食品学院作品2
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一株唾液乳杆菌对鲜肉的护色效果研究
黎婉星 薛嘉欣 任宏团 陈惠俏 李瑞铭
胡文锋
华南农业大学食品学院，广州，510642
摘 要：从市售香肠及自制腌肉中分离得到一株具有较强护色能力的乳酸菌H，对其进行常规的生理生化鉴定，并利用16S rRNA序列分析鉴定H菌株为唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）。将乳酸菌作不同处理后作用于冷鲜猪肉，进行感官评定、色差测定、紫外可见光谱扫描，旨在观察乳酸菌对猪肉的护色效果。实验数据表明，添加1.3×10-2mol/L Arg的H菌株（1×109CFU/mL）对猪肉的护色效果优于用蒸馏水处理的阴性对照和亚硝酸钠处理的阳性对照，形成的NO-Mb在各处理中含量最高，有望初步替代亚硝酸钠用于肉品的护色。
关键词：乳酸菌 护色 猪肉 NO-Mb Arg
色泽的形成和稳定性是肉和肉制品的一项重要感官品质，它直接决定消费者的购买意识。为了使肉及肉制品呈现鲜艳的红色，厂商在加工过程中常添加硝酸盐与亚硝酸盐。亚硝酸钠是一种传统发色剂，它在肉中酸和酶的作用下，生成NO，NO与肌/血红蛋白结合，生成稳定的亚硝基肌/血红蛋白，从而使肉类保持鲜红色泽。除此之外，它能抑制腐败菌特别是肉毒梭状芽孢杆菌[1]（Cassens，1997）的增长；并有效阻止脂肪氧化和脂肪酸败[2]（Cammack, et al，1999），从而延长肉品的货架期。但是，亚硝酸盐和硝酸盐的使用也存在重大的安全隐患：过量的亚硝酸盐进入血液后，可使正常的血红蛋白（二价铁）变成高铁血红蛋白（三价铁），失去携氧功能，导致组织缺氧[3]；能与多种氨基化合物（主要来自蛋白质分解产物）反应，产生致癌的N-亚硝基化合物，如亚硝胺等。
鉴于以上原因，世界各国都在致力于开发亚硝酸盐的替代品，这是人类健康的需求，也是肉类工业发展的必然趋势。目前人们开发出了多种替代品和替代工艺来代替亚硝酸盐的发色作用，如一氧化碳（CO），组氨酸和半胱氨酸，肌肽（Carnosine），二亚硝基亚铁血红素，亚硝基血红蛋白（HbNO）等。而利用有益微生物如乳酸菌就是其中的有效方法之一。但是，目前国内外的研究都集中在对腌制肉（发酵肉）的发色作用上，它们对鲜肉（非发酵肉）是否也有同样的护色和发色效果还未见文献报道。本研究提出了利用灭活的乳酸菌，辅以能作为NO供体的氨基酸对肉类发色进行研究，探讨其对肉类的护色和发色的可能性。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
1.1.1 材料
菌种来源：唾液乳杆菌H，分离自实验室自制腌肉；发酵乳杆菌JCM1173，购于中科院微生物研究所。
培养基：MRS培养基
原料肉：新鲜猪精肉，购自华南农业大学三角市场
药品：亚硝酸钠，精氨酸
其它：PA/PE复合真空包装袋
1.1.2 仪器与设备
真空包装机，水浴锅，PCR仪，绞肉机，分光光度计，色差计，恒温培养箱，冷冻离心机等
1.2 实验方法
1.2.1具有护色能力的乳酸菌的分离筛选和鉴定
1.2.1.1乳酸菌的分离和纯培养
采用MRS（添加0.5%CaCO3）进行常规分离，挑选具有明显溶钙圈的菌株，反复分离纯化直至得到纯的单菌落，革兰氏染色，方法参考周德庆微生物学实验教程[4]。
1.2.1.2有护色和发色能力的乳酸菌的筛选
