 损 失 也 越 大

3、。（ 一 ） 染 菌 对 发 酵 的 影 响 2、 污 染 不 同 种 类 和 性 质 的 微 生 物 的 影 响（ 1） 污 染 噬 菌 体 噬 菌 体 的 感 染 力 很 强 ， 传 播 蔓 延 迅 速 ， 也 较 难 防 治 ， 故 危 害极 大 。 污 染 噬 菌 体 后 ， 可 使 发 酵 产 量 大 幅 度 下 降 ， 严 重 的 造成 断 种 ， 被 迫 停 产 。（ 2） 污 染 其 它 杂 菌 有 些 杂 菌 会 使 生 产 菌 自 溶 产 生 大 量 泡 沫 ， 即 使 添 加 消 泡 剂 也无 法 控 制 逃 液 ， 影 响 发 酵 过 程 的 通 气 搅 拌 。 有 的

4、 杂 菌 会 使 发 酵 液 发 臭 、 发 酸 ， 致 使 pH下 降 ， 使 不 耐 酸的 产 品 破 坏 。 特 别 是 染 芽 孢 杆 菌 ， 由 于 芽 孢 耐 热 ， 不 易 杀 死 ，往 往 一 次 染 菌 后 会 反 复 染 菌 。 v 不 同 发 酵 对 杂 菌 感 染 的 敏 感 性 不 同v (1)青 霉 素 和 链 霉 素 ： 细 短 杆 菌 的 危 害 大 ；v (2)四 环 素 ： 对 双 球 菌 、 芽 孢 杆 菌 和 荚 膜 杆菌 污 染 敏 感 ；v (3)柠 檬 酸 ： 对 青 霉 菌 敏 感 ；v (4)核 苷 酸 ： 对 芽 孢 杆 菌 敏 感v (5)

5、氨 基 酸 ： 对 噬 菌 体 敏 感 ； 3、 不 同 时 间 染 菌 对 发 酵 的 影 响 污 染 时 间 是 指 用 无 菌 检 测 方 法 确 定 的 污 染 时 间 ， 不 是 杂 菌 窜 入 培养 液 的 时 间 。（ 1） 种 子 培 养 期 染 菌 。 由 于 接 种 量 较 小 ， 生 产 菌 生 长 一 开 始 不 占 优 势 。 此 时 防 御 杂 菌 能力 低 ， 容 易 污 染 杂 菌 ， 对 发 酵 影 响 最 大 。 如 在 此 阶 段 染 菌 ， 应 将 种子 液 全 部 废 弃 。（ 2） 发 酵 前 期 染 菌 。 发 酵 前 期 最 易 染 菌 ， 且

6、危 害 极 大 。 原 因 发 酵 前 期 菌 量 不 很 多 ， 与 杂 菌 没 有 竞 争 优 势 ； 且 还 未 合 成产 物 （ 抗 生 素 ） 或 产 生 很 少 ， 抵 御 杂 菌 能 力 弱 。 措 施 可 以 用 降 低 培 养 温 度 ， 调 整 补 料 量 ， 用 酸 碱 调 pH值 ， 缩 短培 养 周 期 等 措 施 予 以 补 救 。 如 果 前 期 染 菌 ， 且 培 养 基 养 料 消 耗 不 多 ， 可 以 重 新 灭 菌 ， 补 加 一 些 营 养 ， 重 新 接 种 再 用 。 （ 3） 发 酵 中 期 染 菌 。 发 酵 中 期 染 菌 会 严 重 干 扰

