食品学院作品2

食品学院作品2,食品,学院,作品 序号： 编码： “挑战杯”大学生课外学术科技作品竞赛决赛 作品申报书 作品名称： 一株唾液乳杆菌对鲜肉的护色效果研究 学院名称： 食品学院 申报者姓名 （集体名称）： 黎婉星、薛嘉欣、任宏团、陈惠俏、李瑞铭 类别： ■自然科学类学术论文 □哲学社会科学类社会调查报告和学术论文 □科技发明制作A类 □科技发明制作B类 A2申报者情况（集体项目） 说明：1．必须由申报者本人按要求填写； 2．申报者代表必须是作者中学历最高者，其余作者按学历高低排列； 3．本表中的学籍管理部门签章视为申报者情况的确认。 申报者代表情况 姓名 黎婉星 性别 女 出生年月 1987年1月 学院 食品学院 系别、专业、年级 05生物工程系 学历 本科 学制 4年 入学时间 2005 作品名称 一株唾液乳杆菌对鲜肉的护色效果研究 毕业论文题目 乳酸菌对鲜肉的护色机理探讨 通讯地址 广州天河区枫叶路俊华街9-1304 邮政编码 510600 办公电话 15918766922 常住地 通讯地址 广州天河区枫叶路俊华街9-1304 邮政编码 510600 住宅电话 15918766922 其他作者情况 姓 名 性别 年龄 学历 所在单位 薛嘉欣 男 22 本科 华南农业大学食品学院生物工程系05级 任宏团 女 22 本科 华南农业大学食品学院生物工程系06级 陈惠俏 女 20 本科 华南农业大学食品学院生物工程系06级 李瑞铭 男 22 本科 华南农业大学食品学院生物工程系06级 资格认定 学院学籍管理部门意见 以上作者是否为2009年7月1日前正式注册在校的全日制非成人教育、非在职的高等学校中国籍专科生、本科生、硕士研究生或博士研究生。 ■是 □否 （部门签章） 2009年 3月 日 院系负责人 或导师意见 本作品是否为课外学术科技或社会实践活动成果 ■是 □否 负责人签名： 2009年 3月 日 B1．申报作品情况（自然科学类学术论文） 说明： 1．必须由申报者本人填写； 2．本部分中的科研管理部门签章视为对申报者所填内容的确认； 3．作品分类请按作品的学术方向或所涉及的主要学科领域填写； 4．硕士研究生、博士研究生作品不在此列。 作品全称 作 品 分 类 （D）A．机械与控制（包括机械、仪器仪表、自动化控 制、工程、交通、建筑等） B．信息技术（包括计算机、电信、通讯、电子等） C．数理（包括数学、物理、地球与空间科学等） D．生命科学（包括生物、农学、药学、医学、健 康、卫生、食品等） E．能源化工（包括能源、材料、石油、化学、化 工、生态、环保等） 作品撰写的目的和基本思路 肉与肉制品的颜色是影响消费者接受性的重要感官指标。但目前人们对肉制品的安全性要求越来越高，希望添加较少的亚硝酸盐甚至不添加就能达到亚硝腌制肉制品的颜色、风味和口感，同时保证安全性。已开发的利用有益微生物（如乳酸菌）进行肉类发酵达到发色效果就是替代亚硝酸盐的方法之一，在肉制品的生产中具有很大的应用潜力。但是，微生物对肉与肉制品颜色的影响的可能的原因及机理仍不确定，微生物制剂对非发酵鲜肉的护色和发色效果还没有研究报道，限制了该方法的应用和推广。 基于以上原因，本研究利用灭活的乳酸菌制剂作为主要成分，观察其对肉类发色和护色的效果，旨在探讨灭活乳酸菌作为肉类发色剂、新鲜肉类的护色剂的可能性，尝试为肉类工业寻找一种全新的亚硝盐替代产品，提高肉类食品的安全性。 作品的科学性、先进性及独特之处 首次利用灭活的微生物对肉类进行护色和发色。 首次研究微生物制剂对非发酵鲜肉的护色/发色的作用。 开创性地探索在使用灭活微生物制剂的同时，单一氨基酸对肉品发色的影响，包括在微生物制剂作用下释放NO的氨基酸对护色和发色的影响。 以上研究都是开拓性的研究，目前未见相关报道。 作品的实际应用价值和现实意义 本研究尝试寻找一种对鲜肉和发酵肉都有良好的护色和发色作用的灭活微生物制剂，并初步探讨其对肉与肉制品颜色的影响的可能的原因及机理。研究结果增加了微生物制剂替代亚硝酸钠用于肉品的护色的可能性，符合肉类工业减少亚硝酸盐使用的发展趋势以及当今社会越来越注重食品安全的趋势，同时也为微生物制剂更广泛地应用于食品行业提供了思路。 学 术 论 文 文 摘 从市售香肠及自制腌肉中分离得到一株具有较强护色能力的乳酸菌H，对其进行常规的生理生化鉴定，并利用16S rRNA序列分析鉴定H菌株为唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）。