微生物的分离与纯化技术

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1、实 验 七 微 生 物 的 分 离 与 纯 化 技 术 n土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。n一般土壤中，细菌最多，放线菌及霉菌次之，而酵母菌主要见于果园及菜园土壤中。 n从混杂微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。n平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。n基本原理是选择适合于待分离微生物生长的条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧的要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微

2、生物。 一 、 实 验 目 的 和 内 容目 的 ： 学 习 从 土 壤 中 分 离 微 生 物 的 方 法 ， 学 习 无 菌 操 作 技 术 。内 容 ： 1 培 养 基 的 配 制 及 相 关 物 品 的 灭 菌 ； 2 用 稀 释 法 从 土 壤 中 分 离 微 生 物 ； 用 平 板 划 线 方 法 分 离 微 生 物 二 、 实 验 材 料 和 用 具n 牛 肉 膏 蛋 白 胨 固 体 培 养 基 、 高 氏 1号 固 体 培养 基 ， 土 豆 蔗 糖 固 体 培 养 基 ， 99mL无 菌 水(带 玻 璃 珠 ) ， 9mL无 菌 水 ， 10%酚 液 ， 土壤 样 品n 无 菌

3、 培 养 皿 、 1mL无 菌 移 液 管 、 天 平 、 称量 纸 、 药 勺 、 试 管 架 n 高 压 灭 菌 锅 三 、 操 作 步 骤（ 一 ） 固 体 培 养 基 的 配 制 （ 人 一 组 ）l 称 量 和 溶 解 2 pH 调 节 、 分 装 （ 三 角 瓶 ） 、 包 扎 。3. 灭 菌 (二 ) 土 壤 稀 释 分 离 （ 人 一 组 ）1 取 土 壤 取 表 层 以 下 510cm处 的 土 样 ， 放 入 无 菌 的 袋或 瓶 中 备 用 ， 或 放 在 4 冰 箱 中 暂 存 。 2 制 备 稀 释 液 (要 无 菌 操 作 ) (1)准 备 三 角 瓶 装 99mL

4、水 （ 加 玻 璃 珠 ） ， 1只 ； 试 管 装 4.5mL无 菌 水 ， ； 包 扎 、 灭 菌 角 匙 一 只（ 2） 制 备 土 壤 悬 液 ： 无 菌 角 匙 称 土 样 1g， 迅 速 倒 入 带 玻 璃 珠 的 99mL无菌 水 瓶 中 (玻 璃 珠 用 量 10粒 左 右 )， 振 荡 5 10min，使 土 样 充 分 打 散 ， 即 成 为 10 -2的 土 壤 悬 液 。 u 在 每 根 无 菌 移 液 管 的 报 纸 套 上 做 好 标 记 ， 如 10-3 、 10-4 、 10-5。u 无 菌 移 液 管 用 前 从 中 间 拆 开 报 纸 套 ， 取 出 移 液

5、 管 ， 用 后 再 插 回 报 纸套 ， 保 护 移 液 管 尖 端 。u 每 次 吸 取 土 液 ， 要 将 移 液 管 插 入 液 面 ， 以 口 吹 吸 3次 ， 每 次 吸 上 的 液面 要 高 于 前 一 次 ， 以 减 少 稀 释 中 的 误 差 。u 放 土 液 操 作 时 移 液 管 尖 不 能 接 触 下 一 稀 释 度 液 体 的 液 面 ， 每 一 个 稀释 度 换 用 一 支 移 液 管 。(3)稀 释 ： 用 无 菌 移 液 管 吸 10-2的 土 壤 悬 液 1mL， 放 入 9mL无 菌 水 中 即 为 10-3稀 释 液 ， 如 此 重 复 ， 可 依 次 制

6、 成10-3 10- 的 稀 释 液 。 3.平 板 接 种 培 养 3.1稀 释 倾 注 平 板 法 (混 菌 )u 细 菌 : 取 10-6、 10-7两 管 稀 释 液 各 1mL， 分 别 接 入 相 应 标 号 的 平 皿 ， 每 个 稀释 度 接 两 个 平 皿 。 取 冷 却 至 50 （ 以 不 烫 手 为 宜 ） 的 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 ， 分 别 倒 入 以 上培 养 皿 中 (装 量 以 铺 满 皿 底 为 宜 ， 约 10-15ml)， 迅 速 摇 动 平 皿 ， 使 菌 液与 培 养 基 充 分 混 匀 ， 但 不 沾 湿 皿 的 边 缘 ， 待 琼

7、脂 凝 固 即 成 细 菌 平 板 。 倒 平 板 时 要 注 意 无 菌 操 作 。 u 放 线 菌 取 10-4、 10-5两 管 稀 释 液 各 1mL， 分 别 接 入 相 应 标 号 的 平 皿 ， 每 个 稀 释 度 接两 个 平 皿 。 取 冷 却 至 50 （ 以 不 烫 手 为 宜 ） 的 高 氏 1号 培 养 基 （ 添 加 10%酚 数 滴 ） ，分 别 倒 入 以 上 培 养 皿 中 (装 量 以 铺 满 皿 底 为 宜 ， 约 10-15mL)， 迅 速 摇 动平 皿 ， 使 菌 液 与 培 养 基 充 分 混 匀 ， 但 不 沾 湿 皿 的 边 缘 ， 待 琼 脂