7、 产 生 菌 的 代 谢 。 杂 菌 大 量 产 酸 ， 培 养液 pH下 降 ； 糖 、 氮 消 耗 快 ， 发 酵 液 发 粘 ， 菌 丝 自 溶 ， 产 物 分 泌减 少 或 停 止 ， 有 时 甚 至 会 使 已 产 生 的 产 物 分 解 。 有 时 也 会 使 发 酵液 发 臭 ， 产 生 大 量 泡 沫 。 措 施 降 温 培 养 ， 减 少 补 料 ， 密 切 注 意 代 谢 变 化 情 况 。 如 果发 酵 单 位 到 达 一 定 水 平 可 以 提 前 放 罐 ， 或 者 抗 生 素 生 产 中 可 以 将高 单 位 的 发 酵 液 输 送 一 部 分 到 染 菌 罐 ，

8、抑 制 杂 菌 。（ 4） 发 酵 后 期 染 菌 。 发 酵 后 期 发 酵 液 内 已 积 累 大 量 的 产 物 （ 如 果 是 抗 生 素 ） ， 对 杂菌 有 一 定 的 抑 制 或 杀 灭 能 力 。 因 此 如 果 染 菌 不 多 ， 对 生 产 影 响 不大 。 如 果 染 菌 严 重 ， 又 破 坏 性 较 大 ， 可 以 提 前 放 罐 。 1、 发 酵 染 菌 对 过 滤 的 影 响 染 菌 的 发 酵 液 一 般 发 粘 ， 菌 体 多 数 自 溶 ， 所 以 在 发 酵 液 过 滤 时 不 能或 很 难 形 成 滤 饼 ， 导 致 过 滤 困 难 。 由 于 过 滤

9、困 难 ， 过 滤 时 间 拉 长 ，影 响 发 酵 液 储 罐 和 过 滤 设 备 的 周 转 使 用 ， 破 坏 了 生 产 平 衡 。 染 菌 发 酵液 还 会 因 过 滤 困 难 而 大 幅 度 降 低 过 滤 收 率 ， 直 接 影 响 提 炼 总 收 率 。措 施 ： 加 热 、 冷 却 、 添 加 助 滤 剂 等2、 发 酵 染 菌 对 提 炼 的 影 响 染 菌 发 酵 液 中 含 有 比 正 常 发 酵 液 更 多 的 水 溶 性 蛋 白 和 其 它 杂 质 。 采用 沉 淀 法 ， 杂 质 污 染 产 物 。 采 用 有 机 溶 剂 萃 取 的 提 炼 工 艺 ， 则 极

10、易 发生 乳 化 ， 很 难 使 水 相 和 溶 剂 相 分 离 ， 影 响 进 一 步 提 纯 。 采 用 直 接 用 离子 交 换 树 脂 的 提 取 工 艺 ， 如 链 霉 素 、 庆 大 霉 素 ， 染 菌 后 大 量 杂 菌 黏 附在 离 子 交 换 树 脂 表 面 ， 或 被 离 子 交 换 树 脂 吸 附 ， 大 大 降 低 离 子 交 换 树脂 的 交 换 容 量 ， 而 且 有 的 杂 菌 很 难 用 水 冲 洗 干 净 ， 洗 脱 时 与 产 物 一 起 进 入 洗 脱 液 ， 影 响 进 一 步 提 纯 。 （ 二 ） 发 酵 染 菌 对 提 炼 和 产 品 质 量 的

11、影 响 2 染 菌 的 表 现种 子 ： 生 长 缓 慢 、 菌 丝 结 团 、 代 谢 异 常发 酵 ： 菌 体 生 长 差 、 pH异 常 、 溶 氧 异 常 、泡 沫 过 多 、 菌 体 浓 度 异 常 （ 一 ） 发 酵 染 菌 的 检 查 判 断n 表 观 法 ： 溶 氧 水 平 、 排 气中 CO2n 实 验 法 ： 镜 检 法 、 平 皿 划线 或 斜 面 检 查 法 、 肉 汤 培养 法二 、 染 菌 的 原 因 日 本 工 业 技 术 院 发 酵 研 究 所 多 年 来 抗 生 素 发 酵 染 菌 原 因 分 析 项 目 百 分 率 %种 子 带 菌 或 怀 疑 种 子 带