将不同的乳酸菌处理作用于冷鲜猪肉后进行感官评定、色差测定、紫外可见光谱扫描，旨在观察乳酸菌对猪肉的护色效果。实验数据表明，添加1.3×10-2mol/L Arg的H菌株（1×109CFU/mL）对猪肉的护色效果优于用蒸馏水处理的阴性对照和亚硝酸钠处理的阳性对照，形成的NO-Mb在各处理中含量最高，有望初步替代亚硝酸钠用于肉品的护色。 作品在何时、何地、何种机构举行的会议上或报刊上发表及所获奖励 无 鉴定结果 请提供对于理解、审查、评价所申报作品具有参考价值的现有技术及技术文献的检索目录 [1] Cassens, R.G.. Composition and safety of cured meats in the USA[J]. Food Chemistry , 1997,59, 561~566. [2] Cammack, R., Joannou, C.L., Cui, X.Y., Martinez, C.T., Maraj, S.R., Hughes, M.N., Nitrite and nitrosyl compounds in food preservation[J]. Biochemical Biophysical Acta-Bioenergetics .1999,1411,475~488. [3] Renerre M., Labas R. Biochemical factors influencing metmyoglobin formation in beef muscle [J]. Meat Science ,1987,19,151~156. [4] 周德庆.微生物学实验教程[M]. 北京: 高等教育出版社, 2006. [5] 凌代文.乳酸细菌分类鉴定及实验方法[M]. 北京: 中国轻工业出版社, 1999 [6] E Pavente, C Brienza,M Moles, et al. A comparison of methods for the measurement of hacteriocin activity [J].J Microbi Method, 1995, 22:95~108 [7] Vural, H. The use of commercial starter cultures in the Production of Thrkish semidry fermented sausages. Z Lebensm Unters Forsch A[J]. 1998, 207:410~412 [8] Ibanez, C.,Quintanilla L. Dry fermented sausages elaborated with Lactobacillus Plantarum-Staphylococcus carnosus. Part Ⅱ: Effect of Partial replacement of NaCl with KCl on the proteolytic and insolubilization Processes[J]. 1997, 46(3):277~284 [9] Kenneally,p.M.,Schwarz,G. Lipolytic Starter Culture Effects on production of Free Fatty Acids in Fermented Sausages. Journal of Food Science[J].1998, 63(3):538~543 [10] Xue Zhang, Baohua Kong. Production of cured meat color in nitrite-free Harbin red sausage by Lactobacillus fermentum fermentation[J]. Meat Science.2007, 77, 593~59 [11] Millar S J , Moss B W, Stevenson M H. Some observation on the absorption spectra of various myoglobin derivatives found in meat [J] . Meat Science , 1996(42) :277~288 [12] 汤祥明.