（1）产亚硝基肌/血红蛋白试验：稀释倒平板法：将自制的高铁肌/血红蛋白（终浓度为2-5mg/ml）溶液加入到已冷却50℃的MRS琼脂培养基中。培养后，挑选那些具有明显亮红色或褐红色的菌落，作为待选菌种。
（2）H2O2产生实验，H2S实验，产气实验，氨基酸脱羧酶实验，石蕊牛奶，精氨酸产氨，淀粉水解，明胶液化实验参照凌代文 [5]（2001）等人的方法。
（3）抑制肉类常见腐败菌实验：单层琼脂平板扩散试验（AWDA法）参照E.Pavente[6]等人的方法。
1.2.1.3 利用16S rRNA鉴定乳酸菌
1.2.2 乳酸菌对猪肉护色效果的研究
1.2.2.1 实验设计
实验肉块随机分成11组，每组6块，实验设计见表1所示
表 1 乳酸菌对猪肉护色效果的实验设计
组别
添加物
添加量
第一组
Ⅰ（阴性对照）
无菌蒸馏水
-
第二组
Ⅱ（阳性对照）
亚硝酸钠
5×10-5mol/L
第三组
Ⅲ（Arg组）
Arg
1.3×10-4 mol/L
第四组
（H菌组）
Ⅳ
Ⅴ
Ⅵ
Ⅶ
H活菌
H活菌+Arg
H灭活菌
H灭活菌+Arg
1×109个/mL
第五组
（J菌组）
Ⅷ
Ⅸ
Ⅹ
Ⅺ
J活菌
J活菌+Arg
J灭活菌
J灭活菌+Arg
注：H活菌+Arg：添加了1.3×10-4 mol/LArg的H活菌组；
H灭活菌+Arg：添加了1.3×10-4 mol/L Arg的H灭活菌组，其中H灭活菌是将菌体放置于65℃灭活30min；以下J菌组的处理同H菌组
1.2.2.2 样品处理
将切好的肉块置于各处理液中浸泡1min，取出，自然晾干，用真空包装袋包装，随后置于25℃培养箱。隔天取样，对各处理肉进行各项指标的测定，包括感官评定，色差测定和抽提NO-Mb进行可见光谱扫描.
1.2.2.3 指标测定
（1）感官评定：采用由经过专门训练的10位专家组成评定小组，对不同试验组肉块的外观、颜色、风味和总体接受性等进行评分[7,8]，评分级别1~9分（l~4：外观有缺陷，颜色暗淡，无香味或有异味，接受性差； 4.1~6：外观正常，颜色玫瑰红，有轻微香味，可接受；6.1~9：外观好，颜色鲜艳，香味浓郁，接受性好）。肉品发酵剂的菌种筛选及在发酵香肠中的应用
（2）色差测定：取样，将样品压平后，立即用色差计分析，重复测定五次[9]，记录样品的明度值（L）、红度值（a）和黄度值（b）。
（3）紫外可见光谱扫描：用磷酸缓冲液浸提肉样1h。具体方法参考文献[10]。随后在400~650nm波长范围内连续记录色素提取液的光谱吸收值。
2 结果与讨论
肉的颜色主要取决于肉的物理结构、色素浓度以及色素的化学状态[11]。肉中的肌红蛋白以多种形式存在，而肉色的鲜艳程度与其肌红蛋白所处的状态有很大的关系，且每种肌红蛋白衍生物都有其特征吸收光谱。通过各种吸收光谱可以确定肉中肌红蛋白的化学状态及含量。通过前人研究[10，12，13]得出各种肌红蛋白衍生物吸收光谱及颜色变化如下表所示：
表 2 各种肌红蛋白衍生物吸收光谱及颜色变化
肌红蛋白衍生物
最大吸收峰值（nm）
颜色
氧合肌红蛋白
高铁肌红蛋白
亚硝基肌红蛋白
434 557
505 630
420 540 580
鲜红色
暗褐色
玫瑰红
2.1 具有护色发色能力乳酸菌的筛选，分离和鉴定
筛选到的一株具有较强护色发色能力（菌落能维持较稳定的亮红色）的乳酸菌H，经生理生化和16srRNA鉴定为唾液乳杆菌。
2.2 乳酸菌对鲜肉护色效果的研究
2.2.1 感官评定
图 1 不同菌剂处理猪肉72h后的颜色比较
图 2 不同菌剂处理猪肉的感官评定值随时间变化