12、菌 9.64接 种 时 罐 压 跌 零 0.19培 养 基 灭 菌 不 透 0.79总 空 气 系 统 有 菌 19.96泡 沫 冒 顶 0.48夹 套 穿 孔 12.36盘 管 穿 孔 5.89接 种 管 穿 孔 0.39阀 门 渗 漏 1.45搅 拌 轴 密 封 渗 漏 2.09罐 盖 漏 1.54其 它 设 备 渗 漏 10.13操 作 原 因 10.15 原 因 不 明 24.94 （ 二 ） 染 菌 原 因 上 海 第 三 制 药 厂 染 菌 原 因 分 析 项 目 百 分 率 %种 子 带 菌 14.15盘 管 穿 孔 14.20阀 门 渗 漏 23.30空 气 系 统 有 菌 1

13、0.0管 理 不 善 25.80其 它 7.49原 因 不 明 5.78 链 霉 素 制 药 厂 发 酵 染 菌 原 因 分 析 项 目 百 分 率 %外 界 带 入 杂 菌 （ 取 样 、 补 料 ） 8.20设 备 穿 孔 7.60空 气 系 统 有 菌 26.00停 电 罐 压 跌 零 1.60接 种 11.00蒸 汽 压 力 不 足 或 蒸 汽 量 不 足 0.60管 理 问 题 7.80 操 作 违 反 规 程 1.60种 子 带 菌 0.60原 因 不 明 35.00 造 成 染 菌 的 主 要 原 因 总 结1、 设 备 渗 漏设 备 渗 漏 包 括 夹 套 穿 孔 、 盘 管

14、穿 孔 、 接 种 管 穿 孔 、 阀 门 渗 漏 、 搅 拌 轴渗 漏 、 罐 盖 漏 和 其 它 设 备 漏 等 。 日 本 工 业 技 术 院 发 酵 研 究 所 对 染 菌 原因 分 析 ， 这 类 染 菌 占 33.85 ， 上 海 三 厂 的 分 析 这 类 染 菌 为 37.5 。2、 空 气 带 菌从 日 本 工 业 技 术 院 和 上 海 第 四 制 药 厂 分 析 空 气 带 菌 而 造 成 的 染 菌 分 别为 19.96 和 26%。 国 内 外 空 气 除 菌 技 术 虽 已 有 较 大 改 善 ， 但 仍 然 没有 使 染 菌 率 降 低 到 理 想 的 程 度 。

15、 因 为 空 气 除 菌 系 统 较 为 复 杂 ， 环 节 多 ，偶 遇 不 慎 便 会 导 致 空 气 除 菌 失 败 。3、 种 子 带 菌种 子 带 菌 又 分 为 种 子 本 身 带 菌 和 种 子 培 养 过 程 中 染 菌 。 加 强 种 子 管 理 ， 严 格 无 菌 操 作 ， 种 子 本 身 带 菌 是 可 以 克 服 的 。 种 子 培 养 过 程 染 菌 与 发酵 一 样 有 许 多 因 素 造 成 。 4、 灭 菌 不 彻 底l蒸 汽 通 入 培 养 基 ， 升 温 快 慢 、 保 温 时 间 产 生 过 多 泡 沫l蒸 汽 总 压 是 否 达 到 要 求 标 准5、

16、 技 术 管 理 不 善 （ 要 对 发 酵 每 个 环 节 严 格 控 制 ）l环 境 中 的 杂 菌 数 量 因 季 节 而 有 很 大 差 别 。 如 在 卡 那 霉 素 生 产 中 ，于 炎 热 的 夏 季 将 连 续 灭 菌 预 热 至 800C的 培 养 基 采 样 培 养 ， 可 发现 无 法 计 数 的 大 量 的 芽 孢 杆 菌 ； 而 冬 季 取 样 的 培 养 中 ， 则 仅 发现 2 3个 芽 孢 杆 菌 。 故 染 菌 率 因 季 节 不 同 而 发 生 明 显 变 化 。l原 材 料 储 存 和 保 管 ， 如 液 胨 、 玉 米 浆 、 母 液 糖 等 有 机 原