高铁肌红蛋白还原酶活力与肉色稳定性的研究[D].2006,南京师范大学硕士学位论文 [13] Morita H , Sakata R, Nagata Y.Nitric Oxide Complex of Iron(II) Myoglobin onverted from Metmyoglobin by Staphylococcus xylosus[J]. J Food Sci , 1998(63) :352~355 [14] Arihara K, Kushida H, Kondo Y, et al. Conversion of metmyoglobin to bright red myoglobin derivatives by Chromo bacterium vio laceum , Kurthia sp. , and Lactobacillus fermentum JCM1173. [J] J . Food Sci, 1998(53):38~42 [15] Shahidiv, F. and Pegg, R. B. L. Preparation of the Cooked Cured Meat Pigment, Dinitrosyl Ferrohemochrome, from Hemin and Nitric oxide [J].Journal of Food Science,1985,(50): 272~273. 申报材料清单（申报论文一篇，相关资料名称及数量） 申报论文一篇 科研管理 部门签章 2009年 3月 日 C.当前国内外同类课题研究水平概述 说明：1.申报者可根据作品类别和情况填写； 2.填写此栏有助于评审。 色泽对人们选购肉制品极为重要，在很大程度上直接决定消费者的购买意识。肉制品加工中常用的发色剂有硝酸钠、亚硝酸钠、硝酸钾和亚硝酸钾，但是，亚硝酸盐的安全性问题一直困扰着人类，因为亚硝酸盐能够与多种氨基化合物（蛋白质的分解产物）发生反应，产生致癌的亚硝铵如N 亚硝基二甲胺(N–nitroso dimethylamine)和N-亚硝基吡咯烷(N-nitrosopyrrolidine) 等。亚硝铵是目前国际上公认的一种强致癌物，动物实验表明：不仅长期小剂量食用有致癌作用，而且一次摄入足够的量也有致癌作用。目前，世界各国的肉类科研机构和厂家都在积极寻找安全可靠、经济适用、能替代硝酸盐和亚硝酸盐的肉制品发色剂，其中利用有益微生物进行肉类发酵达到发色效果就是替代方法之一。 Arihara（1993）研究发现，发酵乳杆菌JCM1173能将高铁肌红蛋白(Met-Mb)转变成亮红色的NO-Mb。但是发酵乳杆菌JCM1173在无硝酸盐的条件下将Met-Mb转变成NO-Mb的机理仍不清楚，NO的来源还不能确定。发酵乳杆菌JCM1173是公认安全(GRAS)的菌株，将其广泛应用于肉制品发酵过程中是很有意义的，可以提供风味、颜色并保证产品的安全 。 Morita(1997)从10株发酵乳杆菌中筛选出1株(IFO3956)能利用L-arginine的胍基氮合成NO，从而推测发酵乳杆菌IFO3956可能含有细菌一氧化氮合酶(NOS)。NO自由基来自体内以L-精氨酸为底物，在NO合成酶(NOS)作用下，在还原型辅酶Ⅱ(NADPH)及黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、黄素腺嘌呤单核苷酸(FMN)等因子协助下生成。 Møler等（2003）将发酵乳杆菌JCM1173和IFO3956应用到无硝发酵肠生产中，获得了稳定的腌肉颜色。Gündoğdu（2006）等人从发酵奶、黄油、奶酪和泡菜汁等材料中分离出多株产NO的乳酸菌，包括植物乳杆菌、乳酸片球菌等用于肉品发色的发酵菌种。并且分析了各菌种转化高铁肌红蛋白至亚硝基肌红蛋白的能力。结果其中三株乳酸菌具有很强的转化效果，是比较理想的发色菌株。 在利用微生物发酵或微生物制剂作为肉类发色和护色剂的研究和应用方面，我国还处于起步阶段，应用和基础研究都还很薄弱。 刘玺（2000）报道，利用选用啤酒片球菌(Pediococcus cereviar) 和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) 发酵中式香肠，结果发现乳酸菌发酵能够改善中式香肠的发色稳定性和呈色效果，使颜色更鲜艳。同时可大幅降低亚硝酸钠的添加量及其在成品中的残留量，而且发色作用较好。张雪和孔保华（2005，2007）利用发酵乳杆菌JCM1173适度发酵的发色试验以替代红肠中的亚硝酸盐。