从图1中可看到，各处理组在25℃下存放1天后，颜色发生了较明显的变化。总体上，添加Arg的菌体组都比未添加Arg的菌体组色泽鲜艳。特别是添加了Arg的H活菌组呈现良好的色泽，其次是添加Arg的灭活菌组，即Ⅶ组和Ⅺ组，其颜色均优于阳性对照组（NaNO2处理组）；另外，单独用Arg处理的猪肉在色泽上也超过了NaNO2处理组的效果。而阴性对照组（无菌蒸馏水处理组）在感官评定上只有2.5分，出现较难接受的状态，颜色灰白，汁液流失量大，总体接受性差。随着存放天数的增加，添加Arg的H活菌组仍能保持较稳定的鲜艳的色泽，说明H活菌+Arg组能合成较多的NO-Mb，并能保持较好的稳定性。
2.2.2 色差测定
表 3 不同菌剂处理猪肉的色差值
存放时间
处理
L值
a值
b值
第一天
Ⅰ（蒸馏水）
58.24cd
1.83 g
9.09 e
Ⅱ（ NaNO2）
55.92 def
4.60 bc
9.85 de
Ⅲ（Arg）
54.19 f
6.32 a
11.86 bcd
Ⅳ（活菌H）
54.26 f
3.88 de
12.01 bcd
Ⅴ（活菌H＋Arg ）
55.11 ef
5.66 a
13.57 ab
Ⅵ（灭活菌H）
57.31 cde
3.14 f
11.89 bcd
Ⅶ（灭活菌H＋Arg）
57.40 cde
4.02 cd
11.24 bcde
Ⅷ（活菌J）
61.64 b
3.30 ef
11.09 cde
Ⅸ（活菌J＋Arg）
59.42 bc
2.82 f
12.05 bcd
Ⅹ（灭活菌J）
58.93 c
2.75 f
12.74 bc
Ⅺ（灭活菌J＋Arg）
65.30 a
5.20 b
15.46 a
第二天
Ⅰ（蒸馏水）
66.08 a
1.65 g
9.63 e
Ⅱ（ NaNO2）
62.87 b
2.76 f
11.25 bc
Ⅲ（Arg）
56.43 d
4.23 b
10.20 de
Ⅳ（活菌H）
60.53 bc
3.64 c
10.72 cd
Ⅴ（活菌H＋Arg ）
52.36 e
4.41 a
12.31 a
Ⅵ（灭活菌H）
62.94 b
3.20 de
10.70 cd
Ⅶ（灭活菌H＋Arg）
59.47 cd
4.07 b
11.27 bc
Ⅷ（活菌J）
62.53 bc
2.90 ef
11.63 b
Ⅸ（活菌J＋Arg）
62.25 bc
2.77 f
11.97 b
Ⅹ（灭活菌J）
62.02 bc
3.58 cd
9.74 e
Ⅺ（灭活菌J＋Arg）
59.45 cd
4.69 a
11.72 b
第三天
Ⅰ（蒸馏水）
68.89 a
0.72 h
13.31 a
Ⅱ（ NaNO2）
62.41 d
2.12 g
11.06 de
Ⅲ（Arg）
60.39 f
3.32 de
11.75 cd
Ⅳ（活菌H）
60.68 f
3.56 cd
11.31 d
Ⅴ（活菌H＋Arg ）
55.10 h
4.41 f
12.99 ab
Ⅵ（灭活菌H）
63.12 c
2.25 g
12.85 ab
Ⅶ（灭活菌H＋Arg）
59.33 g
4.04 ab
12.39 bc
Ⅷ（活菌J）
66.23 b
2.90 f
10.61 ef
Ⅸ（活菌J＋Arg）
63.39 c
2.41 g
13.02 ab
Ⅹ（灭活菌J）
62.47 d
2.97 ef
11.40 d
Ⅺ（灭活菌J＋Arg）
61.51 e
3.93 bc
8.87 f
注：同一列肩标注字母不同者,表示差异显著(P>0.05)
图 3.1 不同菌剂处理猪肉的L值随时间的变化
图 3.2 不同菌剂处理猪肉的a值随时间的变化