17、 料 杂 菌 的 数 量l发 酵 罐 、 培 养 基 配 制 罐 等 设 备 的 清 洗 质 量 有 无 灭 菌 的 死 角对 减 少 或 避 免 染 菌 仍 然 是 十 分 必 要 的 。 1， 从 染 菌 的 规 模 来 分 析 染 菌 原 因 v 大 批 发 酵 罐 染 菌 ： 空 气 系 统v 部 分 发 酵 罐 (或 罐 组 )染 菌 ： 前 期 可 能 是 种 子 带 杂 菌 ， 或 灭菌 不 彻 底 ， 中 后 期 则 可 能 是 中 间 补 料 系 统 或 油 管 路 系 统 发生 问 题 所 造 成 的v 个 别 发 酵 罐 连 续 染 菌 ： 设 备 问 题 (如 阀 门

18、的 渗 漏 或 罐 体 腐蚀 磨 损 )， 设 备 的 腐 蚀 磨 损 所 引 起 的 染 菌 会 出 现 每 批 发 酵的 染 菌 时 间 向 前 推 移 的 现 象v 个 别 发 酵 罐 偶 然 染 菌 ： 原 因 比 较 复 杂 ， 因 为 各 种 染 菌 途 径都 可 能 引 起 。 三 、 染 菌 情 况 分 析 2， 从 染 菌 的 时 间 来 分 析v 发 酵 早 期 染 菌 ： 种 子 带 菌 、 培 养 基 和 设 备 灭 菌 不 彻 底、 设 备 或 管 道 有 死 角v 中 、 后 期 染 菌 ： 中 间 补 料 、 设 备 渗 漏 、 操 作 不 合 理3， 从 染 菌

19、 的 类 型 来 分 析v 耐 热 性 芽 抱 杆 菌 ： 死 角 或 灭 菌 不 彻 底v 球 菌 、 酵 母 ： 可 能 是 从 蒸 汽 的 冷 凝 水 或 空 气 中 带 来 的v 霉 菌 ： 灭 菌 不 彻 底 或 无 菌 操 作 不 严 格 四 、 染 菌 的 防 止1、 防 止 种 子 带 菌l制 备 种 子 时 对 沙 土 管 及 摇 瓶 严 格 加 以 控 制 。l沙 土 制 备 时 要 多 次 间 歇 灭 菌l注 意 接 种 、 移 种 时 的 无 菌 操 作l无 菌 室 和 摇 床 间 都 要 保 持 清 洁 。 无 菌 室 内 要 供 给 恒 温 恒 湿 的 无 菌空 气

20、 ， 还 要 装 紫 外 灯 用 以 灭 菌 ， 或 用 化 学 药 品 灭 菌 。2、 防 止 设 备 渗 漏发 酵 设 备 及 附 件 由 于 化 学 腐 蚀 、 电 化 学 腐 蚀 ， 物 料 与 设 备 摩 擦 造 成机 械 磨 损 以 及 加 工 制 作 不 良 等 原 因 会 导 致 设 备 及 附 件 渗 漏 。试 漏 方 法 可 采 用 水 压 试 漏 法 。 即 被 测 设 备 的 出 口 处 装 上 压 力 表 ， 将水 压 入 设 备 ， 待 设 备 中 压 力 上 升 到 要 求 压 力 ， 关 闭 进 出 水 ， 看 压 力有 否 下 降 。 压 力 下 降 则 有