8、凝 固 即 成放 线 菌 平 板 。u 霉 菌 取 10-4、 10-5两 管 稀 释 液 各 1ML， 分 别 接 入 相 应 标 号 的 平 皿 ， 每 个 稀 释 度 接两 个 平 皿 取 冷 却 至 50 （ 以 不 烫 手 为 宜 ） 的 土 豆 蔗 糖 培 养 基 ， 分 别 倒 入 以 上 培 养皿 中 (装 量 以 铺 满 皿 底 为 宜 ， 约 10-15mL)， 迅 速 摇 动 平 皿 ， 使 菌 液 与 培养 基 充 分 混 匀 ， 但 不 沾 湿 皿 的 边 缘 ， 待 琼 脂 凝 固 即 成 霉 菌 平 板 。 n 倒 平 板 的 方 法 ： 右 手 持 盛 培 养

9、基 的 试 管 或 三 角 瓶 置 火 焰旁 边 ， 用 右 手 将 试 管 塞 或 瓶 塞 轻 轻 地 拨 出 ， 试 管 或 瓶 口保 持 对 着 火 焰 ； 然 后 左 手 拿 培 养 皿 并 将 皿 盖 在 火 焰 附 近打 开 一 缝 ， 迅 速 倒 入 培 养 基 约 10mL， 加 盖 后 轻 轻 摇 动培 养 皿 ， 使 培 养 基 均 匀 分 布 在 培 养 皿 底 部 ， 然 后 平 置 于桌 面 上 ， 待 凝 后 即 为 平 板 。 3.2 平 板 划 线 分 离 法 。u 倒 平 板 按 无 菌 操 作 要 求 ， 在 火 焰 旁 操 作 ， 倒 固 体 培 养 基

10、平 板 。u 划 线 分 离 使 用 接 种 环 ， 挑 取 - 土 壤 悬 液 ， 在 平 板 中 划 线 分 离 。 划 线 的 方 法 多 样 ， 目 的 是 获 得 单 个 菌 落 。n 用 接 种 环 以 无 菌 操 作 挑 取 - 土 壤 悬液 ， 先 在 平 板 培 养 基 的 一 边 作 第 一 次 平行 划 线 3 4条 ， 再 转 动 培 养 皿 约 70度 角 ，并 将 接 种 环 上 剩 余 物 烧 掉 ， 待 冷 却 后 通过 第 一 次 划 线 部 分 作 第 二 次 平 行 划 线 ，再 用 同 样 的 方 法 通 过 第 二 次 划 线 部 分 作第 三 次 划

11、 线 。 掌 握 好 力 度 ， 不 要 划 破 培 养 基 。 4 培 养 将 接 种 好 的 平 板 倒 置 ， 即 皿 盖 朝 下 放 置 ， (可 减 少培 养 基 水 分 蒸 发 、 可 减 少 污 染 )，培 养 细 菌 ： 37 ， 恒 温 培 养 箱 中 培 养 1 2d。培 养 放 线 菌 ： 28 ， 恒 温 培 养 箱 中 培 养 3 5d。培 养 霉 菌 ： 28 ， 恒 温 培 养 箱 中 培 养 3 5d。 四 、 结 果观 察 从 土 壤 稀 释 分 离 的 微 生 物 菌 落 F 菌 落 特 征 描 述 菌 落 特 征 包 括 大 小 ， 形 状 ， 隆 起 形

12、 状 ， 边 缘 情 况 ， 表 面 状 态 ， 表面 光 泽 ， 质 地 ， 颜 色 ， 透 明 度 等 。 菌 落 特 征细 菌 菌 落 一 般 呈 现 湿 润 较 光 滑 ， 较 粘 稠 ， 易 挑 起 ， 质 地均 匀 ， 菌 落 正 反 面 及 边 缘 中 心 部 位 颜 色 一 致放 线 菌 干 燥 、 不 透 明 、 表 面 呈 致 密 的 丝 绒 状 ， 上 有 一 层 彩色 “ 干 粉 ” 难 挑 起 ， 菌 落 正 反 面 颜 色 不 一 致霉 菌 菌 落 的 形 态 较 大 ， 质 地 疏 松 ， 外 观 干 燥 ， 不 透 明 ，呈 现 或 松 或 紧 的 蛛 网 状 、 绒 毛 状 、 棉 絮 状 ， 与 培 养基 结 合 紧 密 ， 不 易 挑 起酵 母 菌 较 湿 润 ， 较 透 明 ， 表 面 较 光 滑 ， 容 易 挑 起 ， 菌 落 质地 均 匀 ， 正 反 面 以 及 边 缘 与 中 央 部 位 的 颜 色 一 致 。颜 色 多 为 白 色 ， 少 数 为 红 色 。 粘 质 沙 雷 氏 菌 细 菌 菌 落 青 霉 的 菌 落 n 观 察 结 束 ， 清 洗 培 养 皿 。