结果表明，通过紫外可见光谱扫描发现，发酵乳杆菌JCM1173 在发酵肉的过程中形成NO-Mb，而且在试验范围内，添加量越大，形成的NO-Mb浓度越高，当添加量为108CFU/g（肉）时，其NO-Mb 含量接近60 mg/ kg 亚硝酸盐腌制的肉。成品红肠的a值和感官评定也表现出相似的规律。沈清武（2004）研究了利用含戊糖片球菌(P. pentosaceus)、戊糖乳杆菌31-1（L. pentosus）和木糖葡萄球菌（S. xylosus）的混合发酵剂发酵香肠，接入量为106CFU/g。试验结果显示：发酵剂对香肠色泽的有明显的影响。 可能的原因是：微生物将肌红蛋白(Mb) 转变成红色的衍生物，如NO-Mb。因为葡萄球菌能分泌硝酸盐还原酶，硝酸盐还原酶还原硝酸盐成亚硝酸盐，亚硝酸盐再分解产生一氧化氮，一氧化氮与肌红色素作用，产生亚硝基肌红蛋白（nitrosomyoglobin），从而促进腌制肉色的形成。同时葡萄球菌是接触酶阳性的细菌，它们能在发酵香肠中产生过氧化氢酶，分解乳酸菌及其它一些革兰氏阴性菌产生的H2O2，避免色素被进一步氧化，从而保证硝酸盐和亚硝酸盐的发色作用。 目前，微生物对肉与肉制品颜色的影响的可能的原因及机理仍不确定。微生物制剂对非发酵鲜肉的护色和发色效果还没有研究报道，主要是因为目前人们只关注了发酵肉制品，而且只有在微生物生长过程，即肉类发酵后才能发挥发色的作用。基于以上原因，本研究尝试寻求一种灭活的微生物制剂，对鲜肉和发酵肉都有良好的护色和发色作用。 D.推荐者情况及对作品的说明 说明：1．由推荐者本人填写； 2．推荐者必须具有高级专业技术职称，并是与申报作品 相同或相关领域的专家学者或专业技术人员（教研组 集体推荐亦可）； 3．推荐者填写此部分，即视为同意推荐； 4．推荐者所在单位签章仅被视为对推荐者身份的确认。 推荐者情况 姓 名 胡文锋 性别 男 年龄 44 职称 副教授 工作单位 华南农业大学食品学院 通讯地址 广州市五山镇华南农业大学食品学院生物工程系 邮政编码 510642 单位电话 85280267 住宅电话 13312828858 推荐者所在 单位签章 （签章） 2009年 3月 日 请对申报者申报情况的真实性作出阐述 情况属实 请对作品的意义、技术水平、适用范围及推广前景作出您的评价 该作品首次利用灭活的微生物对非发酵鲜肉进行护色和发色，并开创性地探索在使用灭活微生物制剂的同时，单一氨基酸对肉品发色的影响。在为肉类工业寻找一种全新的亚硝盐替代产品、提高肉类食品的安全性方面是一个很有意义的尝试。 其它说明 推荐者情况 姓 名 钟青萍 性别 女 年龄 41 职称 副教授 工作单位 华南农业大学食品学院 通讯地址 广州市五山镇华南农业大学食品学院生物工程系 邮编 510642 单位电话 85280267 住宅电话 38903016 推荐者所在 单位签章 签章日期 2009年 3月 日 请对申报者申报情况的真实性作出阐述 情况属实 请对作品的意义、技术水平、适用范围及推广前景作出您的评价 冷鲜猪肉是今后生肉消费的主流，如何延长其保质期是目前急待解决的问题。该作品研究结果使微生物制剂替代亚硝酸钠用于鲜肉品的护色的可能性大大提高，符合肉类工业减少亚硝酸盐使用的发展趋势以及当今社会越来越注重食品安全的趋势，对微生物制剂在食品行业的推广应有具有重要意义。 其它说明 E．参赛作品打印处 12 一株唾液乳杆菌对鲜肉的护色效果研究 黎婉星 薛嘉欣 任宏团 陈惠俏 李瑞铭 胡文锋 华南农业大学食品学院，广州，510642 摘 要：从市售香肠及自制腌肉中分离得到一株具有较强护色能力的乳酸菌H，对其进行常规的生理生化鉴定，并利用16S rRNA序列分析鉴定H菌株为唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）。将乳酸菌作不同处理后作用于冷鲜猪肉，进行感官评定、色差测定、紫外可见光谱扫描，旨在观察乳酸菌对猪肉的护色效果。实验数据表明，添加1.3×10-2mol/L Arg的H菌株（1×109CFU/mL）对猪肉的护色效果优于用蒸馏水处理的阴性对照和亚硝酸钠处理的阳性对照，形成的NO-Mb在各处理中含量最高，有望初步替代亚硝酸钠用于肉品的护色。 关键词：乳酸菌 护色 猪肉 NO-Mb Arg 色泽的形成和稳定性是肉和肉制品的一项重要感官品质，它直接决定消费者的购买意识。为了使肉及肉制品呈现鲜艳的红色，厂商在加工过程中常添加硝酸盐与亚硝酸盐。亚硝酸钠是一种传统发色剂，它在肉中酸和酶的作用下，生成NO，NO与肌/血红蛋白结合，生成稳定的亚硝基肌/血红蛋白，从而使肉类保持鲜红色泽。