21、渗 漏 。 但 有 些 渗 漏 很 小 ， 看 不 出 何 处 漏 水 ， 可 以 用 稀 碱 溶 液 压 入 设 备 ， 然 后 用 蘸 有 酚 酞 的 纱 布 揩 ， 只 要 酚 酞 能变 红 处 即 为 渗 漏 处 。 3、 防 止 培 养 基 灭 菌 不 彻 底培 养 基 灭 菌 前 含 有 大 量 杂 菌 ， 灭 菌 时 如 果 蒸 汽 压 力 不 足 ， 就 达 不 到 要求 的 温 度 ； 灭 菌 时 产 生 大 量 泡 沫 或 发 酵 罐 中 有 污 垢 堆 积 ， 就 会 窝 藏 大量 杂 菌 ， 造 成 灭 菌 不 彻 底 。4、 防 止 空 气 引 起 的 染 菌空 气

22、冷 却 器 的 列 管 穿 孔 泄 露 ， 冷 却 水 会 渗 入 到 空 气 中 ， 造 成 染 菌 。棉 花 -活 性 炭 过 滤 器 长 期 使 用 后 ， 棉 花 和 活 性 炭 的 体 积 被 压 缩 而 厚 薄不 均 ， 厚 的 一 边 阻 力 大 空 气 不 畅 通 ， 薄 的 一 边 空 气 容 易 通 过 ， 久 而 久之 ， 薄 的 一 边 长 期 受 空 气 顶 吹 而 使 棉 花 活 性 炭 改 变 位 置 ， 造 成 过 滤 器失 效 。过 滤 器 用 蒸 汽 灭 菌 时 ， 若 被 蒸 汽 冷 凝 水 润 湿 就 会 降 低 或 丧 失 过 滤 效 能 ，灭 菌 完

23、 毕 应 立 即 缓 慢 通 入 压 缩 空 气 ， 将 水 分 吹 干 。超 细 纤 维 纸 作 过 滤 介 质 ， 灭 菌 时 必 须 将 管 道 中 冷 凝 水 放 干 净 ， 以 免 介 质 受 潮 失 效 。 5、 发 酵 染 菌 后 的 措 施l染 菌 后 的 培 养 基 必 须 灭 菌 后 才 可 放 下 水 道 。 可 通 蒸 汽 灭 菌 ，也 可 加 入 过 氧 乙 酸 等 化 学 灭 菌 剂 搅 拌 半 小 时 ， 才 放 下 水 道 。 否则 由 于 各 罐 的 管 道 相 通 ， 会 造 成 其 它 罐 的 染 菌 ， 而 且 直 接 放 下水 道 也 会 造 成 空

24、气 的 污 染 而 导 致 其 它 罐 批 染 菌 。l凡 染 菌 的 罐 要 找 染 菌 的 原 因 ， 对 症 下 药 ， 该 罐 也 要 彻 底 清 洗 ，进 行 空 罐 消 毒 ， 才 可 进 罐 。l染 菌 厉 害 时 ， 车 间 环 境 要 用 石 灰 消 毒 ， 空 气 用 甲 醛 熏 蒸 。 特别 ， 若 染 噬 菌 体 ， 空 气 必 须 用 甲 醛 蒸 汽 消 毒 。 五 、 染 噬 菌 体 的 防 治（ 一 ） 染 噬 菌 体 对 发 酵 的 影 响发 酵 过 程 中 如 果 受 噬 菌 体 的 侵 染 ， 一 般 发 生 溶 菌 ， 随 之 出 现发 酵 迟 缓 或 停

25、 止 ， 而 且 受 噬 菌 体 感 染 后 ， 往 往 会 反 复 连 续 感染 ， 使 生 产 无 法 进 行 。染 噬 菌 体 表 现 为 ：1、 镜 检 可 发 现 菌 体 数 量 明 显 减 少 ， 菌 体 不 规 则 ， 严 重 时 完全 看 不 到 菌 体 ， 且 是 在 短 时 间 内 菌 体 自 溶 。2、 发 酵 pH值 逐 渐 上 升 ， 48小 时 之 内 可 达 8.0以 上 ， 不 再 下降 。3、 发 酵 液 残 糖 高 ， 有 刺 激 臭 味 ， 粘 度 大 ， 泡 沫 多 。4、 生 产 量 甚 少 或 增 长 缓 慢 或 停 止 （ 二 ） 产 生 噬 菌