图 3.3 不同菌剂处理猪肉的b值随时间的变化
从上图中可看出，各处理组的L值和b值差异不明显。而a值即肉的红度具有较明显的差异。从表3中可以看出，Ⅲ、Ⅴ、Ⅺ组与Ⅰ组对比，其a值分别为6.32 、5.66、5.20和 1.83，差异较显著，证明用H和J菌处理过的肉在颜色保持上具有良好的效果，而Ⅲ与Ⅴ组间差异不明显，说明单独添加Arg也能达到良好的护色效果，可能是由于肉中自然存在的乳酸菌能将Arg提供的NO供体合成稳定的NO-Mb。这与感官评定结果呈现高度的相关性。
JCM1173（J菌）是购自中科院微生物研究所的发酵乳杆菌。Arihara[14]研究发现，发酵乳杆菌JCM1173 能将高铁肌红蛋白（Met-Mb） 转变成亮红色的NO-Mb。发酵乳杆菌JCM1173 是公认安全（GRAS）的菌株，将其广泛应用于肉制品发酵过程中，可以提供风味、颜色并保证产品的安全。故本研究采用具有护色能力的JCM1173菌作比较，但在本研究中发现，H菌处理的鲜肉无论在感官评定还是色差测定上都优于J菌组，同时也优于传统的发色剂NaNO2处理的结果，证实H菌具有潜在的护色发色能力。
2.2.3 紫外可见光谱扫描
图4 不同处理的猪肉提取液400~650nm紫外可见光谱扫描结果
从图4中可以看出，用亚硝酸钠，Arg和各处理液处理过的猪肉，存放数天后，用磷酸缓冲液提取的NO-Mb提取液在400nm~ 600nm紫外可见光谱范围内进行扫描，可发现在540，580nm处均可出现特征吸收峰，与Shahidiv[15]、张坤生（1995）、和XueZhang[10]等文献报道的吸收曲线基本一致，但出现了点峰值偏移现象，可能是由于提取液中含有其他杂蛋白。另外，从该光谱图上可以看出添加1.3×10-4 mol/L Arg的H活菌组其吸光值最高，表明合成的NO-Mb含量最多，可能是由于Arg作为NO供体，在NO合成酶的作用下，可以提供更多的NO基团，从而与猪肉中的Mb结合生成更多稳定的NO-Mb。而灭活菌组的NO-Mb含量稍低，可能是由于微生物代谢产生的NO合成酶在菌体灭活过程受到温度或时间的影响，导致部分酶失活。因此NO合成酶的活性与灭活温度和时间的关系有待于进一步研究，以保证菌体的有效灭活，同时又保证酶系不受到破坏。亚硝酸钠处理组的波长扫描图也呈现相似的吸收峰，可能是因为猪肉中的乳酸菌合成的亚硝酸盐还原酶利用NaNO2合成NO，从而合成NO-Mb，这也就是亚硝酸盐用于肉类发色的原理。而用无菌蒸馏水处理过的阴性对照组，其提取液在400nm~650nm波长范围内，在505nm和630nm处了较明显的吸收峰，这是高铁肌红蛋白的典型吸收峰，说明阴性对照组在存放过程中，由于没有NO生成，从而不能合成NO-Mb，故肌红蛋白逐渐被氧化，生成了高铁肌红蛋白，处理肉的总体接受性也较差。这些与感官评定和色差测定结果呈现相似的趋势。
3 结论
H菌株经生理生化及16srRNA鉴定，证实其为一株唾液乳杆菌。用1×109CFU/mL的H菌和J菌处理过的鲜肉具有良好的护色效果。其中，添加1.3×10-4 mol/L Arg的H活菌组的处理效果最好，感官评定值达到7.5分，色差值为5.66，而紫外可见光谱扫描显示其提取液具有NO-Mb的特征吸收光谱，且含量最高。有望替代NaNO2作为鲜肉发色剂的研究。灭活菌+Arg组也能达到良好的护色效果，但可能是因为灭活温度和时间对微生物酶的影响，故效果不如活菌好，其灭活条件还有待于进一步研究。
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