除此之外，它能抑制腐败菌特别是肉毒梭状芽孢杆菌[1]（Cassens，1997）的增长；并有效阻止脂肪氧化和脂肪酸败[2]（Cammack, et al，1999），从而延长肉品的货架期。但是，亚硝酸盐和硝酸盐的使用也存在重大的安全隐患：过量的亚硝酸盐进入血液后，可使正常的血红蛋白（二价铁）变成高铁血红蛋白（三价铁），失去携氧功能，导致组织缺氧[3]；能与多种氨基化合物（主要来自蛋白质分解产物）反应，产生致癌的N-亚硝基化合物，如亚硝胺等。 鉴于以上原因，世界各国都在致力于开发亚硝酸盐的替代品，这是人类健康的需求，也是肉类工业发展的必然趋势。目前人们开发出了多种替代品和替代工艺来代替亚硝酸盐的发色作用，如一氧化碳（CO），组氨酸和半胱氨酸，肌肽（Carnosine），二亚硝基亚铁血红素，亚硝基血红蛋白（HbNO）等。而利用有益微生物如乳酸菌就是其中的有效方法之一。但是，目前国内外的研究都集中在对腌制肉（发酵肉）的发色作用上，它们对鲜肉（非发酵肉）是否也有同样的护色和发色效果还未见文献报道。本研究提出了利用灭活的乳酸菌，辅以能作为NO供体的氨基酸对肉类发色进行研究，探讨其对肉类的护色和发色的可能性。 1 材料与方法 1.1 材料与设备 1.1.1 材料 菌种来源：唾液乳杆菌H，分离自实验室自制腌肉；发酵乳杆菌JCM1173，购于中科院微生物研究所。 培养基：MRS培养基 原料肉：新鲜猪精肉，购自华南农业大学三角市场 药品：亚硝酸钠，精氨酸 其它：PA/PE复合真空包装袋 1.1.2 仪器与设备 真空包装机，水浴锅，PCR仪，绞肉机，分光光度计，色差计，恒温培养箱，冷冻离心机等 1.2 实验方法 1.2.1具有护色能力的乳酸菌的分离筛选和鉴定 1.2.1.1乳酸菌的分离和纯培养 采用MRS（添加0.5%CaCO3）进行常规分离，挑选具有明显溶钙圈的菌株，反复分离纯化直至得到纯的单菌落，革兰氏染色，方法参考周德庆微生物学实验教程[4]。 1.2.1.2有护色和发色能力的乳酸菌的筛选 （1）产亚硝基肌/血红蛋白试验：稀释倒平板法：将自制的高铁肌/血红蛋白（终浓度为2-5mg/ml）溶液加入到已冷却50℃的MRS琼脂培养基中。培养后，挑选那些具有明显亮红色或褐红色的菌落，作为待选菌种。 （2）H2O2产生实验，H2S实验，产气实验，氨基酸脱羧酶实验，石蕊牛奶，精氨酸产氨，淀粉水解，明胶液化实验参照凌代文 [5]（2001）等人的方法。 （3）抑制肉类常见腐败菌实验：单层琼脂平板扩散试验（AWDA法）参照E.Pavente[6]等人的方法。 1.2.1.3 利用16S rRNA鉴定乳酸菌 1.2.2 乳酸菌对猪肉护色效果的研究 1.2.2.1 实验设计 实验肉块随机分成11组，每组6块，实验设计见表1所示 表 1 乳酸菌对猪肉护色效果的实验设计 组别 添加物 添加量 第一组 Ⅰ（阴性对照） 无菌蒸馏水 - 第二组 Ⅱ（阳性对照） 亚硝酸钠 5×10-5mol/L 第三组 Ⅲ（Arg组） Arg 1.3×10-4 mol/L 第四组 （H菌组） Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅶ H活菌 H活菌+Arg H灭活菌 H灭活菌+Arg 1×109个/mL 第五组 （J菌组） Ⅷ Ⅸ Ⅹ Ⅺ J活菌 J活菌+Arg J灭活菌 J灭活菌+Arg 注：H活菌+Arg：添加了1.3×10-4 mol/LArg的H活菌组； H灭活菌+Arg：添加了1.3×10-4 mol/L Arg的H灭活菌组，其中H灭活菌是将菌体放置于65℃灭活30min；以下J菌组的处理同H菌组 1.2.2.2 样品处理 将切好的肉块置于各处理液中浸泡1min，取出，自然晾干，用真空包装袋包装，随后置于25℃培养箱。隔天取样，对各处理肉进行各项指标的测定，包括感官评定，色差测定和抽提NO-Mb进行可见光谱扫描. 1.2.2.3 指标测定 （1）感官评定：采用由经过专门训练的10位专家组成评定小组，对不同试验组肉块的外观、颜色、风味和总体接受性等进行评分[7,8]，评分级别1~9分（l~4：外观有缺陷，颜色暗淡，无香味或有异味，接受性差； 4.1~6：外观正常，颜色玫瑰红，有轻微香味，可接受；6.1~9：外观好，颜色鲜艳，香味浓郁，接受性好）。肉品发酵剂的菌种筛选及在发酵香肠中的应用 （2）色差测定：取样，将样品压平后，立即用色差计分析，重复测定五次[9]，记录样品的明度值（L）、红度值（a）和黄度值（b）。 （3）紫外可见光谱扫描：用磷酸缓冲液浸提肉样1h。具体方法参考文献[10]。随后在400~650nm波长范围内连续记录色素提取液的光谱吸收值。 2 结果与讨论 肉的颜色主要取决于肉的物理结构、色素浓度以及色素的化学状态[11]。肉中的肌红蛋白以多种形式存在，而肉色的鲜艳程度与其肌红蛋白所处的状态有很大的关系，且每种肌红蛋白衍生物都有其特征吸收光谱。通过各种吸收光谱可以确定肉中肌红蛋白的化学状态及含量。通过前人研究[10，12，13]得出各种肌红蛋白衍生物吸收光谱及颜色变化如下表所示： 表 2 各种肌红蛋白衍生物吸收光谱及颜色变化 肌红蛋白衍生物 最大吸收峰值（nm） 颜色 氧合肌红蛋白 高铁肌红蛋白 亚硝基肌红蛋白 434 557 505 630 420 540 580 鲜红色 暗褐色 玫瑰红 2.1 具有护色发色能力乳酸菌的筛选，分离和鉴定 筛选到的一株具有较强护色发色能力（菌落能维持较稳定的亮红色）的乳酸菌H，经生理生化和16srRNA鉴定为唾液乳杆菌。 2.2 乳酸菌对鲜肉护色效果的研究 2.2.1 感官评定 图 1 不同菌剂处理猪肉72h后的颜色比较 图 2 不同菌剂处理猪肉的感官评定值随时间变化 从图1中可看到，各处理组在25℃下存放1天后，颜色发生了较明显的变化。总体上，添加Arg的菌体组都比未添加Arg的菌体组色泽鲜艳。特别是添加了Arg的H活菌组呈现良好的色泽，其次是添加Arg的灭活菌组，即Ⅶ组和Ⅺ组，其颜色均优于阳性对照组（NaNO2处理组）；另外，单独用Arg处理的猪肉在色泽上也超过了NaNO2处理组的效果。而阴性对照组（无菌蒸馏水处理组）在感官评定上只有2.5分，出现较难接受的状态，颜色灰白，汁液流失量大，总体接受性差。随着存放天数的增加，添加Arg的H活菌组仍能保持较稳定的鲜艳的色泽，说明H活菌+Arg组能合成较多的NO-Mb，并能保持较好的稳定性。 2.2.2 色差测定 表 3 不同菌剂处理猪肉的色差值 存放时间 处理 L值 a值 b值 第一天 Ⅰ（蒸馏水） 58.24cd 1.83 g 9.09 e Ⅱ（ NaNO2） 55.92 def 4.60 bc 9.85 de Ⅲ（Arg） 54.19 f 6.32 a 11.86 bcd Ⅳ（活菌H） 54.26 f 3.88 de 12.01 bcd Ⅴ（活菌H＋Arg ） 55.11 ef 5.66 a 13.57 ab Ⅵ（灭活菌H） 57.31 cde 3.14 f 11.89 bcd Ⅶ（灭活菌H＋Arg） 57.40 cde 4.02 cd 11.24 bcde Ⅷ（活菌J） 61.64 b 3.30 ef 11.09 cde Ⅸ（活菌J＋Arg） 59.42 bc 2.82 f 12.05 bcd Ⅹ（灭活菌J） 58.93 c 2.75 f 12.74 bc Ⅺ（灭活菌J＋Arg） 65.30 a 5.20 b 15.46 a 第二天 Ⅰ（蒸馏水） 66.08 a 1.65 g 9.63 e Ⅱ（ NaNO2） 62.87 b 2.76 f 11.25 bc Ⅲ（Arg） 56.43 d 4.23 b 10.20 de Ⅳ（活菌H） 60.53 bc 3.64 c 10.72 cd Ⅴ（活菌H＋Arg ） 52.36 e 4.41 a 12.31 a Ⅵ（灭活菌H） 62.94 b 3.20 de 10.70 cd Ⅶ（灭活菌H＋Arg） 59.47 cd 4.07 b 11.27 bc Ⅷ（活菌J） 62.53 bc 2.90 ef 11.63 b Ⅸ（活菌J＋Arg） 62.25 bc 2.77 f 11.97 b Ⅹ（灭活菌J） 62.02 bc 3.58 cd 9.74 e Ⅺ（灭活菌J＋Arg） 59.45 cd 4.69 a 11.72 b 第三天 Ⅰ（蒸馏水） 68.89 a 0.72 h 13.31 a Ⅱ（ NaNO2） 62.41 d 2.12 g 11.06 de Ⅲ（Arg） 60.39 f 3.32 de 11.75 cd Ⅳ（活菌H） 60.68 f 3.56 cd 11.31 d Ⅴ（活菌H＋Arg ） 55.10 h 4.41 f 12.99 ab Ⅵ（灭活菌H） 63.12 c 2.25 g 12.85 ab Ⅶ（灭活菌H＋Arg） 59.33 g 4.04 ab 12.39 bc Ⅷ（活菌J） 66.23 b 2.90 f 10.61 ef Ⅸ（活菌J＋Arg） 63.39 c 2.41 g 13.02 ab Ⅹ（灭活菌J） 62.47 d 2.97 ef 11.40 d Ⅺ（灭活菌J＋Arg） 61.51 e 3.93 bc 8.87 f 注：同一列肩标注字母不同者,表示差异显著(P>0.05) 图 3.1 不同菌剂处理猪肉的L值随时间的变化 图 3.2 不同菌剂处理猪肉的a值随时间的变化 图 3.3 不同菌剂处理猪肉的b值随时间的变化 从上图中可看出，各处理组的L值和b值差异不明显。