26、体 的 原 因通 常 在 工 厂 投 产 初 期 并 不 感 到 噬 菌 体 的 危 害 ， 经 过 12年 以 后 ，主 要 是 由 于 生 产 和 试 验 过 程 中 不 加 注 意 地 把 许 多 活 菌 体 排 放 到 环境 中 去 ， 自 然 界 中 的 噬 菌 体 就 在 活 菌 体 中 大 量 生 长 ， 造 成 了 自 然界 中 噬 菌 体 增 殖 的 好 机 会 。 这 些 噬 菌 体 随 着 风 沙 尘 土 和 空 气 流 动传 播 ， 以 及 人 们 的 走 动 、 车 辆 的 往 来 也 携 带 着 噬 菌 体 到 处 传 播 ，使 噬 菌 体 有 可 能 潜 入 生

27、产 的 各 个 环 节 ， 尤 其 是 通 过 空 气 系 统 进 入种 子 室 、 种 子 罐 、 发 酵 罐（ 三 ） 染 噬 菌 体 的 检 测在 培 养 皿 上 倒 入 培 养 生 产 菌 的 培 养 基 （ 加 琼 脂 ） 作 下 层 。 同 样的 培 养 基 中 加 入 20 30 培 养 好 的 种 子 液 ， 再 加 入 怀 疑 染 噬菌 体 的 发 酵 液 ， 摇 均 匀 后 ， 铺 上 层 。 培 养 过 夜 观 察 培 养 皿 上 是否 出 现 噬 菌 斑 。也 可 以 在 上 层 培 养 基 中 不 加 怀 疑 染 噬 菌 体 的 发 酵 液 ， 而 将 发 酵 液 直

28、 接 点 种 在 上 层 培 养 基 表 面 ， 培 养 过 夜 ， 观 察 有 无 透 明 圈 出现 。 （ 三 ） 噬 菌 体 的 防 治1、 必 须 建 立 工 厂 环 境 清 洁 卫 生 制 度 ， 定 期 检 查 、 定 期 清 扫 ， 车间 四 周 有 严 重 污 染 噬 菌 体 的 地 方 应 及 时 撒 石 灰 或 漂 白 粉 。2、 车 间 地 面 和 通 往 车 间 的 道 路 尽 量 采 取 水 泥 地 面3、 种 子 和 发 酵 工 段 的 操 作 人 员 要 严 格 执 行 无 菌 操 作 规 程 ， 认 真地 进 行 种 子 保 管 ， 不 使 用 本 身 带 有

29、噬 菌 体 的 菌 种 。 感 染 噬 菌体 的 培 养 物 不 得 带 入 菌 种 室 、 摇 瓶 间4、 认 真 进 行 发 酵 罐 、 补 料 系 统 的 灭 菌 。 严 格 控 制 逃 液 和 取 样 分析 和 洗 罐 所 废 弃 的 菌 体 。 对 排 放 的 废 液 应 灭 菌 后 才 可 排 放 。5、 选 育 抗 噬 菌 体 的 菌 种 ， 或 轮 换 使 用 菌 种 。6、 发 现 噬 菌 体 停 搅 拌 、 小 通 风 ， 将 发 酵 液 加 热 到 7080 杀 死噬 菌 体 (噬 菌 体 不 耐 热 ， 7080C经 5分 钟 即 可 杀 死 ) ， 才 可 排 放 。 发 酵 罐 周 围 的 管 道 也 必 须 彻 底 灭 菌 。 v固 定 化 酵 母 连 续 发 酵 酒 精 染 菌 问 题