而a值即肉的红度具有较明显的差异。从表3中可以看出，Ⅲ、Ⅴ、Ⅺ组与Ⅰ组对比，其a值分别为6.32 、5.66、5.20和 1.83，差异较显著，证明用H和J菌处理过的肉在颜色保持上具有良好的效果，而Ⅲ与Ⅴ组间差异不明显，说明单独添加Arg也能达到良好的护色效果，可能是由于肉中自然存在的乳酸菌能将Arg提供的NO供体合成稳定的NO-Mb。这与感官评定结果呈现高度的相关性。 JCM1173（J菌）是购自中科院微生物研究所的发酵乳杆菌。Arihara[14]研究发现，发酵乳杆菌JCM1173 能将高铁肌红蛋白（Met-Mb） 转变成亮红色的NO-Mb。发酵乳杆菌JCM1173 是公认安全（GRAS）的菌株，将其广泛应用于肉制品发酵过程中，可以提供风味、颜色并保证产品的安全。故本研究采用具有护色能力的JCM1173菌作比较，但在本研究中发现，H菌处理的鲜肉无论在感官评定还是色差测定上都优于J菌组，同时也优于传统的发色剂NaNO2处理的结果，证实H菌具有潜在的护色发色能力。 2.2.3 紫外可见光谱扫描 图4 不同处理的猪肉提取液400~650nm紫外可见光谱扫描结果 从图4中可以看出，用亚硝酸钠，Arg和各处理液处理过的猪肉，存放数天后，用磷酸缓冲液提取的NO-Mb提取液在400nm~ 600nm紫外可见光谱范围内进行扫描，可发现在540，580nm处均可出现特征吸收峰，与Shahidiv[15]、张坤生（1995）、和XueZhang[10]等文献报道的吸收曲线基本一致，但出现了点峰值偏移现象，可能是由于提取液中含有其他杂蛋白。另外，从该光谱图上可以看出添加1.3×10-4 mol/L Arg的H活菌组其吸光值最高，表明合成的NO-Mb含量最多，可能是由于Arg作为NO供体，在NO合成酶的作用下，可以提供更多的NO基团，从而与猪肉中的Mb结合生成更多稳定的NO-Mb。而灭活菌组的NO-Mb含量稍低，可能是由于微生物代谢产生的NO合成酶在菌体灭活过程受到温度或时间的影响，导致部分酶失活。因此NO合成酶的活性与灭活温度和时间的关系有待于进一步研究，以保证菌体的有效灭活，同时又保证酶系不受到破坏。亚硝酸钠处理组的波长扫描图也呈现相似的吸收峰，可能是因为猪肉中的乳酸菌合成的亚硝酸盐还原酶利用NaNO2合成NO，从而合成NO-Mb，这也就是亚硝酸盐用于肉类发色的原理。而用无菌蒸馏水处理过的阴性对照组，其提取液在400nm~650nm波长范围内，在505nm和630nm处了较明显的吸收峰，这是高铁肌红蛋白的典型吸收峰，说明阴性对照组在存放过程中，由于没有NO生成，从而不能合成NO-Mb，故肌红蛋白逐渐被氧化，生成了高铁肌红蛋白，处理肉的总体接受性也较差。这些与感官评定和色差测定结果呈现相似的趋势。 3 结论 H菌株经生理生化及16srRNA鉴定，证实其为一株唾液乳杆菌。用1×109CFU/mL的H菌和J菌处理过的鲜肉具有良好的护色效果。其中，添加1.3×10-4 mol/L Arg的H活菌组的处理效果最好，感官评定值达到7.5分，色差值为5.66，而紫外可见光谱扫描显示其提取液具有NO-Mb的特征吸收光谱，且含量最高。有望替代NaNO2作为鲜肉发色剂的研究。灭活菌+Arg组也能达到良好的护色效果，但可能是因为灭活温度和时间对微生物酶的影响，故效果不如活菌好，其灭活条件还有待于进一步研究。 [参考文献] [1] Cassens, R.G.. Composition and safety of cured meats in the USA[J]. Food Chemistry , 1997,59, 561~566. [2] Cammack, R., Joannou, C.L., Cui, X.Y., Martinez, C.T., Maraj, S.R., Hughes, M.N., Nitrite and nitrosyl compounds in food preservation[J]. Biochemical Biophysical Acta-Bioenergetics .1999,1411,475~488. [3] Renerre M., Labas R. Biochemical factors influencing metmyoglobin formation in beef muscle [J]. Meat Science ,1987,19,151~156. [4] 周德庆.微生物学实验教程[M]. 北京: 高等教育出版社, 2006. [5] 凌代文.乳酸细菌分类鉴定及实验方法[M]. 北京: 中国轻工业出版社, 1999 [6] E Pavente, C Brienza,M Moles, et al. A comparison of methods for the measurement of hacteriocin activity [J].J Microbi Method, 1995, 22:95~108 [7] Vural, H. The use of commercial starter cultures in the Production of Thrkish semidry fermented sausages. Z Lebensm Unters Forsch A[J]. 1998, 207:410~412 [8] Ibanez, C.,Quintanilla L. Dry fermented sausages elaborated with Lactobacillus Plantarum-Staphylococcus carnosus. Part Ⅱ: Effect of Partial replacement of NaCl with KCl on the proteolytic and insolubilization Processes[J]. 1997, 46(3):277~284 [9] Kenneally,p.M.,Schwarz,G. Lipolytic Starter Culture Effects on production of Free Fatty Acids in Fermented Sausages. Journal of Food Science[J].1998, 63(3):538~543 [10] Xue Zhang, Baohua Kong. Production of cured meat color in nitrite-free Harbin red sausage by Lactobacillus fermentum fermentation[J]. Meat Science.2007, 77, 593~59 [11] Millar S J , Moss B W, Stevenson M H. Some observation on the absorption spectra of various myoglobin derivatives found in meat [J] . Meat Science , 1996(42) :277~288 [12] 汤祥明.高铁肌红蛋白还原酶活力与肉色稳定性的研究[D].2006,南京师范大学硕士学位论文 [13] Morita H , Sakata R, Nagata Y.Nitric Oxide Complex of Iron(II) Myoglobin onverted from Metmyoglobin by Staphylococcus xylosus[J]. J Food Sci , 1998(63) :352~355 [14] Arihara K, Kushida H, Kondo Y, et al. Conversion of metmyoglobin to bright red myoglobin derivatives by Chromo bacterium vio laceum , Kurthia sp. , and Lactobacillus fermentum JCM1173. [J] J . Food Sci, 1998(53):38~42 [15] Shahidiv, F. and Pegg, R. B. L. Preparation of the Cooked Cured Meat Pigment, Dinitrosyl Ferrohemochrome, from Hemin and Nitric oxide [J].Journal of Food Science,1985,(50): 272~273. 11